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Developmental Biology

अलगाव और लिवर पूर्वज उपसमुच्चय एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन द्वारा की पहचान की संवर्धन

Published: February 18, 2017 doi: 10.3791/55284
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

Summary

लिवर चोटों पूर्वज सेल विस्तार है कि एक विषम सेल की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है के साथ कर रहे। इस सेलुलर डिब्बे के उपन्यास वर्गीकरण कई कैंपेन्स के लिए भेद की अनुमति देता है। विधि यहाँ वर्णित विश्लेषण और विभिन्न सबसेट है कि आगे assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की उच्च शुद्धता अलगाव प्रवाह cytometry को दिखाता है।

Abstract

जीर्ण जिगर की चोटों के दौरान, पूर्वज कोशिकाओं एक प्रक्रिया ductular प्रतिक्रिया कहा जाता है, जो भी भड़काऊ सेलुलर घुसपैठ और उपकला सेल सक्रियण की उपस्थिति पर जोर देता में विस्तार। इस तरह के भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान पूर्वज सेल की आबादी ज्यादातर एकल सतह मार्कर का उपयोग कर जांच की गई है, या तो ऊतकीय विश्लेषण द्वारा या प्रवाह cytometry आधारित तकनीक से। हालांकि, उपन्यास सतह मार्कर जिगर पूर्वज के भीतर विभिन्न कार्यात्मक अलग कैंपेन्स पहचान / सेल डिब्बे स्टेम। यहाँ प्रस्तुत विधि अलगाव और उपन्यास सतह मार्कर संयोजन का उपयोग कर पूर्वज कैंपेन्स के cytometry विश्लेषण विस्तृत प्रवाह का वर्णन है। इसके अलावा, यह दर्शाता है कि कैसे विभिन्न पूर्वज सेल सबसेट उच्च शुद्धता का उपयोग कर चुंबकीय स्वचालित और FACS छँटाई आधारित विधियों के साथ अलग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, जिगर के उपन्यास और सरल एंजाइमी हदबंदी एक उच्च व्यवहार्यता के साथ इन दुर्लभ सेल आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता हैकि अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में बेहतर है। यह आगे इन विट्रो में पूर्वज कोशिकाओं के अध्ययन के लिए या उच्च गुणवत्ता शाही सेना को अलग-थलग जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।

Introduction

लिवर उत्थान ज्यादातर hepatocytes की आत्म नवीकरण क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है। फिर भी, जीर्ण जिगर की चोटों पूर्वज सेल सक्रियण और विस्तार है, जो hepatocytes और cholangiocytes 1, 2, 3, 4 में अंतर करने की क्षमता के साथ संबद्ध किया गया है साथ होते हैं। यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि पुरानी चोट के दौरान, hepatocyte प्रसार प्रभावी नहीं है। कई आनुवंशिक ट्रेसिंग पूर्वज कोशिकाओं को निशाना अध्ययनों के बावजूद, जिगर उत्थान में उनकी भूमिका विवादास्पद 5, 6, 7, 8 बनी हुई है। इसके अलावा, पूर्वज कोशिकाओं की सक्रियता जिगर में वृद्धि हुई fibrotic प्रतिक्रिया है, जो चोटों 9 के दौरान अपनी सटीक भूमिका के बारे में सवाल उठता से जोड़ा गया है10।

पूर्वज सेल डिब्बे की विषम प्रकृति लंबे जीन अभिव्यक्ति अध्ययन है कि पूर्वज कोशिकाओं एक भी सतह मार्कर व्यक्त microdissection या सेल छँटाई आधारित विधियों 1, 11 का उपयोग कर अलग से सुझाव दिया गया है। दरअसल, हाल ही में, एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन का उपयोग कर gp38 (podoplanin) स्पष्ट पूर्वज कोशिकाओं के पिछले एक मार्कर के विभिन्न सबसेट 12 से जुड़ा हुआ है। महत्वपूर्ण बात है, इन कैंपेन्स ही उनकी सतह मार्कर अभिव्यक्ति में मतभेद नहीं है लेकिन यह भी चोटों के 12 के दौरान कार्यात्मक परिवर्तन का प्रदर्शन किया।

एकाधिक पशु मॉडल पूर्वज सेल सक्रियण और जिगर उत्थान जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। ऐसा लगता है कि विभिन्न प्रकार के चोट के पूर्वज कोशिकाओं 12 के सबसेट भिन्न की सक्रियता को बढ़ावा देने के। यह पीएच व्याख्या हो सकती हैमनुष्य 4 में मनाया ductular प्रतिक्रिया के enotypic विचलन। इस प्रकार, पूर्वज कोशिकाओं के जटिल प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण चोटों में उनकी भूमिका और यकृत रोगों में ductular प्रतिक्रिया का असली महत्व को समझने के लिए निर्णायक हैं।

सतह मार्कर संयोजन इसके अलावा, सेल अलगाव प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण मतभेद आगे पिछले अध्ययनों के आधार पर निष्कर्ष 2 को मुश्किल। अध्ययन का एक पर्याप्त राशि पूर्वज कोशिकाओं है कि बहुत से उनके अलगाव प्रोटोकॉल में मतभेद है (जैसे, जिगर हदबंदी (एंजाइम संयोजन और प्रक्रिया की अवधि), घनत्व मध्यम, और centrifugation गति) की भूमिका को संबोधित 2। एक अनुकूलित अलगाव तकनीक, दुर्लभ सेल आबादी के लिए बेहतर व्यवहार्यता प्रदान करने और सबसेट रचना को प्रतिबिंबित करता है, विकसित और हाल ही में 12 प्रकाशित किया गया है। इस लेख का उद्देश्य एक अधिक Det प्रदान करने के लिए हैइस जिगर सेल अलगाव की प्रक्रिया और सबसेट विश्लेषण के ailed प्रोटोकॉल तकनीक के समुचित प्रजनन के लिए अनुमति देने के लिए। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल नए प्रोटोकॉल की तुलना में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए पिछले अलगाव विधि के साथ एक तुलना भी शामिल है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं नैतिकता और Homburg यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर के जानवरों की देखभाल समितियों के अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया।

