Summary
肝损伤都伴随着祖细胞扩张表示异质细胞群。这种蜂窝室的新颖分级允许多个子集的区别。此处所描述的方法示出了流式细胞术分析，并且可用于进一步的测定各种子集的高纯度分离的流动。
Abstract
在慢性肝损伤，祖细胞在称为胆管反应过程中，这也需要炎性细胞浸润和上皮细胞活化的外观扩大。这种炎症反应过程中的祖细胞群体大多被用单表面标志物的调查，无论是组织学分析或通过流式细胞仪为基础的技术。然而，新的表面标志物识别的肝脏祖内的各种不同功能的子集/干细胞室。这里提出的方法描述了分离和详细流式细胞使用新型表面标记组合祖亚群分析。此外，它说明了如何在各种祖细胞亚群可与使用自动磁性高纯度和FACS分选的基础的方法进行分离。重要的是，肝脏的新颖的和简化的酶解允许这些稀有细胞群的具有高可行性的隔离即，相较于其他现有方法优越。这是为进一步研究祖细胞在体外或用于分离高质量的RNA来分析基因表达谱尤其相关。
Introduction
肝再生大多与肝细胞的自我更新的能力相关联。然而，发生与祖细胞活化和扩展，已用其分化成肝细胞和胆管1，2，3，4能力有关的慢性肝损伤。这一点尤其重要，因为，在慢性损伤，肝细胞增殖效果不好。尽管针对祖细胞多基因遗传跟踪研究，他们在肝再生的作用仍然是有争议的5，6，7，8。此外，祖细胞的活化已被链接到在肝脏增加纤维化反应，其损伤9中提出了关于他们的确切作用的问题，10。
祖细胞室的异质性早已被分离出来的使用显微切割或细胞分选基方法1，11表示一个单一的表面标志物前体细胞基因表达研究建议。事实上，最近，一种新的使用表面标志物结合GP38（podoplanin）毫不含糊地挂钩祖细胞的以往单一标记各种子集12。重要的是，这些子集不仅在不同的表面标志物的表达，但伤病期间12还展出了功能改变。
多种动物模型已被用于研究祖细胞的活化和肝再生。似乎各种损伤类型促进不同祖细胞12的子集的激活。这或许可以解释的pH值在人类4观察胆小管反应enotypic分歧。因此，祖细胞的复杂表型和功能分析是枢转，以了解他们在损伤作用和肝脏疾病的导管状反应的真实意义。
除了表面标志的组合，在细胞分离协议的重要区别还基于先前的研究2的结论变得复杂。的研究中的一个显着量寻址祖细胞，在其分离方案有很大的不同（ 例如，肝解离（酶组合和处理的持续时间），密度介质，并且离心速度）的作用2。优化的隔离技术，为罕见的细胞群提供更好的生存能力和反射的子集组成，已开发并于最近公布的12。本文的目的是提供一个更DET这种肝细胞分离过程和所述子集分析ailed协议以允许该技术的适当的再现。此外，该协议包括与以前的分离方法来证明相比，新的协议的差异的比较。
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Protocol
所有的实验程序，是洪堡大学医学中心的伦理和动物护理委员会批准进行的。
1.材料和缓冲液的制备
- 刚准备用无菌组件和层流罩，以避免细菌污染肝脏消化所需的所有缓冲区。
- 通过混合49.5毫升RPMI培养基和0.5mL胎牛血清的制备收集缓冲液（CB）（FBS;低内毒素，热灭活的），以达到1％（体积/体积）溶液。存储直到进一步使用冰的解决方案。
注：约合25 CB毫升是必要的消化一整肝脏。 - 通过使用下面的成分制备消化缓冲液（DB）：RPMI培养基，1％（V / V）FBS（低内毒素，热灭活的），胶原酶P（0.2毫克/毫升），DNA酶I（0.1毫克/毫升）和分散酶（0.8毫克/毫升）。
注：约合25分贝毫升是必要的消化一整肝脏。预暖DB在T使用前，他37℃水浴。 - 重建在Hanks'平衡盐溶液抵达时酶（HBSS;胶原酶P和分散酶），或在DNA酶I缓冲液（50％（体积/体积）甘油，1mM的MgCl 2，和20mM的Tris-HCl; pH7.5）中，分装，然后将其保存在-20℃。存储DNase的I缓冲液在4℃并在两个月内使用它。
2.肝单细胞悬液的制备
- 安乐死颈椎脱位未经处理的野生型小鼠按照当地伦理和动物保健委员会。
- 放置在夹层板的小鼠和湿用70％乙醇的皮毛。用剪刀，打开腹部皮肤的中线切口，随后向四肢的Y切口。打开腹膜最多使用剪刀胸骨。为了揭开肝脏，轻轻置换肠道用棉签右侧。
