Summary
Leverskador åtföljs av stamcellsexpansion som representerar en heterogen cellpopulation. Nya klassificeringen av denna cellulära fack möjliggör särskiljande av flera undergrupper. Den metod som beskrivs här illustrerar den flödescytometrianalys och hög renhet isolering av olika underuppsättningar som kan användas för ytterligare analyser.
Abstract
Under kroniska leverskador, progenitorceller expandera i en process som kallas duktulära reaktion, vilket också innebär uppkomsten av inflammatoriska cellulärt infiltrat och epitelceller aktivering. Stamfader cellpopulationen under sådana inflammatoriska reaktioner har mestadels undersökts med hjälp av enkla ytmarkörer, antingen genom histologisk analys eller genom flödescytometri-baserade tekniker. Men nya ytmarkörer identifierat olika funktionellt distinkta undergrupper inom leverstamfader / stamceller. Den metod som presenteras här beskriver isoleringen och detaljerade flödescytometrianalys av ursprungsgrupper som använder nya ytmarkör kombinationer. Dessutom visar den hur de olika progenitor cellundergrupper kan isoleras med hög renhet med användning av automatiserad magnetiska och FACS sortering-baserade metoder. Viktigare, nya och förenklad enzymatisk dissociering av levern möjliggör för isolering av dessa sällsynta cellpopulationer med en hög viabilitetsom är överlägsen i jämförelse med andra existerande metoder. Detta är särskilt relevant för ytterligare studera stamceller in vitro eller för att isolera hög kvalitet RNA för att analysera genuttryck profil.
Introduction
Leverregenerering är oftast förknippad med självförnyelse kapacitet av hepatocyter. Icke desto mindre, kroniska leverskador inträffar med progenitor-cellaktivering och expansion, vilket har satts i samband med deras förmåga att differentiera till hepatocyter och cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Detta är särskilt relevant, eftersom under kroniska skador, är inte effektiv hepatocytproliferation. Trots flera genetiska spårning studier inriktade på progenitorceller, är fortfarande kontroversiell 5, 6, 7, 8 deras roll i leverregenerering. Dessutom har aktiveringen av progenitorceller kopplats till ökad fibrotisk reaktion i levern, vilket väcker frågor om deras exakta roll under skador 9, 10.
Den heterogena karaktären av stamcellstransplantation facket har länge föreslagits av genuttryck studier som isolerade stamceller som uttrycker en enda yta markör med hjälp av microdissection eller cellsortering-baserade metoder 1, 11. I själva verket nyligen en ny yta markör kombination med användning av gp38 (podoplanin) entydigt länkade tidigare enstaka markörer för stamceller till olika delmängder 12. Viktigt är dessa delmängder inte bara skilde i sin yta markör uttryck, men också uppvisade funktionella förändringar under skador 12.
Flera djurmodeller har använts för att undersöka progenitor-cellaktivering och leverregenerering. Det verkar som om de olika typerna skade främjar aktiveringen av olika delmängder av progenitorceller 12. Detta kan förklara den phenotypic divergens av duktulära reaktion observerats hos människa 4. Således, de komplexa fenotypiska och funktionella analyser av stamceller är avgörande för att förstå deras roll i skador och den sanna betydelsen av duktulära reaktion i leversjukdomar.
Förutom ytmarkör kombinationer, de avgörande skillnaderna i cellisoleringsprotokoll ytterligare komplicera de slutsatser baserade på tidigare studier 2. En betydande del av studier adresserade roll progenitorceller som kraftigt skiljer sig åt i sin isolering protokoll (t.ex. lever dissociation (enzym kombination och varaktighet av processen), densitet medium och centrifugeringsvarvtal) 2. En optimerad isoleringsteknik, vilket ger bättre lönsamhet för sällsynta cellpopulationer och reflekterande av delmängd sammansättning, har utvecklats och publicerats nyligen 12. Syftet med denna artikel är att ge en mer Detailed protokollet av detta levercellisoleringsförfarande och delmängdsanalys för att möjliggöra för en korrekt reproduktion av den teknik. Dessutom innehåller protokollet en jämförelse med föregående isolering metod för att påvisa skillnader jämfört med det nya protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utfördes med godkännande av etik och djurvårds kommittéer Homburg University Medical Center.
1. Framställning av material och buffertar
- Färskt förbereda alla buffertar som krävs för lever matsmältning med sterila komponenter och ett laminärt huva för att undvika bakteriell kontamination.