1. सामग्री और बफ़र की तैयारी

  1. हौसले जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए बाँझ घटकों और एक लामिना हुड का उपयोग कर जिगर पाचन के लिए आवश्यक सभी बफ़र्स तैयार करते हैं।
  2. RPMI माध्यम से 49.5 एमएल और भ्रूण गोजातीय सीरम के 0.5 एमएल के मिश्रण से संग्रह बफर (सीबी) तैयार (एफबीएस, कम endotoxin, गर्मी निष्क्रिय) एक 1% (वी / वी) समाधान प्राप्त करने के लिए। आगे उपयोग के लिए जब तक बर्फ पर समाधान स्टोर।
    नोट: लगभग 25 सीबी एमएल एक पूरे जिगर को पचाने के लिए आवश्यक है।
  3. निम्नलिखित सामग्री का उपयोग करके पाचन बफर (डीबी) तैयार: RPMI मध्यम, 1% (v / v) FBS (कम endotoxin, गर्मी निष्क्रिय), कोलैजिनेज़ पी (0.2 मिलीग्राम / एमएल), DNase मैं (0.1 मिलीग्राम / एमएल) और Dispase (0.8 मिलीग्राम / एमएल)।
    नोट: लगभग 25 डीबी एमएल एक पूरे जिगर को पचाने के लिए आवश्यक है। टी में डीबी पूर्व गर्मवह 37 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले पानी से स्नान।
  4. हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल में आगमन पर एंजाइमों (HbSS; collagense पी और Dispase) Reconstitute या DNase-मैं बफर (50% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 1 मिमी 2 MgCl, और 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5) , यह विभाज्य, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान। DNase-मैं दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर और दो महीने के भीतर यह प्रयोग करें।

2. लिवर एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. स्थानीय नैतिकता और जानवरों की देखभाल समितियों के अनुसार ग्रीवा अव्यवस्था से इलाज प्रकार के जंगली चूहों euthanize।
  2. एक विच्छेदन बोर्ड पर चूहों प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ फर गीला। कैंची का प्रयोग, त्वचा की एक midline चीरा, अंगों की दिशा में एक वाई-चीरा के द्वारा पीछा के साथ पेट खुला। उरोस्थि कैंची का उपयोग करने के लिए पेरिटोनियम खोलो। जिगर को उजागर करने के लिए, एक कपास झाड़ू का उपयोग सही पक्ष को धीरे आंत विस्थापित।
  3. कैंची और संदंश की मदद से, जिगर पालियों हटाने,पित्ताशय पीछे छोड़ रहा है, और संयोजी ऊतक के साथ संक्रमण से बचने। जिगर वजन और HBSS युक्त एक पेट्री डिश में बर्फ पर जगह है।
  4. एक सूखी पेट्री डिश पर जिगर पालियों की जगह और सजातीय क्यूब्स में लगभग 2 मिमी एक पक्ष जिगर ऊतक में कटौती एक छुरी का उपयोग करके। एक 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में टुकड़े स्थानांतरण।
  5. जिगर के टुकड़े से युक्त 15-एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब डीबी के 2.5 एमएल जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह पाचन प्रक्रिया शुरू करने के लिए (एक स्वस्थ जिगर 60-70 मिनट लगते हैं और एक cirrhotic जिगर 80-90 मिनट लगते हैं )।
    नोट: यदि एक पूरे जिगर पच किया जा रहा है, जिगर दो 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग किया जाना चाहिए अच्छा सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए।
  6. जारी की जिगर की कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक नया 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें। ट्यूब के शीर्ष पर एक पॉलियामाइड 100 माइक्रोन फिल्टर जाल की जगह और सीबी के 800 μL के साथ जाल गीला। बर्फ पर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
  7. सैम मिक्समंदिरों आदेश 15-एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज जिगर के टुकड़े युक्त ट्यूब झटकों से पाचन प्रक्रिया का समर्थन करने के बाद 5 और 10 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
  8. 15 मिनट के पाचन में शुरू करने के बाद, धीरे जिगर के टुकड़े एक कट टिप है कि जिगर के टुकड़े को आसानी के माध्यम से पारित करने के लिए सक्षम बनाता है के साथ 1,000 μL पिपेट का उपयोग मिश्रण। ट्यूब के पानी के स्नान में वापस प्लेस और टुकड़े 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  9. प्रचारित कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला (आमतौर पर 700 μL 2x) निकालें और 2.6 चरण में तैयार ट्यूब में जोड़ें। डीबी के साथ हटा दिया सतह पर तैरनेवाला (2x 700 μL) की जगह है और यह 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वापस जगह है।
  10. जब तक लगभग 60-70 मिनट पाचन की शुरुआत के बाद से पारित कर दिया है प्रक्रिया कदम 2.8 (आमतौर पर 30 से, 40, 50, 55, और 60 मिनट) में वर्णित दोहराएँ। 40 मिनट के बाद से, शेष जिगर के टुकड़े काफी छोटा एक काटा हुआ 1000 μL विंदुक टिप के माध्यम से पारित करने के लिए होना चाहिए।
    नोट: स्वस्थ जिगर DIGE हैजबकि fibrotic जिगर आम तौर पर 80-90 मिनट की जरूरत है, 60-70 मिनट के भीतर पूरी तरह से sted। इस समय बिंदु से, जिगर ऊतक शंक्वाकार 15 एमएल अपकेंद्रित्र जिगर के टुकड़े युक्त ट्यूब में दिखाई नहीं होना चाहिए, और सब जारी की कोशिकाओं 2.6 चरण में तैयार ट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
  11. पाचन प्रक्रिया के अंत में, कोशिकाओं को इकट्ठा और 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र (का उपयोग कम त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
  12. सेल गोली अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम के 1 एमएल (एसीके) में lysis बफर Resuspend और व्यवस्था की लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए यह सेते हैं। सीबी के 5 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र (का उपयोग कम त्वरण / 4 और मंदी / 2)। सीबी के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और बर्फ पर उन्हें दुकान। चरण 3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गणना।
    नोट: सेल गोली ढीला है, और इसलिए सतह पर तैरनेवाला दूर निथर होने के बजाय pipetted है।