- 用剪刀和镊子的帮助下，删除该肝叶，离开胆囊后面，避免与结缔组织的污染。权衡肝脏并将其放置在冰上于含有HBSS培养皿。
- 放置在干培养皿肝叶并且通过使用手术刀切肝组织成同质立方体大约2毫米的边。转移片放入15毫升锥形离心管中。
- 添加2.5毫升DB的到15毫升锥形离心管中含有肝片，并将其放置在37℃水浴中，开始消化过程（一个健康的肝脏需要60-70分钟和肝硬化花费80-90分钟）。
注意：如果一个人的整个肝脏被消化，肝应分离成两个15毫升锥形离心管中，以确保良好的细胞生存力。 - 准备一个新的15毫升离心管收集发布的肝细胞。放置在管的顶部的聚酰胺100μm的滤网和润湿与CB的800微升的网格。放置在冰上的锥形离心管中。
- 混合SAM普莱斯在为了通过摇动含有肝片15毫升锥形离心管中，以支持消化过程5和10分钟后的37℃水浴中。
- 在开始消化后15分钟，轻轻地用1000微升吸管切尖，使猪肝片通过轻松的猪肝片混合。放置管放回水浴并允许片沉降2分钟。
- 删除包含弥散性细胞上清液（通常2倍700微升），并把它添加到在步骤2.6制得的管子。更换DB被删除的上清液（2×700μL），并把它放回37℃水浴。
- 重复步骤2.8（通常在30，40，50，55，和60分钟）中描述的过程，直到自消化的开始大约60-70分钟已经过去。从40分钟以后，剩余的肝片应该足够小，以通过未切割1,000微升枪头。
注意：健康的肝脏是DIGE60-70分钟内完全STED，而肝纤维化通常需要80-90分钟。由这个时间点，肝组织不应在含有肝片圆锥形15mL的离心管中是可见的，和所有释放的细胞应被转移到在步骤2.6制得的管子。 - 在消化过程结束时，收集细胞并离心它们在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 重悬细胞沉淀于1mL氯化铵 - 钾（ACK）裂解缓冲液并以裂解红血细胞孵育它在室温下1分钟。加入5毫升的CB使反应停止，然后离心细胞，在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。悬浮细胞在4mL的CB，并将它们存储在冰上。计数细胞，如在步骤3中描述。
注：将细胞沉淀松散，并因此将上清液吸走，而不是被倾析。3.细胞计数的测定采用流式细胞仪
注意：为了确定细胞计数，一个自动细胞计数器或理想情况下，下面描述的流式细胞仪为基础的细胞量化建议代替古典纽鲍尔基于室法。在步骤2中描述的肝的单细胞悬浮液含有实质和非实质细胞（NPC）以大大不同尺寸和粒度。细胞碎片的适当排除与门上的前向散射，侧散射（FSC-SSC）使用流式细胞术时的NPC特性一起确保了所述协议12的成功。
- 制备肝细胞悬浮液（20μL）的等分试样，并添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）和碘化丙啶的6微升174微升（PI;终浓度0.375微克/毫升）。加算珠，其允许细胞的定量。
- 门在SSC-A-FSC-A以避免碎片和进一步排除使用FSC-H和FCS-A双峰。
注：按照图2中所示的门控策略是重要的。 - 门出PI阳性死细胞，从您的样品检测30微升，并记录事件。按照制造商的指导来计算细胞计数。
注：按照流程步骤4流式细胞仪测量，步骤5和6的基于磁祖细胞隔离和流式细胞仪排序祖细胞亚群的步骤7。
4.染色祖子集的FOW仪分析肝单细胞悬液的
抗体 克隆 主机/同型 股票浓度[毫克/毫升] 稀释 CD64 X54-5 / 7.1 小鼠IgG1，κ 0.5 1：100 CD16 / 32 93 大鼠IgG2a，λ 0.5 1：100 CD45 30-F11 鼠的IgG2b，κ 0.2 1：200 CD31 MEC13.3 大鼠IgG2a，κ 0.5 1：200 ASGPR1 多克隆山羊IgG 0.2 1：100 Podoplanin 2001年1月8日 叙利亚仓鼠IgG抗体 0.2 1：1,400 Podoplanin 2001年1月8日 叙利亚仓鼠IgG抗体 0.5 