- Förbereda uppsamlingsbuffert (CB) genom att blanda 49,5 ml RPMI-medium och 0,5 ml fetalt bovint serum (FBS; låg endotoxin, värmeinaktiverat) för att uppnå en 1% (volym / volym) lösning. Förvara lösningen på is tills vidare användning.
OBS: Cirka 25 ml CB är nödvändig för att smälta en hel lever. - Förbered digereringsbuffert (DB) genom användning av följande ingredienser: RPMI-medium, 1% (v / v) FBS (lågt endotoxin, värmeinaktiverad), kollagenas P (0,2 mg / ml), DNas-I (0,1 mg / ml) och dispas (0,8 mg / ml).
OBS: Cirka 25 ml DB är nödvändigt för att smälta en hel lever. Pre-värma DB ithan 37 ° C vattenbad före användning. - Rekonstituera enzymerna vid ankomst i Hanks balanserade saltlösning (HBSS; collagense P och dispas) eller i DNas-I-buffert (50% (volym / volym) glycerol, 1 mM MgCl2, och 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) lika stora den och förvara den vid -20 ° C. Förvara DNas-I-buffert vid 4 ° C och använd inom två månader.
2. Beredning av lever encelliga suspension
- Avliva obehandlade vildtyp möss genom cervikal luxation i enlighet med de lokala etiska och djurvårds utskott.
- Placera möss på en dissekering ombord och väta pälsen med 70% etanol. Med användning av sax, öppna buken med ett mittlinjesnitt i huden, följt av ett Y-snitt mot extremiteterna. Öppna bukhinnan upp till bröstbenet med hjälp av en sax. För att avslöja levern, förskjuta tarmen försiktigt till den högra sidan med hjälp av en bomullspinne.
- Med hjälp av sax och pincett, ta bort leverlober,lämnar gallblåsan bakom, och undvika kontaminering med bindväv. Väg levern och placera den på is i en petriskål med HBSS.
- Placera lever lober på en torr petriskål och skära levervävnad i homogena kuber ca 2 mm en sida med hjälp av en skalpell. Överför bitarna i en 15 ml koniskt centrifugrör.
- Tillsätt 2,5 ml av DB till 15 ml koniska centrifugrör innehållande lever bitar och lägg den i en 37 ° C vattenbad för att starta rötningsprocessen (en frisk lever tar 60-70 minuter och en cirrotisk lever tar 80-90 minuter ).
OBS: Om en hel lever är som rötas, bör levern separeras i två 15-ml koniska centrifugrör för att säkerställa god cellviabilitet. - Förbered en ny 15 ml koniska centrifugrör att samla släpptes leverceller. Placera en polyamid 100-pm filter mesh på toppen av röret och väta mesh med 800 mikroliter av CB. Placera koniskt centrifugrör på is.
- Blanda samperna i 37 ° C vattenbad efter 5 och 10 min i syfte att stödja rötningsprocessen genom skakning av 15-ml koniskt centrifugrör innehållande leverstyckena.
- 15 min efter start av matsmältningen, blanda försiktigt leverstyckena med användning av en 1000-mikroliter pipett med ett snitt spets som gör det möjligt för leverstyckena att passera igenom lätt. Placera rören tillbaka i vattenbadet och låt bitarna sedimentera under 2 min.
- Avlägsna supernatanten innehållande de sprids celler (typiskt 2 x 700 mikroliter) och lägga till den i röret som framställts i steg 2,6. Byt den avlägsnade supernatanten med DB (2 x 700 mikroliter) och placera det tillbaka till 37 ° C vattenbad.
- Upprepa proceduren beskriven i steg 2,8 (typiskt vid 30, 40, 50, 55 och 60 min) tills ungefär 60-70 minuter har gått sedan början av matsmältningen. Från 40 minuter och framåt, bör de återstående leverstyckena vara tillräckligt små för att passera genom en oklippt 1000-mikroliter pipettspetsen.
OBS: frisk lever är Digested helt inom 60-70 minuter, medan fibrotisk lever behöver vanligtvis 80-90 minuter. Genom denna tidpunkt, bör levervävnaden inte vara synlig i den koniska 15-ml centrifugrör innehållande leverstyckena och alla frisatta cellerna bör överföras in i röret som framställts i steg 2,6. - Vid slutet av kokningsprocessen, samla upp cellerna och centrifugera dem under 8 min vid 180 xg och 4 ° C (med användning av reducerat acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml av ammonium-klorid-kalium (ACK) lysbuffert och inkubera det under 1 min vid rumstemperatur för att lysera de röda blodkropparna. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 5 ml av CB, och sedan centrifugera cellerna under 8 min vid 180 xg och 4 ° C (med användning av reducerat acceleration / 4 och retardation / 2). Resuspendera cellerna i 4 ml CB och lagra dem på is. Räkna celler, såsom beskrivs i steg 3.