    3. कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण से फ्लो का प्रयोग

    नोट: सेल मायने रखता है, एक स्वचालित सेल काउंटर या, आदर्श, प्रवाह cytometry आधारित सेल मात्रा का ठहराव नीचे वर्णित शास्त्रीय Neubauer चैम्बर आधारित पद्धति के बजाय सुझाव दिया है का निर्धारण करने के लिए। जिगर एकल कोशिका निलंबन चरण 2 में वर्णित बहुत भिन्न आकार और granularities साथ parenchymal और गैर parenchymal कोशिकाओं (एनपीसी) शामिल हैं। सेलुलर मलबे के समुचित बहिष्कार gating पर आगे तितर बितर, ओर तितर बितर (एफएससी-एसएससी) NPCs जब प्रवाह cytometry का उपयोग की विशेषता के साथ एक साथ वर्णित प्रोटोकॉल 12 की सफलता सुनिश्चित करता है।

    1. जिगर सेल निलंबन (20 μL) के एक विभाज्य को तैयार है और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और propidium आयोडीन के 6 μL के 174 μL जोड़ने (पीआई, अंत एकाग्रता 0.375 माइक्रोग्राम / एमएल)। गिनती मोती है कि कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति जोड़ें।
    2. एस पर गेटअनुसूचित जाति-ए-FSC-ए मलबे से बचने के लिए और आगे एफएससी-एच और एफसीएस-ए का उपयोग कर दोहरी बाहर।
      नोट: यह gating रणनीति चित्रा 2 में दिखाया गया है का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. गेट बाहर पीआई पॉजिटिव मृत कोशिकाओं, अपने नमूनों से 30 μL को मापने, और घटनाओं को दर्ज। कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देश का पालन करें।
      नोट: माप प्रवाह cytometry के लिए 4 चरणों का पालन, चुंबकीय आधारित पूर्वज सेल अलगाव के लिए चरण 5 और 6, और पूर्वज उप-जनसंख्या की तरह प्रवाह cytometry के लिए 7 कदम।

    4. पूर्वज कैंपेन्स के FOW Cytometry विश्लेषण के लिए जिगर एकल सेल निलंबन के धुंधला

    एंटीबॉडी क्लोन मेजबान / Isotype शेयर एकाग्रता [मिलीग्राम / एमएल] घोला
    CD64 X54-5 / 7.1 माउस IgG1, κ 0.5 1: 100
    CD16 / 32 93 चूहा IgG2a, λ 0.5 1: 100
    CD45 30-F11 चूहा IgG2b, κ 0.2 1: 200
    CD31 MEC13.3 चूहा IgG2a, κ 0.5 1: 200
    ASGPR1 पॉलीक्लोनल बकरी आईजीजी 0.2 1: 100
    Podoplanin 2001/01/08 सीरियाई हम्सटर आईजीजी 0.2 1: 1400
    Podoplanin 2001/01/08 सीरियाई हम्सटर आईजीजी 0.5 1: 1400
    CD133 Mb9-3G8 चूहा IgG1 0.03 3 μL
    CD133 315-2C11 चूहा पुलिस महानिरीक्षकG2a, λ 0.5 1: 100
    CD34 RAM34 चूहा IgG2a, κ 0.5 1: 100
    CD90.2 53-2,1 चूहा IgG2, κ 0.5 1: 800
    CD157 बीपी -3 माउस IgG2b, κ 0.2 1: 600
    EpCAM G8.8 चूहा IgG2a, κ 0.2 1: 100
    एससीए -1 D7 चूहा IgG2a, κ 0.03 10 μL
    माउस IgG2b, κ एमपीसी-11 0.2
    चूहा IgG1 RTK2071 0.2
    चूहा IgG2b, κ RTK4530 0.2
    चूहा IgG2a, κ RTK2758 0.5
    चूहा IgG2a, κ RTK2758 0.2
    सीरियाई हम्सटर आईजीजी एसएचजी-1 0.2
    सीरियाई हम्सटर आईजीजी एसएचजी-1 0.5
    सामान्य बकरी आईजीजी नियंत्रण पॉलीक्लोनल बकरी आईजीजी 1
    गधा विरोधी बकरी आईजीजी गधा आईजीजी 2 1: 800
    streptavidin 1 1: 400

    तालिका एक।

    एंटीबॉडी 1 2 3 4 5
    CD45 एपीसी / Cy7 चूहा IgG2b, κ
    0.5 μL     		+ + + +
    CD31 बायोटिन + चूहा IgG2a, κ
    0.5 μL     		+ + +
    ASGPR1 शुद्ध + + सामान्य बकरी आईजीजी नियंत्रण
    0.2 μL     		+ +
    Podoplanin एपीसी + + + सीरियाई हम्सटर आईजीजी
    एक 1:14 कमजोर पड़ने की 1 μL     		+
    CD133 पीई + + </ Td> + + चूहा IgG1
    0.45 μL
    गधा विरोधी बकरी
    एलेक्सा स्त्राव 488     		+ + + + +
    streptavidin
    एलेक्सा स्त्राव 405     		+ + + + +