1：1,400 CD133 Mb9-3G8 大鼠IgG1 0.03 3μL CD133 315-2C11 大鼠IgG2A，λ 0.5 1：100 CD34 RAM34 大鼠IgG2a，κ 0.5 1：100 CD90.2 53-2,1 鼠的IgG2，κ 0.5 1：800 CD157 BP-3 小鼠IgG2b，κ 0.2 1：600 EpCAM的 G8.8 大鼠IgG2a，κ 0.2 1：100 SCA-1 D7 大鼠IgG2a，κ 0.03 10μL 小鼠IgG2b，κ MPC-11 0.2 大鼠IgG1 RTK2071 0.2 鼠的IgG2b，κ RTK4530 0.2 大鼠IgG2a，κ RTK2758 0.5 大鼠IgG2a，κ RTK2758 0.2 叙利亚仓鼠IgG抗体 SHG-1 0.2 叙利亚仓鼠IgG抗体 SHG-1 0.5 正常山羊IgG对照 多克隆山羊IgG 1 驴抗山羊IgG 驴的IgG 2 1：800 链霉 1 1：400 表格1。
抗体 1 2 3 4 五 CD45 APC / Cy7的 鼠的IgG2b，κ
0.5μL+ + + + CD31生物素 + 大鼠IgG2a，κ
0.5μL+ + + ASGPR1纯化 + + 正常山羊IgG对照
0.2μL+ + Podoplanin APC + + + 叙利亚仓鼠IgG抗体
一个1:14的稀释1μL+ CD133 PE + + </ TD> + + 大鼠IgG1
0.45微升驴抗山羊
的Alexa Fluor 488+ + + + + 链霉
的Alexa Fluor 405+ + + + + 表2中。
- 如步骤3中所述放置细胞悬浮液的等分试样从步骤2.11到含有2.5×10 5个细胞，确定的反应管（1.5毫升）。
- 离心将细胞在300 xg离心3分钟，并使用微量离心4℃。
注意：在这一点上，真空泵可用于小心地取出上清。 - 重悬在Fc的块组合细胞沉淀孵育它在冰上5分钟。以每污点50μL的总体积制备的Fc-块组合。加10微升的FcR阻断试剂，纯化的抗CD64的1微升（1：100; 0.5微克/染色），和染色缓冲液40微升（ST缓冲液：HBSS，1％（V / V）FBS，和0.01％叠氮化钠）每污点。
注：叠氮化钠是剧毒。使用适当的个人防护装备，如丁腈手套，实验室外套，和口罩。 - 添加染色组合对细胞的50微升（细胞的总体积现在为100微升）并孵育与抗体混合的细胞中，避光，并在冰上20分钟。
- 以每染色50微升的总体积制备抗体混合物。 50 STμL的缓冲，增加对基本染色的共轭抗体：CD45（0.5微升1：200; 0.1微克/染色），CD31（0.5微升1：200; 0.25微克/染色），ASGPR1（1μL 1：100; 0.2微克/染色），podoplanin（1微升一个1:14稀释; 1：1,400端稀释; 0.014微克/染色），和CD133（3微升; 0.09微克/染色）。
注： 表1总结了抗体克隆和用于基本污渍和用于各种子集的附加表面标记使用稀释液。制备额外的细胞悬浮液为含有相应同种型对照和/或荧光减去一个对照（FMOs）的抗体组合，如表2所示。 - 添加400μL的ST缓冲器向每个样品并离心细胞4分钟，在300 XG和4°C.Discard上清液和重悬细胞于100微升含有0.125微升驴抗山羊IgG（1次级抗体混合物的：在100μLST缓冲的0.25微克/染色）; 400：800 0.25微克/染色）和荧光标记的链亲和素（1 0.25微升。
- 孵育细胞，同时从光并与抗体混合，在冰上20分钟的保护。 400的ST微升缓冲添加到每个样品并离心细胞在300 xg离心4分钟和4℃。弃上清，悬浮细胞在ST的buff 300微升器含有0.25微克/毫升的PI。
注：祖细胞的细胞生存力的时间减少;因此，建议以尽快测量新鲜样品。
祖细胞5.基于磁微珠富集
- 如在步骤3中描述，进入一个新的15毫升锥形离心管转移含1.5-2×10 6个细胞的基础上，确定了细胞计数肝脏的单细胞悬浮液的等分试样。
- 离心细胞，在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