OBS: Cellpelleten är lös, och därför supernatanten pipetteras bort i stället för att dekanteras.3. Bestämning av cellantalet med användning av flödescytometri
NOTERA: För att bestämma cellräkningar, en automatiserad cellräknare eller, idealt, är flödescytometri-baserad cell kvantifiering beskrivs nedan föreslagits i stället för den klassiska Neubauer kammar-baserad metod. Levern encelliga fjädring beskrivs i steg 2 innehåller parenkymala och icke-parenkymala celler (NPC) med vitt skilda storlekar och granularities. Den korrekta uteslutning av cellrester tillsammans med grindnings-on framåtspridning, sidospridning (FSC-SSC) karakteristisk för NPC vid användning av flödescytometri säkerställer framgången för den beskrivna protokollet 12.
- Förbereda en alikvot av levern cellsuspensionen (20 ^ il) och tillsätt 174 | il av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och 6 | il av propidium jod (PI; slutkoncentration 0,375 | ig / ml). Lägg räkna pärlor som möjliggör kvantifiering av cellerna.
- Gate på SSC-A-FSC-A för att undvika skräp och ytterligare utesluta dubbletter med hjälp av FSC-H och FCS-A.
OBS: Det är viktigt att följa grind strategi som visas i figur 2. - Gate ut PI-positiva döda celler, mäta 30 mikroliter från dina prover, och spela in händelserna. Följ tillverkarens riktlinjer för att beräkna cellräkning.
OBS: Följ steg 4 för flödescytometri mätning, steg 5 och 6 för magnetisk baserad stamceller isolering och steg 7 för flödescytometri slags stamceller subpopulationer.
4. Färgning av levern encelliga suspension för Fow Cytometry analys av ursprungs delmängder
Antikropp Klona Värd / isotyp Stock Koncentration [mg / ml] Utspädning CD64 X54-5 / 7,1 Mouse IgG1, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Rått-IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 Rått-IgG2b, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rått-IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 Polyklonalt get-IgG 0,2 1: 100 Podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0,2 1: 1400 Podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0,5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 råtta lgG1 0,03 3 mikroliter CD133 315-2C11 rått-IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Rått-IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rått-IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 Mus IgG2b, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Rått-IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Rått-IgG2a, κ 0,03 10 mikroliter Mus IgG2b, κ MPC-11 0,2 råtta lgG1 RTK2071 0,2 Rått-IgG2b, κ RTK4530 0,2 Rått-IgG2a, κ RTK2758 0,5 Rått-IgG2a, κ RTK2758 0,2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0,2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0,5 Normal get IgG-kontroll Polyklonalt get-IgG 1 Åsna anti-get-IgG åsna-IgG 2 1: 800 streptavidin 1 1: 400 Bord 1.
Antikropp 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Rått-IgG2b, κ
0,5 | il+ + + + CD31 Biotin + Rått-IgG2a, κ
0,5 | il+ + + ASGPR1 renades + + Normal get IgG-kontroll
0,2 | il+ + Podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
1 mikroliter av en 1:14 spädning+ CD133 PE + + </ Td> + + råtta lgG1
0,45 mikroliterÅsna anti-get
Alexa Fluor 488+ + + + + streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tabell 2.
- Placeras en alikvot av cellsuspensionen från steg 2,11 in i ett reaktionsrör (1,5 ml) innehållande 2,5 x 10 5 celler, bestämda såsom beskrivs i steg 3.
- Centrifugera cellerna under 3 min vid 300 xg och 4 ° C med användning av en mikrocentrifug.
OBS: Vid denna punkt, kan en vakuumpump användas för att noggrant avlägsna supernatanten. - Resuspendera cellpelleten i Fc-blocket blandning och inkubera den för 5 minuter på is. Framställa Fc-blocket blandning med en total volym av 50 mikroliter per fläck. Tillsätt 10 mikroliter av FcR-blockeringsreagens, 1 mikroliter av renat anti-CD64 (1: 100; 0,5 ^ g / fläck) och 40 mikroliter av färgningsbuffert (ST-buffert: HBSS, 1% (volym / volym) FBS och 0,01% natriumazid) per fläck.
OBS: Natriumazid är mycket giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning, såsom nitril, laboratorierock och en ansiktsmask. - Tillsätt 50 mikroliter av färgning mix till cellerna (den totala volymen av celler är nu 100 mikroliter) och inkubera cellerna med mixen antikropp, skyddade från ljus och under 20 min på is.
