Summary
lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.
Abstract
Durante a lesões crónicas do fígado, células progenitoras expandir num processo chamado de reacção ductular, o que também implica o aparecimento de infiltrado celular inflamatório e a activação da célula epitelial. A população de células progenitoras durante essas reações inflamatórias tem sido principalmente investigado utilizando marcadores de superfície individuais, quer por análise histológica, ou por fluxo de técnicas baseadas em citometria. No entanto, os novos marcadores de superfície identificados vários subconjuntos funcionalmente distintas dentro do progenitor fígado / haste compartimento da célula. O método aqui apresentado descreve o isolamento e análise de citometria de fluxo detalhado de subconjuntos progenitoras usando combinações novo marcador de superfície. Além disso, demonstra como os vários subconjuntos de células progenitoras pode ser isolado com pureza elevada utilizando métodos automatizados magnética e separação por FACS com base em. Importante, novos e enzimática simplificado dissociação do fígado permite o isolamento destas populações de células raras com uma alta viabilidadeque é superior em comparação com outros métodos existentes. Isto é especialmente relevante para o estudo de mais células progenitoras in vitro ou para o isolamento de ARN de alta qualidade para analisar o perfil de expressão do gene.
Introduction
A regeneração hepática é geralmente associada com a capacidade de auto-renovação de hepatócitos. No entanto, as lesões crónicas do fígado ocorrem com a activação de células progenitoras e de expansão, que têm sido associadas com a sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos e cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Isto é especialmente relevante porque, durante a lesões crónicas, a proliferação de hepatócitos não é eficaz. Apesar de vários estudos de rastreamento genético visando células progenitoras, o seu papel na regeneração hepática permanece controverso 5, 6, 7, 8. Além disso, a activação de células progenitoras tem sido associada ao aumento da resposta fibrótica no fígado, o que levanta dúvidas sobre a sua função exacta durante 9 lesões, 10.
A heterogeneidade do compartimento de células progenitoras tem sido sugerido por estudos de expressão gênica que isolaram células progenitoras expressam um único marcador de superfície usando microdissection ou célula métodos baseados em triagem 1, 11. De fato, recentemente, uma combinação marcador de superfície utilizando gp38 novel (podoplanina) inequivocamente marcadores individuais anteriores de células progenitoras para vários subconjuntos 12. É importante ressaltar que esses subgrupos não só diferem na sua expressão do marcador da superfície, mas também exibiram alterações funcionais durante a lesões 12.
Vários modelos animais têm sido utilizados para investigar a activação de células progenitoras e a regeneração do fígado. Parece que os vários tipos de lesões promover a activação de diferentes subconjuntos de células progenitoras 12. Isto pode explicar o pHdivergência enotypic da reacção ductular observada em seres humanos 4. Assim, os fenotípicas e funcionais análises complexas de células progenitoras são fundamentais para compreender o seu papel na lesões e o verdadeiro significado da reação ductular em doenças do fígado.
Além combinações de marcadores de superfície, as diferenças cruciais em protocolos de isolamento de células complicar ainda mais as conclusões baseadas em estudos anteriores 2. Uma quantidade substancial de estudos abordaram o papel das células progenitoras que diferem muito em sua protocolo de isolamento (por exemplo, a dissociação do fígado (combinação de enzimas e duração do processo), de média densidade e velocidade de centrifugação) 2. Uma técnica de isolamento otimizado, proporcionando uma melhor viabilidade para populações de células raras e reflexiva da composição subconjunto, foi desenvolvido e publicado recentemente 12. O objetivo deste artigo é fornecer uma forma mais detProtocolo ailed deste procedimento de isolamento de células do fígado e o subconjunto de análise para permitir a reprodução apropriada da técnica. Além disso, o protocolo inclui uma comparação com o método de isolamento anterior para demonstrar as diferenças em comparação com o novo protocolo.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação dos Comitês de Ética e de cuidados de animais da Universidade de Homburg Medical Center.
1. Preparação de Materiais e buffers
- Recém preparar todos os buffers necessários para a digestão do fígado utilizando componentes estéreis e uma capa laminar para evitar a contaminação bacteriana.
- Preparar o tampão de recolha (CB) através da mistura de 49,5 mL de meio RPMI e 0,5 mL de soro bovino fetal (FBS; baixa endotoxina, inactivado pelo calor) para conseguir uma solução a 1% (v / v). Guardar a solução em gelo até posterior utilização.