    सारणी 2।

    1. चरण 3 में वर्णित के रूप में एक प्रतिक्रिया ट्यूब (1.5 एमएल) 2.5 x 10 5 कोशिकाओं, निर्धारित युक्त में कदम 2.11 से सेल निलंबन के एक विभाज्य रखें।
    2. 300 XG पर 3 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस एक microcentrifuge प्रयोग करने के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
      नोट: इस बिंदु पर, एक वैक्यूम पंप ध्यान से सतह पर तैरनेवाला दूर करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
    3. एफसी-ब्लॉक मिश्रण में सेल गोली Resuspend और बर्फ पर 5 मिनट के लिए यह सेते हैं। दाग प्रति 50 μL की कुल मात्रा के साथ एफसी-ब्लॉक मिश्रण तैयार करें। 1 जोड़ेएफसीआर अवरुद्ध अभिकर्मक के 0 μL, शुद्ध विरोधी CD64 के 1 μL (1: 100; 0.5 माइक्रोग्राम / दाग), और धुंधला बफर के 40 μL (अनुसूचित जनजाति बफर: HBSS, 1% (v / v) FBS, और 0.01% सोडियम azide) दाग प्रति।
      नोट: सोडियम azide बेहद जहरीला है। ऐसे nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और एक चेहरा मुखौटा के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें।
    4. कोशिकाओं के मिश्रण धुंधला करने के 50 μL जोड़ें (कोशिकाओं की कुल मात्रा 100 μL) है और एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ कोशिकाओं, प्रकाश से सुरक्षित और बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. दाग प्रति 50 μL की कुल मात्रा के साथ एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। , CD31 (0.5 μL, 1: 200; 0.25 माइक्रोग्राम / दाग), ASGPR1 (1 μL: CD45 (0.1 माइक्रोग्राम / दाग; 200 1 0.5 μL:) 50 अनुसूचित जनजाति के μL बफर के लिए, बुनियादी धुंधला के लिए निम्नलिखित संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ने ; 1: 100, 0.2 माइक्रोग्राम / दाग), podoplanin (एक 1:14 कमजोर पड़ने की 1 μL, 1: 1,400 अंत कमजोर पड़ने; 0.014 माइक्रोग्राम / दाग), और CD133 (3 μL; 0.09 माइक्रोग्राम / दाग)।
      नोट: टेबल1 एंटीबॉडी क्लोन और बुनियादी दाग के लिए और विभिन्न कैंपेन्स के अतिरिक्त सतह मार्कर के लिए उपयोग किया dilutions सार। के रूप में तालिका 2 में दिखाया गया है, इसी निर्धारण नियंत्रण और / या प्रतिदीप्ति शून्य से एक नियंत्रण (FMOs) युक्त एंटीबॉडी मिश्रण के लिए अतिरिक्त कक्ष निलंबन तैयार करें।
    6. 400 अनुसूचित जनजाति के बफर के μL गधा विरोधी बकरी आईजीजी की 0.125 μL (1 युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 μL में 300 XG पर 4 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने के जोड़े और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं और 4 डिग्री C.Discard तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं: 800; 0.25 माइक्रोग्राम / दाग) और फ्लोरोसेंट संयुग्मित streptavidin (1 से 0.25 μL: 400; 0.25 माइक्रोग्राम / दाग) अनुसूचित जनजाति बफर के 100 μL में।
    7. प्रकाश से और बर्फ पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी मिश्रण के साथ सुरक्षित है, जबकि कोशिकाओं को सेते हैं। प्रत्येक नमूने के 400 अनुसूचित जनजाति के μL बफर जोड़ें और 300 XG पर 4 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और अनुसूचित जनजाति के शौकीन के 300 μL में कोशिकाओं resuspendएर युक्त 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल पीआई।
      ध्यान दें: पूर्वज कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता समय के साथ कम हो जाती है; इसलिए, यह जितनी जल्दी हो सके ताजा नमूनों को मापने के लिए सुझाव दिया है।

    पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का 5. चुंबकीय Microbead आधारित संवर्धन

    1. चरण 3 में वर्णित के रूप में एक नया 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में, जिगर एकल कोशिका 1.5-2 x 10 6 कोशिकाओं, निर्धारित कोशिकाओं की संख्या के आधार पर युक्त निलंबन के एक विभाज्य स्थानांतरण।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र (कम उपयोग कर त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
      नोट: आमतौर पर, एक स्वस्थ C57BL 6 / माउस जिगर (या जिगर ऊतक के 1 ग्राम) तीन 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में विभाजित करने की आवश्यकता होगी।
    3. HBSS 0.5% (वी / वी) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 400 μL में कोशिकाओं resuspend और विरोधी CD31 microbeads के 40 μL और विरोधी CD45 microbeads के 30 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: टी से अधिक नहीं हैवह समय ऊष्मायन के रूप में जुदाई की पवित्रता को काफी कम हो जाएगा।
    4. कोशिकाओं के लिए 5 HBSS के एमएल 0.5% (v / v) बीएसए जोड़े और 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र (का उपयोग कम त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
    5. मृत सेल हटाने मोतियों की 100 μL में सेल गोली Resuspend और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें सेते हैं। इस बीच में, एक LS जुदाई स्तंभ तैयार करने और HBSS 0.5% की 3 एमएल (वी / वी) बीएसए के साथ यह जांचना।
      नोट: ऊष्मायन समय अधिक नहीं है, के रूप में जुदाई की पवित्रता को काफी कम हो जाएगा।
    6. 900 HBSS के μL 0.5% (v / v) बीएसए कोशिकाओं को जोड़ने, 100 माइक्रोन पॉलियामाइड फिल्टर जाल का उपयोग कर उन्हें फिल्टर, और लोकसभा जुदाई स्तंभ पर उन्हें लोड।
      नोट: लोड एक पूरे जिगर एक लोकसभा जुदाई स्तंभ पर।
    7. 3 HBSS के एमएल 0.5% (v / v) बीएसए के साथ स्तंभ धो तीन बार और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए प्रवाह के माध्यम से अपकेंद्रित्र (कम acce का उपयोग करleration / 4 और मंदी / 2)।
    9. या तो बफर (आरबी) (पीबीएस और 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) 0.5% (v / v) बीएसए या अनुसूचित जनजाति के बफर, आगे प्रयोगात्मक प्रक्रिया के आधार पर युक्त rinsing में सेल गोली Resuspend।

    पूर्वज सेल सबसेट के 6. चुंबकीय Microbead आधारित स्वचालित सेल शोधन एकाधिक यकृत से संयुक्त

    नोट: चूंकि पूर्वज सेल सबसेट दुर्लभ सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं, कई यकृत से संयोजन कोशिकाओं अक्सर आगे के प्रयोगों के लिए पर्याप्त सेल नंबर हासिल करने की जरूरत है। एक उदाहरण है, CD133 + और gp38 + सेल जुदाई के रूप में नीचे वर्णित है।