- Förbereda mixen antikropp med en total volym av 50 mikroliter per fläck. För 50 mikroliter av ST-buffert, lägga till följande konjugerade antikroppar för grundläggande färgning: CD45 (0,5 ul; 1: 200, 0,1 mikrogram / bets), CD31 (0,5 ul; 1: 200, 0,25 mikrogram / bets), ASGPR1 (1 pl ; 1: 100; 0,2 ng / fläck), podoplanin (1 mikroliter av en 1:14 utspädning; 1: 1400 slut utspädning, 0,014 mikrogram / fläck), och CD133 (3 mikroliter, 0.09 mikrogram / fläck).
OBS: Tabell1 sammanfattar antikropps kloner och späd utnyttjas för grundläggande fläckar och ytterligare ytmarkörer av de olika undergrupper. Förbereda extra cellsuspensioner för den blandning antikroppsinnehållande motsvarande isotypkontroller och / eller fluorescens minus en kontroller (FMO), såsom visas i Tabell 2. - Tillsätt 400 mikroliter av ST-buffert till varje prov och centrifugera cellerna under 4 min vid 300 xg och 4 ° C.Discard supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 mikroliter av sekundär antikropp blandning innehållande 0,125 mikroliter av åsne-anti-get-IgG (1: 800; 0,25 | ig / fläck) och 0,25 mikroliter av fluorescerande-konjugerat streptavidin (1: 400; 0,25 | ig / fläck) i 100 mikroliter av ST-buffert.
- Inkubera cellerna medan skyddas från ljus och med den mix antikropp under 20 minuter på is. Tillsätt 400 mikroliter av ST-buffert till varje prov och centrifugera cellerna under 4 min vid 300 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 300 mikroliter av ST buffer innehållande 0,25 mikrogram / ml PI.
OBS: Cellviabiliteten av stamceller minskar med tiden; Därför föreslås det att mäta färska prov så snart som möjligt.
5. Magnetmikrokorn baserade Anrikning av progenitorceller
- Överföra en alikvot av levern singel-cellsuspension innehållande 1,5-2 x 10 6 celler, baserat på antalet celler bestämdes såsom beskrivits i steg 3, till en ny 15-ml koniskt centrifugrör.
- Centrifugera cellerna under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med hjälp av reducerad acceleration / 4 och retardation / 2).
OBS: Typiskt kommer en frisk C57Bl / 6 muslever (eller 1 g av levervävnad) måste separeras i tre 15-ml koniskt centrifugrör. - Resuspendera cellerna i 400 mikroliter av HBSS 0,5% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA) och tillsätt 40 | il av anti-CD31 mikropärlor och 30 mikroliter av anti-CD45-mikropärlor. Inkubera cellerna i 15 min vid 4 ° C.
OBS: Överskrid inte than inkubationstid, eftersom renheten hos separationen kommer att minska avsevärt. - Tillsätt 5 ml HBSS 0,5% (volym / volym) BSA till cellerna och centrifugera dem för 8 min vid 180 xg och 4 ° C (med användning av reducerat acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellpelleten i 100 mikroliter av döda borttagning cell pärlor och inkubera dem vid rumstemperatur under 15 minuter. Under tiden, förbereda en LS separationskolonn och kalibrera den med 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA.
OBS: inte överstiga inkubationstiden, som renheten hos separationen kommer att minska avsevärt. - Lägg 900 mikroliter av HBSS 0,5% (v / v) BSA till cellerna, filtrera dem genom att använda 100-um polyamid filternätet, och ladda dem på kolumn LS separation.
OBS: Ladda en hel lever på en LS separationskolonn. - Tvätta kolonnen tre gånger med 3 ml HBSS 0,5% (volym / volym) BSA och samla genomströmning.
- Centrifugera genomflödet i 8 min vid 180 xg och 4 ° C (med användning av reducerat acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellpelleten antingen i sköljbuffert (RB) (PBS och 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA)) innehållande 0,5% (volym / volym) BSA eller ST-buffert, beroende på den ytterligare experimentella förfarandet.
6. Magnetmikrokorn-baserad automatiserad cell Rening av stamcellsundergrupper kombination av flera Lever
OBS: Eftersom stamcellsgrupper representerar sällsynta cellpopulationer, behövs ofta kombinera celler från flera levrar att uppnå tillräckliga cellantal för ytterligare experiment. Som ett exempel, CD133 + och gp38 + cellseparation beskrivs nedan.