注意：通常，一个健康的C57B1 / 6老鼠肝（或1μg肝组织）将需要被分成三个15毫升锥形离心管中。 - 将细胞重悬于400微升HBSS 0.5％（体积/体积）牛血清白蛋白（BSA），加入抗CD31微珠40微升和抗CD45微珠30微升。孵育15分钟，将细胞在4℃。
注意：不要超过Ť他的温育时间，作为分离的纯度将显著减少。 - 加入5毫升的HBSS 0.5％（V / V）的BSA的细胞，并离心它们在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 重悬细胞沉淀在100微升的死细胞去除珠并在室温下孵育他们15分钟。在此同时，准备一个LS分离柱，并用3毫升的HBSS 0.5％（V / V）的BSA校准。
注意：不要超过培养时间，作为分离的纯度将显著减少。 - 添加900微升HBSS 0.5％（V / V）的BSA的细胞，使用100μm的聚酰胺滤网过滤它们，并加载它们的LS分离柱。
注意：加载一个完整的肝到一个LS分离柱。 - 用3mL的HBSS 0.5％（V / V）的BSA洗柱三次，并收集流通。
- 离心流过在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少附属品leration / 4和减速/ 2）。
- 悬浮无论是在漂洗缓冲液（RB）（PBS和2mM乙二胺四乙酸（EDTA））含有0.5％（体积/体积）BSA或ST缓冲器，取决于进一步的实验过程中的细胞沉淀。
祖细胞亚群为基础的微珠6.磁性自动细胞分离纯化多合并肝脏
注：由于祖细胞亚群的代表罕见的细胞群，从多个肝细胞相结合通常需要达到足够的细胞数量进行进一步的实验。作为一个例子，CD133 +和GP38 +细胞分离进行说明。
- CD133 +祖细胞的分离
- 步骤5.9之后，计数细胞，如在步骤3中描述，并在100微升的RB的悬浮高达10 6个细胞（典型地汇集4-6健康肝脏样本）。
- 添加抗CD64 1：100和抗CD16 / 32 1：100至细胞和incub吃，冰浴5分钟。添加1：100的抗CD133的生物素化抗体的细胞，并孵育他们在冰上另外10分钟。
- 加入5毫升的RB的离心8分钟，在180 XG和4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 悬浮细胞在400微升RB和添加抗生物素微球10微升。孵育所述样品在4℃下15分钟。不超过孵育时间，因为这降低了样品的纯度。
- 加入5毫升的RB的离心8分钟，在180 XG和4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。悬浮颗粒在1毫升RB的。
- 的GP38 +祖细胞隔离
- 步骤5.9之后，计数细胞，如在步骤3中描述，并在100微升的RB的悬浮高达10 6个细胞（典型地汇集4-6健康肝脏样本）。
- 添加抗CD64 1：100和抗CD16 / 32 1：100到细胞中，并孵育他们在冰上5分钟。接下来，添加1：100抗GP38生物素化的抗体与细胞孵育他们在冰上另外10分钟。
- 加入5毫升的RB的离心8分钟，在180 XG和4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 悬浮细胞在400微升RB，并添加5μL抗生物素微球。孵育所述样品在4℃下15分钟。不超过孵育时间，因为这降低了样品的纯度。
- 加入5毫升的RB的离心8分钟，在180 XG和4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 重悬细胞沉淀在1毫升RB的。
- 步6.1或6.2后共同步骤
- 放置装有用另外两个空管上的寒意5机架的磁性标记的细胞悬浮液，收集的正和负部分15毫升锥形离心管中。放置分离器的分离平台上的冷硬机架上。
- 使用正选择程序（Possel_d2），每个样品（清洗选项）之间广泛的清洗步骤。