    1. CD133 + progenitors के अलगाव
      1. कदम 5.9 के बाद, कोशिकाओं, चरण 3 में वर्णित के रूप में गिनती, और आरबी के 100 μL में 10 6 कोशिकाओं (आमतौर पर 4-6 स्वस्थ जिगर नमूने पूलिंग) तक resuspend।
      2. जोड़े विरोधी CD64 1: 100 और विरोधी CD16 / 32 1: 100 कोशिकाओं और incub करने के लिए5 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें खा लिया। कोशिकाओं के लिए 100 विरोधी CD133 biotinylated एंटीबॉडी और एक और 10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें सेते हैं: 1 जोड़ें।
      3. 180 XG पर 8 मिनट के लिए आरबी के 5 एमएल जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज और 4 डिग्री सेल्सियस (का उपयोग कम हो त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
      4. आरबी के 400 μL में कोशिकाओं resuspend और विरोधी बायोटिन microbeads के 10 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूना सेते हैं। ऊष्मायन समय अधिक नहीं है, के रूप में इस नमूने की पवित्रता को कम कर देता है।
      5. 180 XG पर 8 मिनट के लिए आरबी के 5 एमएल जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज और 4 डिग्री सेल्सियस (का उपयोग कम हो त्वरण / 4 और मंदी / 2)। आरबी के 1 एमएल में गोली Resuspend।
    2. Gp38 + progenitors के अलगाव
      1. कदम 5.9 के बाद, कोशिकाओं, चरण 3 में वर्णित के रूप में गिनती, और आरबी के 100 μL में 10 6 कोशिकाओं (आमतौर पर 4-6 स्वस्थ जिगर नमूने पूलिंग) तक resuspend।
      2. जोड़े विरोधी CD64 1: 100 और विरोधी CD16 / 32 1: 100 कोशिकाओं के लिए और 5 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें सेते हैं। अगले, 1 जोड़ें:100 विरोधी gp38 कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी biotinylated और एक और 10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें सेते हैं।
      3. 180 XG पर 8 मिनट के लिए आरबी के 5 एमएल जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज और 4 डिग्री सेल्सियस (का उपयोग कम हो त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
      4. आरबी के 400 μL में कोशिकाओं resuspend और विरोधी बायोटिन microbeads के 5 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूना सेते हैं। ऊष्मायन समय अधिक नहीं है, के रूप में इस नमूने की पवित्रता को कम कर देता है।
      5. 180 XG पर 8 मिनट के लिए आरबी के 5 एमएल जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज और 4 डिग्री सेल्सियस (का उपयोग कम हो त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
      6. आरबी के 1 एमएल में सेल गोली Resuspend।
    3. कदम 6.1 या 6.2 के बाद आम कदम
      1. 15-एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज सकारात्मक और नकारात्मक अंशों इकट्ठा करने के लिए दो अतिरिक्त खाली ट्यूब के साथ एक सर्द 5 रैक पर चुंबकीय लेबल सेल निलंबन युक्त ट्यूब रखें। विभाजक की जुदाई मंच पर ठंड रैक रखें।
      2. सकारात्मक चयन प्रोग्राम का उपयोग करें(Possel_d2) प्रत्येक नमूना (कुल्ला विकल्प) के बीच एक व्यापक कदम धोने के साथ।
        ध्यान दें: स्वत: विभाजक के बजाय कोशिकाओं के स्तंभ आधारित मैनुअल जुदाई का उपयोग नमूना की शुद्धता कम हो जाएगा।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस 180 XG पर 8 मिनट और के लिए सकारात्मक अंश और सेंट्रीफ्यूज लीजिए (का उपयोग कम हो त्वरण / 4 और मंदी / 2)।
      4. सेल गोली Resuspend या तो आरबी या अनुसूचित जनजाति के बफर में, आगे प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर निर्भर करता है।
      5. एक शुद्धता की जांच के लिए, कोशिकाओं के एक विभाज्य ले और चरण 4 में वर्णित के रूप में उन्हें दाग।

    7. से फ्लो सेल छंटनी

    नोट: किसी भी पूर्वज सेल सबसेट के एक उच्च शुद्धता क्रमबद्ध प्रोटोकॉल नीचे वर्णित के साथ प्राप्त किया जा सकता है। कोशिकाओं की कुल उपज बहुत कम की तुलना कि चरण 6 में वर्णित है और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा है।

    पैरामीटर सेटिंग
    नोक आकार 85 माइक्रोन
    आवृत्ति 46.00 - 46.20
    आयाम 38.30 - 55.20
    अवस्था 0
    ड्रॉप देरी 28.68 - 28,84
    क्षीणन बंद
    पहली बूंद 284 - 297
    लक्ष्य गैप 9. -14
    दबाव 45 साई

    टेबल तीन।

    1. चुंबकीय आधारित संवर्धन (चरण 5 में वर्णित) से कोशिकाओं मोल; चरण 3 में वर्णित के रूप में, उन्हें गिनती; और उन्हें पूर्वज मार्कर (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 और CD45 के लिए दाग, के रूप में चरण 4 में विस्तार से बताया।
    2. फिनोल लाल मुक्त Dulbec: छँटाई मध्यम (एसएम) तैयारसह संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 0.5% (v / v) बीएसए और 0.01% (वी / वी) सोडियम azide युक्त। , एस.एम. में दाग कोशिकाओं Resuspend उन्हें एक polypropylene दौर नीचे ट्यूब में हस्तांतरण, और बर्फ पर उन्हें जगह है।
      नोट: सोडियम azide बेहद जहरीला है। ऐसे nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और एक चेहरा मुखौटा के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें। सोडियम azide का उपयोग हल कोशिकाओं कार्यात्मक assays के लिए उपयोग किया जाता है, तो मत करो।
    3. सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल सॉर्टर के प्रकार के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। सॉफ्टवेयर खोलें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें छँटाई मापदंडों और मशीन विनिर्देशों स्थापित करने के लिए।
      नोट: मशीन विनिर्देशों तालिका 3 में संक्षेप हैं। मशीन विनिर्देशों विभिन्न संस्थानों में अलग-अलग हो सकता है, यह ध्यान दें कि छँटाई दबाव की कमी और एक बड़ा नोक आकार जरूरी है कि महत्वपूर्ण है (45 साई और 85 माइक्रोन नोक) पूर्वज सेल populat की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिएआयन और हल कोशिकाओं से तैयार शाही सेना की गुणवत्ता। यह मुआवजा की स्थापना के लिए समृद्ध जिगर पूर्वज कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। अन्य जिगर या ल्युकोसैट आबादी stromal आबादी का एक सबऑप्टिमल संकल्प में और एक झूठी gating रणनीति में विभिन्न ऑटो प्रतिदीप्ति और परिणाम है।
    4. मशीन जांचना और एक 5 एमएल polypropylene दौर नीचे क्रमबद्ध संग्रह डिवाइस में एसएम के 350 μL युक्त ट्यूब जगह है। नमूना अधिग्रहण और क्रमबद्ध शुरू करो। उप-जनसंख्या के 1000 की घटनाओं लीजिए और नमूना प्रवाह को रोकने के।
    5. छँटाई डिवाइस के बाहर ट्यूब ले लो और प्रवाह पर हल कोशिकाओं को मापने। जीवित कोशिकाओं के बीच वर्तमान हल सेल की आबादी का प्रतिशत पहचानें। यह प्रतिशत हल कोशिकाओं की पवित्रता देता है।
    6. क्रमबद्ध पवित्रता 95% से अधिक है, एक 5 एमएल polypropylene दौर नीचे क्रमबद्ध संग्रह डिवाइस में RLT lysis बफर के 350 μL युक्त ट्यूब जगह है।
    7. क्रमबद्ध शुरू और इकट्ठा 7,000stromal उप-जनसंख्या के अनुसार 10,000 घटनाओं।
    8. आगे के विश्लेषण तक एक डिग्री सेल्सियस DNase- और RNase मुक्त प्रतिक्रिया ट्यूब में हल कोशिकाओं से युक्त RLT lysis बफर स्थानांतरण और -80 में नमूने की दुकान।