- Isolering av CD133 + progenitorceller
- Efter steg 5,9, räkna cellerna, såsom beskrivs i steg 3, och återsuspendera upp till 10 6 celler (typiskt poola 4-6 friska leverprover) i 100 mikroliter av RB.
- Lägg anti-CD64 1: 100 och anti-CD16 / 32 1: 100 till cellerna och incubåt dem på is under 5 min. Lägg 1: 100 anti-CD133 biotinylerad antikropp till cellerna och inkubera dem på is under ytterligare 10 min.
- Tillsätt 5 ml RB och centrifugera under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med reducerad acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellerna i 400 mikroliter av RB och tillsätt 10 mikroliter av anti-biotin mikropärlor. Inkubera provet under 15 min vid 4 ° C. Inte överskrider det inkubationstid, eftersom detta minskar renheten hos proverna.
- Tillsätt 5 ml RB och centrifugera under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med reducerad acceleration / 4 och retardation / 2). Återsuspendera pelleten i 1 ml RB.
- Isolering av gp38 + progenitorceller
- Efter steg 5,9, räkna cellerna, såsom beskrivs i steg 3, och återsuspendera upp till 10 6 celler (typiskt poola 4-6 friska leverprover) i 100 mikroliter av RB.
- Lägg anti-CD64 1: 100 och anti-CD16 / 32 1: 100 till cellerna och inkubera dem på is under 5 min. Nästa, tillsätt 1:100 anti-gp38 biotinylerad antikropp till cellerna och inkubera dem på is under ytterligare 10 min.
- Tillsätt 5 ml RB och centrifugera under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med reducerad acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellerna i 400 mikroliter av RB och tillsätt 5 mikroliter av anti-biotin mikropärlor. Inkubera provet under 15 min vid 4 ° C. Inte överskrider det inkubationstid, eftersom detta minskar renheten hos proverna.
- Tillsätt 5 ml RB och centrifugera under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med reducerad acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml RB.
- Vanliga steg efter steg 6,1 eller 6,2
- Placera 15-ml koniskt centrifugrör innehållande de magnetiskt märkta cellsuspensioner på en chill 5 rack med ytterligare två tomma rör för uppsamling av de positiva och negativa fraktioner. Placera chill rack på separations plattform separatorn.
- Använd positiva programval(Possel_d2) med ett omfattande tvättsteg mellan varje prov (sköljning).
OBS: Använda kolumnbaserad manuell separation av celler i stället för den automatiska separatorn kommer att minska renheten hos provet. - Samla upp den positiva fraktionen och centrifugera under 8 minuter vid 180 xg och 4 ° C (med användning av reducerat acceleration / 4 och retardation / 2).
- Resuspendera cellpelleten antingen i RB eller ST-buffert, beroende på den ytterligare experimentella förfarandet.
- För en renhetskontroll, ta en portion av cellerna och färga dem som beskrivs i steg 4.
7. Flödescytometri cellsortering
ANMÄRKNING: En hög renhet slags någon progenitor-cell-subset skulle kunna uppnås med det protokoll som beskrivs nedan. Det totala utbytet av celler är mycket lägre än den som beskrivs i steg 6 och är bäst för genexpression analys.
Parameter Miljö dysstorlek 85 | j, m Frekvens 46,00-46,20 Amplitud 38,30-55,20 Fas 0 Drop Delay 28,68-28,84 Försvagning Av första Drop 284-297 mål-Gap 9.-14 Tryck 45 psi Tabell 3.
- Förvärva celler från magnetbaserade anrikning (beskriven i steg 5); räkna dem, såsom beskrivs i steg 3; och färga dem för fader markörer (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 och CD45, som förklaras i steg 4.
- Förbereda sorteringsmedium (SM): fenolrött-fritt Dulbecco modifierade Eagles Medium (DMEM) innehållande 0,5% (volym / volym) BSA och 0,01% (volym / volym) natriumazid. Resuspendera de färgade cellerna i SM, överföra dem till en polypropylen rundbottnad röret, och placera dem på is.
OBS: Natriumazid är mycket giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning, såsom nitril, laboratorierock och en ansiktsmask. Använd inte natriumazid om de sorterade cellerna används för funktionella analyser. - Använd rätt programvara för den typ av sorterare som används för cellisolering. Öppna mjukvaran och följ tillverkarens instruktioner för att ställa in sorteringsparametrar och maskinspecifikationer.