NOTA: Cerca de 25 ml de CB é necessário para digerir um fígado inteiro. - Preparar o tampão de digestão (DB), utilizando os seguintes ingredientes: meio RPMI, 1% (v / v) de FBS (baixa endotoxina, inactivado pelo calor), colagenase P (0,2 mg / mL), ADNase-I (0,1 mg / ml) , e dispase (0,8 mg / mL).
NOTA: Aproximadamente 25 ml de DB é necessário para digerir um fígado inteiro. Pré-aquecer o DB em tele 37 ° C banho de água antes do uso. - Reconstituir as enzimas à chegada em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS; collagense P e dispase) ou em ADNase-I de tampão (50% (v / v) de glicerol, 1 mM de MgCl2, e 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) , alíquota lo e armazená-lo a -20 ° C. Armazenar a ADNase-I de tampão a 4 ° C e usá-lo dentro de dois meses.
2. Preparação de fígado de suspensão de célula única
- Euthanize camundongos selvagens não tratados por deslocamento cervical, de acordo com a ética locais e os comités de cuidados de animais.
- Coloque os ratos em uma placa de dissecação e molhar a pele com etanol 70%. Com uma tesoura, abrir o abdómen com uma incisão na linha média da pele, seguido por uma incisão em Y para os membros. Abra o peritônio-se ao esterno usando a tesoura. A fim de descobrir o fígado, o intestino deslocar suavemente para o lado direito utilizando um cotonete.
- Com a ajuda de fórceps e tesouras, remover os lóbulos do fígado,deixando a vesícula biliar para trás, e evitar a contaminação com o tecido conjuntivo. Pesa-se o fígado e coloca-lo sobre gelo numa placa de Petri contendo HBSS.
- Colocar os lóbulos do fígado em uma placa de Petri, seco e cortar o tecido hepático em cubos homogéneos cerca de 2 mm de cada lado, usando um bisturi. Transferir as peças para um tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
- Adicionar 2,5 ml de DB para o tubo de centrífuga cónico de 15 ml, contendo os pedaços de fígado e colocá-lo num banho de água a 37 ° C para iniciar o processo de digestão (um fígado saudável leva 60-70 min e um fígado cirrótico leva 80-90 min ).
NOTA: Se um inteiro fígado está a ser digerida, o fígado deve ser separado em dois tubos de 15 ml de centrífuga cónico para garantir uma boa viabilidade celular. - Prepare um novo tubo cônico de centrífuga de 15 mL para coletar células hepáticas liberadas. Coloque uma poliamida de 100 mícrons de malha de filtro na parte superior do tubo e molhar a malha com 800 ul de CB. Colocar o tubo de centrífuga cónico em gelo.
- Misture a sampios no banho de água a 37 ° C, após 5 e 10 minutos, a fim de apoiar o processo de digestão por agitação do tubo cónico de centrifugação de 15 ml, contendo os pedaços de fígado.
- 15 min após o início da digestão, misture delicadamente os pedaços de fígado, utilizando uma pipeta de 1000 mL com uma ponta de corte que permite que os pedaços de fígado atravessar facilmente. Colocar os tubos de volta para o banho de água e permitir que as peças para resolver durante 2 min.
- Remover o sobrenadante contendo as células disseminadas (tipicamente 2 x 700 mL) e adicioná-lo ao tubo preparado no passo 2.6. Substitua o sobrenadante removido com DB (2x 700 mL) e colocá-lo de volta para o banho de água a 37 ° C.
- Repetir o procedimento descrito no passo 2.8 (tipicamente a 30, 40, 50, 55, e 60 min) até cerca de 60-70 min passaram desde o início da digestão. A partir de 40 min em diante, os pedaços de fígado restantes devem ser pequenas o suficiente para passar através de um sem cortes ponta da pipeta de 1000 mL.
NOTA: fígado saudável é Digested totalmente dentro de 60-70 min, enquanto fígado fibrótico normalmente precisa 80-90 min. Por este ponto do tempo, o tecido do fígado não deve ser visível no tubo cónico de centrifugação de 15 ml, contendo os pedaços de fígado, e todas as células libertadas deve ser transferida para dentro do tubo, preparado no passo 2.6. - No final do processo de digestão, recolher as células e centrifugar-los durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
- Ressuspender o sedimento de células em 1 mL de cloreto de amónio-potássio-(ACK) de tampão de lise e incubar-lo durante 1 min à temperatura ambiente, a fim de lisar as células vermelhas do sangue. Parar a reacção por adição de 5 mL de CB, e depois centrifugar as células durante 8 minutos a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2). Ressuspender as células em 4 ml de CB e armazená-los em gelo. Contar as células, tal como descrito no passo 3.