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Representative Results

प्रक्रिया यहाँ एक एकल कोशिका parenchymal और गैर parenchymal जिगर की कोशिकाओं (आंकड़े 1 और 2 ए) युक्त निलंबन में एंजाइमों परिणामों के एक उपन्यास मिश्रण का उपयोग जिगर के पाचन के लिए प्रस्तुत किया। लाल रक्त कोशिकाओं के एसीके-lysing के बाद, एकल कोशिका निलंबन की cytometry विश्लेषण प्रत्यक्ष प्रवाह संभव (आंकड़े 1 और 2) है। Gating रणनीति दोहरी और मृत कोशिकाओं (चित्रा 2A) का बहिष्कार करना शामिल है। कोशिकाओं है कि CD45, CD31, और ASGPR1 के लिए नकारात्मक हैं gated हैं। इस आबादी जिगर पूर्वज कोशिकाओं में शामिल हैं और उनके gp38 और CD133 अभिव्यक्ति (चित्रा 2A) पर आधारित बांटा जा सकता है। Gp38 + CD133 + और gp38 - CD31 - - ASGPR1 - कोशिकाओं को स्वस्थ वयस्क माउस लिव CD133 + कोशिकाओं CD45 के बीच सबसे प्रचुर मात्रा में सेल आबादी का प्रतिनिधित्वईआर (चित्रा 2A, बी)। इन कैंपेन्स पहले ऐसे EpCAM, SCA-1, और CD34 (चित्रा 2 सी) के रूप में पूर्वज कोशिकाओं, के साथ जुड़े अतिरिक्त सतह मार्करों की अभिव्यक्ति में मतभेद है।

पूर्वज कोशिकाओं ऐसे hepatocytes और यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) (आंकड़े 1 और 3), और पूर्वज कोशिकाओं चुंबकीय microbead आधारित अलगाव के साथ आगे शुद्ध किया जा सकता है (चित्रा 3 ए, बी) या साथ के रूप में hematopoietic और parenchymal कोशिकाओं, से समाप्त किया जा सकता है उच्च शुद्धता छँटाई (आंकड़े 1 और 4)। 90% से अधिक शुद्धता में CD133 + या gp38 + कोशिकाओं परिणामों के चुंबकीय microbead आधारित अलगाव (चित्रा 3 ए, बी) किसी भी दूषित CD45, CD31, या ASGPR1 + कोशिकाओं के बारे में, और कोशिकाओं अत्यधिक सक्षम रहते हैं (चित्रा 3 ए, बी)।

2 की व्यवहार्यता में अलग कर सकते हैं। इस ऊतक हदबंदी के लिए उपयोग एंजाइम मिश्रण के चुनाव के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। इधर, कोलैजिनेज़ पी के बजाय कोलैजिनेज़ डी जिगर 1, 2, 8 के लिए इस्तेमाल किया गया था। महत्वपूर्ण बात है, पूर्वज कोशिकाओं पर CD133 की अभिव्यक्ति के स्तर पर और अलग-थलग सेल आबादी की उपज बहुत कोलैजिनेज़ डी की उपस्थिति में कम हो गई थी (चित्रा 5 ए, बी)। इस के अलावा, हमारे मिश्रण Dispase निहित है, जो कोमल disaggregation और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के 13 subculturing के लिए बेहद उपयुक्त है। कोलेजिनेस पी dispase के साथ मिलकर का प्रतिनिधित्व करता हैपूर्वज सेल विश्लेषण के लिए जिगर की सेल हदबंदी के लिए एक आदर्श संयोजन है। इस संयोजन या भी trypsin के लिए बेहतर था जिगर के pronase आधारित पाचन (नहीं दिखाया डेटा)। यह नोट करना ऐसे Percoll आधारित संवर्धन 2, 14 के रूप में उस घनत्व centrifugation, उतना ही महत्वपूर्ण है, आवश्यक लिए पूर्वज इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत विश्लेषण नहीं था।