OBS: De maskin specifikationer är sammanfattade i tabell 3. Medan maskin specifikationer kan vara olika vid olika institutioner, är det viktigt att notera att minskningen av sorteringstryck och en större munstycke är nödvändigt (45 psi och 85-um munstycke) för att öka lönsamheten för stamcellstransplantation populatjon och kvaliteten av RNA framställd från de sorterade cellerna. Det är viktigt att använda anrikade lever progenitorceller för inställning av ersättning. Andra lever- eller leukocytpopulationer har olika auto-fluorescens och resulterar i en suboptimal lösning av stromal befolkningen och i en falsk grindstrategi. - Kalibrera maskinen och placera en 5-ml polypropylen rundbottnad rör innehållande 350 mikroliter av SM i sorteringsuppsamlingsanordningen. Starta prov förvärv och slag. Samla 1.000 händelser underpopulationen och stoppa provflödet.
- Ta ut slangen från sorteringsanordningen och mäta de sorterade cellerna på flödescytometern. Identifiera den procentuella andelen av den sorterade cellpopulationen närvarande bland de levande cellerna. Denna procentsats ger renheten hos de sorterade celler.
- Om sorterings renhet överstiger 95%, placera en 5-ml polypropylen rundbottnad rör innehållande 350 mikroliter av RLT lysbuffert i sorteringsuppsamlingsanordningen.
- Starta sortera och samla 7,000-10.000 händelser per stromal subpopulation.
- Överföra RLT lysbuffert innehållande de sorterade cellerna i en DNase- och RNas-fri reaktionsrör och lagra proverna vid -80 ° C fram till vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det förfarande som presenteras här för uppslutning av levern med användning av en ny blandning av enzymer resulterar i en enkelcellsuspension innehållande parenkymal och icke-parenkymala leverceller (fig 1 och 2a). Efter det att ACK-lyse av röda blodkroppar, är den direkta flödescytometrianalys av encelliga suspension möjliga (fig 1 och 2). Gating strategin innebär uteslutande av dubbletter och döda celler (Figur 2A). De celler som är negativa för CD45, CD31 och ASGPR1 är gated. Denna population omfattar lever progenitorceller och kan grupperas baserat på deras gp38 och CD133 uttryck (figur 2a). De gp38 + CD133 + och gp38 - CD133 + celler representerar de vanligast förekommande cellpopulationer bland CD45 - CD31 - ASGPR1 - celler i frisk vuxen mus livER (fig 2a, b). Dessa undergrupper skiljer sig i uttryck av ytterligare ytmarkörer tidigare i samband med progenitorceller, såsom EpCAM, Sca-1 och CD34 (figur 2c).
Progenitorceller skulle kunna utarmas från hematopoietiska och parenkymala celler, såsom hepatocyter och leversinusformad endotelceller (LSECs) (figur 1 och 3), och stamfaderceller kan renas ytterligare med magnetisk mikrokorn baserad isolering (figur 3a, b) eller med högrent sortering (fig 1 och 4). Den magnetiska mikrokorn baserade isolering av CD133 + eller gp38 + celler resulterar i mer än 90% renhet (figur 3a, b) om eventuella förorenande CD45, CD31, eller ASGPR1 + celler, och cellerna fortsatt mycket livskraftig (figur 3a, b).
2. Detta är särskilt relevant för valet av enzymblandningen används för vävnadsdissociering. Här var kollagenas P istället för kollagenas D används för levern 1, 2, 8. Viktigt är att expressionsnivån av CD133 på progenitorceller och utbytet av isolerade cellpopulationer var kraftigt reduceras i närvaro av kollagenas D (fig 5a, b). Utöver detta, vår blandning innehöll dispas, som är mycket lämplig för skonsam uppdelning och subkultur av olika celltyper 13. Kollagenas P tillsammans med dispas representeraren idealisk kombination för cell dissociering av levern för progenitorcell analys. Denna kombination var också överlägsen trypsin eller pronas baserad nedbrytning av levern (data ej visade). Det är lika viktigt att notera att densitetscentrifugering, såsom Percoll-baserad anrikning 2, 14, var inte nödvändigt för stamfader analyser som i detta protokoll.