注意：使用细胞而不是自动隔板的基于列的手工分离会降低样品的纯度。 - 收集阳性馏分和离心机在180 xg离心8分钟，4℃（使用减少加速度/ 4和减速/ 2）。
- 悬浮无论是在RB或ST缓冲器细胞沉淀，这取决于进一步的实验过程。
- 要纯度检查，取细胞的等分试样并如在步骤4中描述的染色它们。
7.流式细胞仪细胞分选
注：纯度排序高任何祖细胞子集可以与下面描述的协议来实现。细胞的总产率比在步骤6中描述，是最好的用于基因表达分析要低得多。
参数 设置 喷嘴尺寸 85微米 频率 46.00 - 46.20 振幅 38.30 - 55.20 相 0 截止延时 28.68 - 28.84 衰减 离 首次下降 284 - 297 目标差距 9.-14 压力 45磅 表3。
- 获得的细胞从基于磁性富集（在步骤5中描述的）;算来，第3步中描述的;和染色它们祖标记（CD133，GP38），CD31，ASGPR1和CD45，如在步骤4中说明。
- 制备排序介质（SM）：无酚红Dulbec共改良伊格尔培养基（DMEM）含有0.5％（V / V）BSA和0.01％（体积/体积）叠氮化钠。重悬染色的细胞中的SM，将它们转移到聚丙烯圆底管中，并放置在冰上。
注：叠氮化钠是剧毒。使用适当的个人防护装备，如丁腈手套，实验室外套，和口罩。不使用叠氮化钠，如果分选的细胞被用于功能测定法。 - 使用适当的软件为用于细胞分离分拣机的类型。打开软件，并按照制造商的说明设置排序参数，整机规格。
注意：机规格总结于表3中 。而机器的规格可以是在不同的机构不同，需要注意的是排序压力的降低和更大的喷嘴尺寸是必要的是重要的（45磅和85微米的喷嘴），以增加祖细胞populat的活力离子和从分选的细胞中制备的RNA的质量。以使用富集肝祖细胞用于设置补偿是很重要的。其他肝或白细胞群在基质人口的次优解决，并在虚假的门控策略不同的自体荧光和结果。 - 校准机器并放置含SM 350μL在排序收集装置5毫升聚丙烯圆底管。开始样品采集和排序。收集亚群的1,000个事件和停止样品流。
- 取管出来的分拣装置的，测量的流量的分选的细胞仪。确定活细胞中存在的分选的细胞群的百分比。这个百分比给出了分选的细胞的纯度。
- 如果排序纯度超过95％时，将含有RLT裂解缓冲液的350微升中的排序收集装置5毫升聚丙烯圆底试管中。
- 启动排序和收集7,000-每间质细胞亚群10,000个事件。
- 传送包含在一个DNase-和无RNase反应管内的分选的细胞的RLT裂解缓冲液，并存储将样品在-80℃直至进一步分析。
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Representative Results
这里介绍的肝脏在含有实质和非实质肝细胞（ 图1和图2a）的单细胞悬浮液使用的酶的结果的新的混合物中的消化过程。红血细胞的所述ACK-裂解后，直接流式细胞仪的单细胞悬浮液的分析是可能的（ 图1和2）。门控战略涉及的双峰和死细胞（ 图2a）排除在外。是阴性CD45，CD31，和ASGPR1细胞被门控。这个群体包括肝祖细胞，并且可以根据它们的GP38和CD133的表达（ 图2a）进行分组。该GP38 + CD133 +和GP38 - CD133 +细胞CD45代表中最丰富的细胞群-在健康成年小鼠细胞LIV - CD31 - ASGPR1器（ 图2a，b） 中 。这些亚群的预先用祖细胞，如EpCAM的，的Sca-1，和CD34（ 图2c）相关联的额外的表面标志物的表达不同。
祖细胞可以从造血细胞和实质细胞，如肝细胞和肝窦内皮细胞（LSECs）（ 图1和3），和祖细胞可以是具有基于磁性微珠隔离进一步纯化（ 图3a，b）或与被耗尽高纯度的分离（ 图1和4）。在90％以上的纯度的CD133 +或GP38 +细胞的结果的基于磁微珠隔离（ 图3a，b）点的任何污染性的CD45，CD31，或ASGPR1 +细胞，将细胞保持高度可行的（ 图3a，b）中 。