आकृति 1
चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: जिगर पूर्वज कैंपेन्स के उपन्यास वर्गीकरण। एक एकल कोशिकानिलंबन स्वस्थ यकृत से तैयार किया गया था और बाद में सतह मार्कर के एक पैनल के साथ दाग: CD45, CD31, CD133 और gp38 (ए)। मृत सेल बहिष्कार के लिए, propidium आयोडाइड (पीआई) उपयोग किया गया था। gating रणनीति के साथ प्रतिनिधि डॉट भूखंडों चित्रित कर रहे हैं। कोशिका गिनती दृढ़ संकल्प प्रवाह cytometry के लिए इस्तेमाल किया गेट्स भी चिह्नित कर रहे हैं। (बी) के प्रतिशत और प्रति जंगली प्रकार के इलाज जानवरों में CD45 नकारात्मक कोशिकाओं के बीच विभिन्न stromal सेल सबसेट के जिगर ऊतक के छ मौजूद कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या दिखाए जाते हैं। (सी) histograms एक स्वस्थ जिगर में stromal सेल सबसेट के विशिष्ठ विशेषताओं मार्कर प्रदर्शित करते हैं। CD90.2 के उच्च अभिव्यक्ति और CD157 की उपस्थिति, एक के लिए विशिष्ट हैं, जबकि उप-जनसंख्या CD34 के लिए विशिष्ट बी Sca -1 बी में मौजूद है, सी, डी और EpCAM आबादी सी और डी मतलब ± SEM में ही मौजूद है; डेटा (एसी) एन के साथ 2-3 स्वतंत्र प्रयोगों = 3-4 प्रयोग के प्रति प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा werई एक unpaired, दो पूंछ टी परीक्षण * पी <0.05, ** पी <0.005, *** पी <0.0001 का उपयोग कर की तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: चुंबकीय microbead आधारित संवर्धन और स्वचालित सेल शुद्धि। CD45 (ए) चुंबकीय microbead आधारित संवर्धन - CD31 - और ASGPR1 - कोशिकाओं से पहले और संवर्धन के बाद चित्रित कर रहे हैं। (बी) स्वचालित microbead आधारित सेल isolations के प्रतिनिधि डॉट भूखंडों पर छोड़ दिया, के लिए CD133 + और gp38 + कोशिकाओं चित्रित कर रहे हैं। सही पर, पहले और संवर्धन के बाद सेल आबादी की व्यवहार्यता के प्रतिशत के रूप में दिखाया जाता हैpropidium आयोडाइड (पीआई) -नकारात्मक कोशिकाओं। ± SEM मतलब है, डेटा (एबी) एन = 3 प्रयोग के प्रति के साथ 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा एक unpaired, दो पूंछ टी परीक्षण * पी <0.05, ** पी <0.005, *** पी <0.0001 का उपयोग कर की तुलना में थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: उच्च शुद्धता के साथ पूर्वज सबसेट की तरह प्रवाह cytometry। डॉट भूखंडों हल किया नमूने (पोस्ट-तरह) में सेल आबादी की पवित्रता को दर्शाती है। डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

= "1"> चित्रा 5
चित्रा 5: पाचन एंजाइमों की तुलना करें। एकल कोशिका निलंबन या कोलैजिनेज़ डी (चरण 2 में वर्णित) कोलैजिनेज़ पी का उपयोग कर तैयार किया गया था (1 मिलीग्राम / एमएल + DNase-मैं 0.1 मिलीग्राम / एमएल) स्वस्थ यकृत से और बाद में सतह मार्कर के एक पैनल के साथ सना हुआ था: CD45, CD31, CD133, और gp38 (ए)। प्रति जंगली प्रकार के इलाज जानवरों में CD45 नकारात्मक कोशिकाओं के बीच विभिन्न stromal सेल सबसेट के जिगर ऊतक के छ मौजूद कोशिकाओं के प्रतिशत दिखाए जाते हैं। (बी) CD133 की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता CD133 + सेल आबादी के लिए दिखाया गया है। ± SEM मतलब है, डेटा (एबी) एन = 3 प्रयोग के प्रति के साथ 2 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा एक unpaired, दो पूंछ टी परीक्षण * पी <0.05, ** पी <0.005, *** पी <0.0001 का उपयोग कर की तुलना में थे।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जिगर में सूजन और अलग मूल की चोट जिगर कि पूर्वज सेल विस्तार और सक्रियण 2, 3 के साथ कर रहे में पुनर्योजी प्रक्रियाओं को ट्रिगर। ये जिगर पूर्वज कोशिकाओं सेल स्टेम विशेषताओं के अधिकारी और संभावना विभिन्न यकृत रोगों के pathomechanism में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

जिगर पूर्वज कोशिकाओं की विविधता लंबे सुझाव दिया गया है। CD133 और gp38 के एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन का उपयोग कर सबसेट है कि अलग अलग सतह मार्कर ले जाने की पहचान करने और जिगर चोट 12 के दौरान सूजन से संबंधित जीन का एक अनूठा सेट व्यक्त कर सकता जिगर पूर्वज कैंपेन्स के पुनर्मूल्यांकन। विधि यहाँ वर्णित दुर्लभ कोशिकाओं के cytometry विश्लेषण प्रत्यक्ष प्रवाह और विभिन्न जिगर चोट मॉडल में उनके प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है। यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, विभिन्न चोटों के कई पूर्वज रों की सक्रियता के ट्रिगर के रूप मेंubsets कि ductular प्रतिक्रियाओं 3, 4, 11, 12 में मनाया सेलुलर विविधता को प्रतिबिंबित करता हो सकता है। विशेष रूप से, murine जिगर ऊतक (0.2 ग्राम) का एक छोटा सा अंश वर्णित विधि का उपयोग progenitors के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त है।

cytometry कैंपेन्स के उच्च शुद्धता आबादी उपलब्ध कराने छँटाई प्रवाह उनके अद्वितीय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का पता लगाने के लिए आवश्यक है। पिछली रिपोर्टों में वर्णित प्रवाह cytometry आधारित पूर्वज सेल अलगाव 15, 16। फिर भी, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अनुकूलित तरीका है कि उच्च शुद्धता और इन कोशिकाओं की व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है प्रदान करता है। विशेष रूप से, पहले से वर्णित इन विट्रो संवर्धन और विस्तार की तकनीक अच्छी तरह से यहाँ प्रस्तुत 15 प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है 16 अप।

Sorters प्रवाह cytometry से कई प्रकार के विभिन्न संस्थानों में उपलब्ध हैं, और उनके विशेष instrumentations थोड़ा अलग हो सकता है। फिर भी, सेल छँटाई के लिए सामान्य सिद्धांतों वर्णित प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं। आम तौर पर, एक कम दबाव और बड़ा नोक आकार की मशीन प्रकार और विशिष्टताओं के स्वतंत्र बिल्कुल जरूरी हैं। इसके अलावा, एक उचित छँटाई माध्यम के उपयोग काफी व्यवहार्यता और हल कोशिकाओं की शाही सेना गुणवत्ता है, जो एक महत्वपूर्ण कारक है, विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए बढ़ा सकते हैं। पूर्वज कोशिकाओं की छंटाई, हालांकि, बहुत सेल व्यवहार्यता कम कर देता है, और छंटाई के बाद कोशिकाओं की उपज अपेक्षाकृत कम है (7-10,000 घटनाओं / उप-जनसंख्या के उच्च शुद्धता प्रकार के लिए, 4-5 स्वस्थ यकृत जमा किए जाने की जरूरत है)। यह आगे इन विट्रो विश्लेषण के लिए एक सीमित कारक हो सकता है। हम सुझाव में लिए चुंबकीय microbead आधारित अलगावइन विट्रो assays, क्योंकि इसकी उच्च उपज और सेल व्यवहार्यता का, और प्रवाह जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए छंटाई, खासकर जब अधिक विनिर्दिष्ट सबसेट का विश्लेषण करती है और isolations की जरूरत है cytometry।