Figur 1: Workflow av den beskrivna protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Novel klassificering av leverföregångargrupper. En enkelcellsuspension framställdes från friska levrar och färgades därefter med en panel av ytmarkörer: CD45, CD31, CD133 och gp38 (A). För döda celler uteslutning, var propidiumjodid (PI) används. Representativa punktdiagram med grindstrategin avbildas. Grindarna används för flödescytometri celltal bestämning är också markerade. (B) De procentsatser och det absoluta antalet celler närvarande per g levervävnad av de olika stromala cellundergrupper bland CD45-negativa celler i vildtyp obehandlade djur visas. (C) Histogrammen visar särskiljande markör egenskaper stromal cellundergrupper i en frisk lever. Hög expression av CD90.2 och närvaron av CD157 är specifika för A, medan CD34 är specifik för underpopulation B. Sca-1 är närvarande i B, C, D och EpCAM endast närvarande i populationen C och D. Medelvärde ± SEM; data (AC) representerar 2-3 oberoende experiment med n = 3-4 per experiment. Data were jämfört med användning av ett oparat, tvåsvansat T-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Magnetic mikrokorn-baserad anrikning och automatiserad cellrening. (A) Magnetisk mikrokorn-baserad anrikning av CD45 -, CD31 - och ASGPR1 - celler avbildas före och efter berikning. (B) Representativa punktdiagram av de automatiserade mikrokorn baserade cell isoleringar är avbildade för CD133 + och gp38 + celler, till vänster. Till höger, är viabiliteten för cellpopulationer före och efter anrikning som visas som den procentuella andelenpropidiumjodid (PI) -negativa celler. Medelvärde ± SEM; data (AB) representerar 3 oberoende experiment med n = 3 per experiment. Data jämfördes med användning av ett oparat, tvåsvansat T-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flödescytometri slags gångargrupper med hög renhet. Punktdiagrammen visar renheten hos de cellpopulationer i de sorterade proven (post-SORT). Data representerar 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
= "1"> 
Figur 5: Jämförelse av matsmältningsenzymer. Den enkelcellsuspension framställdes med användning kollagenas P (såsom beskrivs i steg 2) eller kollagenas D (1 mg / ml + DNas-I 0,1 mg / ml) från friska levrar och färgades därefter med en panel av ytmarkörer: CD45, CD31, CD133 och gp38 (A). Procenthalterna av celler som finns per g levervävnad av de olika stromala cellundergrupper bland de CD45-negativa celler i vildtyp obehandlade djur visas. (B) Medianfluorescensintensiteten hos CD133 avbildas för CD133 + cellpopulationen. Medelvärde ± SEM; data (AB) representerar 2 oberoende experiment med n = 3 per experiment. Data jämfördes med användning av ett oparat, tvåsvansat T-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverinflammation och skada av olika ursprung utlösa regenerativa processer i levern som åtföljs av stamcellsexpansion och aktivering 2, 3. Dessa lever progenitorceller besitter stamcellsegenskaper och sannolikt spelar en betydande roll i pathomechanism av olika leversjukdomar.
De olikartade lever progenitorceller har länge föreslagits. Omprövningen av leverföregångargrupper med hjälp av en ny yta markör kombination av CD133 och gp38 kunde identifiera delmängder som bär olika ytmarkörer och uttrycka en unik uppsättning av inflammationsrelaterade gener under leverskada 12. Den här beskrivna metoden möjliggör direkt flödescytometrianalys av sällsynta celler och deras direkta jämförelser på olika leverskademodeller. Detta är särskilt relevant, eftersom olika skador utlöser aktivering av flera stamfader subsets som kan vara reflekterande av den cellulära heterogenitet observeras i duktulära reaktioner 3, 4, 11, 12. Noterbart är en liten bråkdel av murin levervävnad (0,2 g) tillräckligt för att isolera tillräckligt många celler för flödescytometrianalys av progenitorer som använder den beskrivna metoden.
Flödescytometri sortering ger hög renhet populationer av undergrupper är nödvändigt att undersöka deras unika genuttrycksprofilerna. Tidigare rapporter beskrivna flödescytometri baserade stamceller isolering 15, 16. Ändå Protokollet presenteras här ger en optimerad metod som garanterar hög renhet och livskraft dessa celler. Noterbart kan odling och expansions in vitro tekniker som beskrivits tidigare vara fint kombineras med protokollet presenteras här 15
Många typer av flödescytometri sorterare finns på olika institutioner, och deras särskilda besättningar kan vara något annorlunda. Trots detta är de allmänna principerna för cellsortering som presenteras i den beskrivna protokollet. I allmänhet ett lägre tryck och större munstycke storlek är absolut nödvändiga, oberoende av maskintyper och specifikationer. Dessutom kan användningen av ett lämpligt sorteringsmediet avsevärt öka lönsamheten och RNA kvalitet av de sorterade cellerna, vilket är en viktig faktor, särskilt för genuttryck studier. Sorteringen av progenitorceller, dock minskar avsevärt cellviabilitet, och utbytet av celler efter sortering är relativt låg (hög renhet slags 7-10,000 händelser / subpopulation, 4-5 friska lever måste slås samman). Detta skulle kunna vara en begränsande faktor för ytterligare in vitro analyser. Vi föreslår magnetiska mikrokorn baserad isolering ivitro-analyser, på grund av dess högre utbyte och cellviabilitet, och flödescytometri sortering för genuttrycksanalys, speciellt när flera specificerade delmängd analyser och isoleringar behövs.