2的存活率差异。这是用于组织离解利用酶混合物的选择尤其重要。这里，被用于肝脏1，2，8胶原酶P代替胶原酶ð。重要的是，CD133在祖细胞的表达水平和分离细胞群体的产量在胶原酶D的存在下，大大降低（ 图5a，b）中 。除了这一点，我们的混合物含有分散酶，这是非常适合于温和解聚和各种细胞类型13的传代培养。胶原酶P再加中性蛋白酶代表对肝脏祖细胞分析的细胞解离的理想组合。这种组合也优于胰蛋白酶或肝脏的基于链霉蛋白酶消化（未示出数据）。要注意的是密度离心，如基于珀富集2,14同样重要，对祖分析在这个协议中提出的是没有必要的。
图1：描述的协议的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：肝脏祖子集的新分类。单细胞悬浮液从健康肝脏制备并随后用表面标记的一个面板染色：CD45，CD31，CD133和GP38（A）中。对于死细胞排斥，碘化丙啶（PI）的资金。与门控策略代表散点图描绘。用流式细胞仪细胞计数测定门也标记。 （B）的百分比和本每克在野生型未经处理的动物中的CD45阴性细胞中的各种基质细胞亚群的肝组织的细胞的绝对数量被示出。 （C）的直方图显示在一个健康的肝基质细胞亚群的区别标记特性。 CD90.2的高表达与CD157的存在是特异的，而CD34特异于亚群B.的Sca-1是存在于B，C，D和EPCAM仅在人口C和D平均值±SEM本;数据（AC）代表与2-3 个独立的实验= 3-4每个实验。数据WERe。使用非配对，双尾T检验* P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0001相比。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：基于磁微珠富集和自动化细胞纯化。 CD45（ 一 ）基于磁微珠富集- ，CD31 -和ASGPR1 -细胞前富集描述。自动化基于微珠细胞隔离的（B）的代表性的点图被描绘为CD133 +和GP38 +细胞，在左侧。在右，前，富集后的细胞群体的生存能力表示为百分比碘化丙啶（PI）阴性细胞。平均值±SEM;数据（AB）表示，其中n = 3每个实验3次独立实验。该数据用一个未配对的，双尾T检验，* P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0001比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：流式细胞仪排序高纯度祖子集。点图描绘了排序样品（排序后）的细胞群的纯度。数据代表3次独立实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图5：消化酶的比较。使用胶原酶磷含量制备的单细胞悬液或胶原酶D（如在步骤2中描述）（1毫克/毫升+ DNase的我0.1毫克/毫升）从健康肝脏和随后用表面标记的面板染色：CD45， CD31，CD133，和GP38（A）。本每克在野生型未经处理的动物中的CD45阴性细胞中的各种基质细胞亚群的肝组织的细胞的百分数示出。 （B）的CD133的中值荧光强度被描绘为CD133 +细胞群。平均值±SEM;数据（AB）表示，其中n = 3每实验2次独立实验。该数据用一个未配对的，双尾T检验，* P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0001比较。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
肝脏炎症和不同来源的损伤触发在于伴随着祖细胞扩增和活化2,3肝再生过程。这些肝祖细胞具有干细胞的特性，并可能发挥各种肝病的病理机制一个显著的作用。
肝祖细胞的异质性早已被建议。使用CD133和GP38的新型表面标记组合可以识别携带不同表面标志的子集，并表示肝损伤12中唯一的一组炎症相关基因的肝脏祖细胞亚群的重新评估。这里所描述的方法允许直接流式细胞稀有细胞的分析和它们在各种肝损伤模型直接比较。这是特别相关的，因为不同的损伤触发多个祖S的激活ubsets可能是反射在胆管反应3,4，11，12中观察到的细胞异质性的。值得注意的是，鼠肝组织（0.2克）的一小部分就足以隔离足够细胞仪使用所描述的方法的祖细胞的分析的流动。