तथ्य यह है कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता बहुत छँटाई प्रवाह cytometry के बाद कम हो जाता है के आधार पर, पूर्वज कोशिकाओं के एक स्वचालित चुंबकीय microbead आधारित अलगाव विकसित की है और यहाँ प्रस्तुत किया गया है। यह उच्च शुद्धता (एकाधिक यकृत के संयोजन) के साथ पूर्वज कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के अलगाव के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखा है, क्योंकि समय के अलगाव की प्रक्रिया के लिए आवश्यक बहुत कम है। पूर्वज कोशिकाओं की कम संख्या विट्रो 1, 2, 15, 16 में विस्तार किया जा सकता है, यह विचार करने के लिए कैसे इन विट्रो में जोड़तोड़ स्टेम / PROGEN के सेलुलर सुविधाओं को बदल सकता है की सिफारिश की हैItor कोशिकाओं अन्य mesenchymal और stromal सेल आबादी 17, 18 के लिए वर्णित है।

प्रस्तुत चुंबकीय microbead आधारित अलगाव के प्रमुख सीमा है कि CD133 + और gp38 + सेल आबादी विषम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते है। अतिरिक्त सतह मार्कर छोटे सेल आबादी की पहचान करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

कैसे यकृत स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज एक दूसरे से संबंधित की समझ लोला रीड और दूसरों 1, 8, 19 से उत्कृष्ट अध्ययनों के बावजूद, पूरी नहीं हुई है। इस प्रकार, इस तरह यहाँ का सुझाव दिया एक के रूप में अधिक पैदावार और व्यवहार्यता, जिसके परिणामस्वरूप में तकनीक, की सावधानी से विचार पूर्वज कैंपेन्स के विश्लेषण और उनके परस्पर संबंधों की समझ का विस्तार करने में मदद कर सकता है।

कुल मिलाकर, हम वर्णन किया है टीवह अलगाव और जिगर पूर्वज सबसेट है कि हाल ही में 12 प्रतिष्ठित थे के विश्लेषण विस्तृत जानकारी दी। इसके अलावा, एक उपन्यास एंजाइम संयोजन को रोजगार से, दुर्लभ पूर्वज प्रत्यक्ष फ्लो का मापन द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे या तो सेल छँटाई या एक स्वचालित microbead आधारित तकनीक का उपयोग कर, एक उच्च शुद्धता के साथ पूर्वज कोशिकाओं को समृद्ध।

समस्या निवारण:

सेल मलबे के प्रतिशत और मर कोशिकाओं उच्च रहे हैं

तो पाचन (चरण 2) के दौरान, जिगर के नमूनों की pipetting भी कठोर है, एकल कोशिका निलंबन बढ़ जाती है में कोशिकाओं को मरने का प्रतिशत। जिगर सुझाव से बड़ा टुकड़ों में काट रहा है, पाचन कम कुशल है और तैयारी के दौरान और अधिक कोशिका मृत्यु में परिणाम है।

चरण 5 में प्रक्रिया पूरी करने के बाद नमूनों की शुद्धता के लिए पर्याप्त नहीं है

percen हैंएकल कक्ष निलंबन में सेल मलबे के tages और मर कोशिकाओं चरण 2 में तैयार बहुत अधिक हैं, microbeads unspecifically बाँध, और इसलिए, अलगाव की शुद्धता बहुत कम है।

बाद microbead आधारित शुद्धि कम सेल नंबर

वर्णित प्रोटोकॉल की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि microbeads के लिए कोशिकाओं का अनुपात इष्टतम, के रूप में प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है। अधिक microbeads का उपयोग पवित्रता को कम कर देता है और उपज और अलग कक्षों की व्यवहार्यता कम हो जाती है। प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की तुलना में अन्य सतह मार्कर पूर्वज सबसेट अलगाव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, microbeads के लिए कोशिकाओं का इष्टतम अनुपात निर्धारित किया जाना चाहिए।

Gp38 + CD133 के चुंबकीय microbead आधारित अलगाव - जनसंख्या

कदम खंड 5 में चरणों का पालन करें 5.3 चरण में अतिरिक्त 10 μL विरोधी CD133 + microbeads जोड़ने के लिए, तो पालन 5, 6.2 और 6.3 के रूप में वर्णनघ।

निरपेक्ष कक्ष संख्या की गणना

जिगर वजन की गणना करने के लिए कैसे एक निश्चित सबसेट के कई कोशिकाओं प्रति ग्राम जिगर ऊतक मौजूद हैं प्रयोग किया जाता है।

(जीवित कोशिकाओं में उप-जनसंख्या का% (से फ्लो के आधार पर) / 100) x कुल जीवित कोशिका जिगर का टुकड़ा = जेड से अलग नंबर

(जिगर के टुकड़े के 1 / वजन) x जेड = सेल नंबर / जी जिगर ऊतक

अन्य सेल आबादी है कि इस विधि के साथ अलग किया जा सकता

CD45 + कोशिकाओं (या hematopoietic कोशिकाओं के उप-जनसंख्या, जैसे Kupffer कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, आदि) और LSECs: यह निम्नलिखित जिगर की कोशिकाओं यह पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग अलग करना संभव है। पाचन प्रोटोकॉल hepatocytes या यकृत तारामय कोशिकाओं के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है। इन कोशिकाओं को अपेक्षाकृत कम सेल नंबर पर मौजूद हैं और वे othe की तुलना में कम व्यवहार्यता दिखानेr उपलब्ध तरीकों।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस काम के लिए VLK अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन Sofja Kovalevskaja पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1% stock solution
10% BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1,400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

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References

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अलगाव और लिवर पूर्वज उपसमुच्चय एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन द्वारा की पहचान की संवर्धन
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Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

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