Baserat på det faktum att lönsamheten av celler kraftigt reducerad efter flödescytometri sortering, har en automatiserad magnetiska mikrokorn baserad isolering av progenitorceller utvecklats och presenteras här. Det möjliggör isolering av ett större antal av progenitorceller med hög renhet (kombinera flera levrar). Vidare är cellernas viabilitet bibehålls, eftersom den tid som krävs för isoleringen processen är kraftigt reducerad. Även om lägre antal progenitorceller kan expanderas in vitro 1, 2, 15, 16, är det rekommenderas att överväga hur dessa in vitro-manipulationer kan påverka de cellulära egenskaperna hos stam / ProgenMonitor celler beskrivits för andra mesenkymala och stromal cellpopulationer 17, 18.
Den största begränsningen av den presenterade magnetiska mikrokorn baserad isolering är att CD133 + och gp38 + cellpopulationer representerar heterogena celler. Ytterligare ytmarkörer kan vara nödvändigt att identifiera mindre cellpopulationer.
Förståelsen för hur leverstamceller och progenitorceller förhåller sig till varandra är långt ifrån komplett, trots utmärkta studier av Lola Reid och andra 1, 8, 19. Således kunde noggrant övervägande tekniker som resulterar i högre utbyten och livskraft, såsom den som föreslås här, bidrar till att förlänga analyser av progenitorceller delmängder och förståelse för deras sammankopplade relationer.
Sammantaget har vi beskrivit than detaljerad isolering och analys av leverföregångargrupper som nyligen präglades 12. Dessutom, genom att använda en ny enzymkombinationen, sällsynta stamceller kan analyseras genom direkta mätningar flödescytometri. Dessutom visar protokollet hur man berika progenitorceller med en hög renhet, med antingen cellsortering eller en automatiserad mikrokorn-baserad teknik.
Felsökning:
Procentandelen cellrester och döende celler är höga
Om, under digestion (steg 2), är för hård för pipettering av leverprov, den procentuella andelen av döende celler i encelliga suspension ökar. Om levern skärs i större stycken än vad som föreslås, är matsmältningen mindre effektiv och resulterar i mer celldöd under beredning.
Efter att ha avslutat förfarandet i steg 5, är inte tillräckligt renheten av proverna
Om de procenTages av celldebris och döende celler i enkelcellsuspension som framställts i steg 2 är för höga, de mikropärlor binda ospecifikt och därför, är renheten hos isoleringen kraftigt reducerad.
Låg cellantalet efter mikrokorn baserade rening
För att lyckas med det beskrivna protokollet, är det viktigt att förhållandet av celler till mikropärlor är optimal, vilket föreslogs i protokollet. Med hjälp av fler mikropärlor minskar renheten och minskar utbytet och livskraft isolerade celler. Om andra än de som presenteras i protokollet ytmarkörer används för stamfader delmängd isolering måste den optimala förhållandet mellan celler till mikropärlor bestämmas.
Magnetiska mikropärla baserad isolering av gp38 + CD133 - befolkning
Följ stegen i avsnitt 5. I steg 5,3 lägga ytterligare 10 mikroliter anti-CD133 + mikropärlor, sedan följer steg 5, 6.2 och 6.3 som beskriverd.
Beräkna absoluta cellantalen
Levervikten används för att beräkna hur många celler av en viss underuppsättning är närvarande per gram levervävnad.
(% Av den subpopulation i levande celler (baserat på flödescytometri) / 100) x totala levande cell nummer isolerats från levern stycket = Z
(1 / vikt av leverstycket) x Z = cellantal / g levervävnad
Andra cellpopulationer som kan isoleras med denna metod
Det är möjligt att isolera de följande leverceller med användning av denna spjälkning protokoll: CD45 + celler (eller subpopulationer av hematopoietiska celler, t.ex. Kupffer-celler, dendritiska celler, T-celler, NK-celler, etc.) och LSECs. Digereringsprotokollet är inte lämplig för isolering av hepatocyter eller hepatiska stellatceller. Dessa celler är närvarande vid relativt låga cellantal och de visar minskad viabilitet jämfört med other tillgängliga metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen Sofja Kovalevskaja Award till VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