流式细胞分选提供子集的高纯度的人群有必要探讨其独特的基因表达图谱。以前的报告描述的流式细胞术为基础的祖细胞分离15，16。然而，这里提出的协议规定，确保这些细胞的高纯度和生存能力的优化方法。值得注意的是，先前描述的体外培养和扩展技术可以很好地与这里介绍15协议相结合
许多类型的流式细胞术分选机的可在各种机构，和其特定的仪器仪表可能会略有不同。然而，对于细胞分选的一般原则中所描述的协议呈现。通常，较低的压力和更大的喷嘴尺寸是绝对必要的，独立于机器的种类和规格的。此外，适当的分选介质的利用率可以显著提高的生存能力和分选的细胞的RNA的质量，这是一个重要的因素，特别是用于基因表达研究。祖细胞的分选，但是，大大降低细胞生存力，以及细胞分选后的产率相对较低（为高纯度的排序7-10,000事件/亚群，4-5健康肝脏需要被汇集）。这可能是进一步在体外分析中的限制因素。我们建议在基于磁微珠隔离体外测定法，由于其较高的产率和细胞活力，和流式细胞术分选进行的基因表达分析，特别是当多个指定的子集的分析和需要隔离。
基于该事实，即细胞的活力流式细胞仪分选后大大降低，祖细胞的自动磁基于微珠隔离已经开发和这里提出。它允许祖细胞具有高纯度（组合多个肝脏）的更大数目的分离。此外，细胞的生存力被保持，因为所需的分离过程的时间被大大降低。而祖细胞的数量降低，可以在体外 1，2，15，16扩大时，建议考虑如何这些体外操作可以改变干/ Progen公司的细胞功能描述了用于其他间充质和基质细胞群17,18 itor细胞。
所提出的基于磁微珠隔离的主要限制是CD133 +和GP38 +细胞群代表异质细胞。附加的表面标记物可能是必要的，以确定较小的细胞群。
肝干细胞和祖细胞是如何相互关联的认识还远远没有完成，尽管里德萝拉和其他1，8，19出色的研究。因此，导致更高的产量和活力，如一个在这里建议的技术中，仔细考虑可以有助于延长祖子集的分析和其相互连接的关系的理解。
总体而言，我们所描述吨他详细隔离和肝祖亚最近被区分12分析。此外，通过采用一种新颖的酶组合，稀有祖细胞可以通过直接流式细胞测量分析。此外，该协议演示如何丰富祖细胞具有高纯度，即使用细胞分选或自动基于微珠的技术。
故障排除：
细胞碎片和死的细胞的百分数都是高
如果，消化（步骤2）期间，肝脏样品的移液过于苛刻，在单细胞悬浮液增加死亡细胞的百分比。如果肝脏切成大块比所建议的，消化效率较低和制备过程中导致更多的细胞死亡。
在完成步骤5的过程后，将样品的纯度不充分
如果percen在步骤2中制备的细胞碎片的每日新闻和濒死细胞中的单细胞悬液是太高，微珠结合非特异性的，因此，隔离的纯度大大降低。
基于微珠纯化后低的细胞数
对于所描述的协议的成功，这是很重要的细胞对微珠的比率是最佳的，如在协议建议。利用更多的微珠减少了纯度，降低了分离的细胞的产率和存活率。如果高于该协议提出的其他表面标记用于祖子隔离，细胞对微珠的最佳比例必须确定。
GP38 + CD133磁微珠基于隔离-人口
按照第5步在步骤5.3添加额外10μL抗CD133 +微珠，然后按照步骤5，6.2和6.3的描述ð。
计算绝对细胞数
肝脏重量被用来计算一个特定子集的许多细胞是如何每克肝组织存在。
（（基于流式细胞术在活细胞的亚群的比例）/ 100）×从肝片= Z分离的总活细胞数
（1 /重肝片）×Z =细胞数/ g的肝组织
其它的细胞群，可以用这种方法来分离
它是可以分离使用该消化协议以下的肝细胞：LSECs CD45 +细胞（或造血细胞的亚群， 例如枯否细胞，树突细胞，T细胞，NK细胞等 ）和。消化协议不适合于肝细胞或肝星状细胞的分离。这些细胞存在于相对低的细胞数量和它们显示降低存活率相比水净化- [R可用的方法。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由亚历山大·冯·洪堡基金会Sofja Kovalevskaja奖VLK支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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