NOTA: O sedimento celular é solto, e, por conseguinte, o sobrenadante é pipetado distância em vez de ser decantado.3. A determinação do teor celular utilizando Citometria de Fluxo
NOTA: Para a determinação das contagens de células, um contador de células automatizado ou, idealmente, a quantificação das células à base de citometria de fluxo está descrito abaixo sugeridas em vez do método baseado em câmara clássica de Neubauer. A suspensão de uma única célula do fígado descrito no passo 2 contém células do parênquima e não-parenquimatosas (NPC) com muito diferentes tamanhos e granularities. A exclusão adequada de restos celulares em conjunto com o gating em dispersão para a frente, dispersão lateral (FSC-SSC) característica de NPCs quando se utiliza citometria de fluxo garante o sucesso do protocolo descrito 12.
- Prepara-se uma alíquota da suspensão de células do fígado (20 mL) e adicionar 174 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 6 uL de iodo de propídio (PI; concentração final de 0,375 ug / mL). Adicionar grânulos de contagem que permitem a quantificação das células.
- Portão em SSC-A-FSC-A para evitar detritos e excluir ainda mais dupletos utilizando FSC-H e FCS-A.
NOTA: É importante seguir a estratégia gating representada na Figura 2. - Portão para fora células mortas da PI-positivas, medir 30 mL de suas amostras, e gravar os eventos. Siga orientação do fabricante para calcular a contagem de células.
NOTA: Siga as etapas 4 de citometria de fluxo de medição, as etapas 5 e 6 para o isolamento de células progenitoras com base magnética, e os passos 7 para citometria de fluxo tipo de subpopulações progenitoras.
4. A coloração da suspensão de célula única de fígado para o Fow análise de citometria de Progenitor Subconjuntos
Anticorpo Clone Anfitrião / Isotype Concentração da [mg / ml] Diluição CD64 X54-5 / 7.1 IgG1, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Rato IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 IgG2b de rato, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rato IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 IgG policlonal de cabra 0,2 1: 100 podoplanina 2001/01/08 IgG hamster sírio 0,2 1: 1400 podoplanina 2001/01/08 IgG hamster sírio 0,5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 IgG1 de rato 0,03 3 mL CD133 315-2C11 Ig de ratoG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Rato IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rato IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 Rato IgG2b, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Rato IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Rato IgG2a, κ 0,03 10 ul Rato IgG2b, κ MPC-11 0,2 IgG1 de rato RTK2071 0,2 IgG2b de rato, κ RTK4530 0,2 Rato IgG2a, κ RTK2758 0,5 Rato IgG2a, κ RTK2758 0,2 IgG hamster sírio SHG-1 0,2 IgG hamster sírio SHG-1 0,5 Controle de cabra IgG normal IgG policlonal de cabra 1 IgG anti-cabra de burro IgG de burro 2 1: 800 estreptavidina 1 1: 400 Tabela 1.
Anticorpo 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 IgG2b de rato, κ
0,5 ul+ + + + CD31 Biotina + Rato IgG2a, κ
0,5 ul+ + + ASGPR1 purificado + + Controle de cabra IgG normal
0,2 mL+ + podoplanina APC + + + IgG hamster sírio
1 uL de uma diluição 1:14+ CD133 PE + + </ Td> + + IgG1 de rato
0,45 mLBurro anti-cabra
Alexa Fluor 488+ + + + + estreptavidina
Alexa Fluor 405+ + + + + Mesa 2.
- Colocar uma alíquota da suspensão de células a partir do passo 2.11 para um tubo de reacção (1,5 ml) contendo 2,5 x 10 5 células, determinados tal como descrito na etapa 3.
- Centrifugar as células durante 3 min a 300 xg e 4 ° C usando uma microcentrífuga.
NOTA: neste momento, uma bomba de vácuo pode ser utilizado para remover cuidadosamente o sobrenadante. - Ressuspender o sedimento de células em mistura de Fc-bloqueio e incubar durante 5 min em gelo. Prepare a mistura de Fc-bloco com um volume total de 50 L por mancha. Adicione 10 ul de reagente de FcR-bloqueio, 1 mL de anticorpos anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / mancha), e 40 uL de tampão de coloração (tampão de ST: HBSS, 1% (v / v) de FBS e 0,01% azida de sódio) por mancha.
NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Use equipamento de protecção individual adequado, como luvas de borracha nitrílica, um casaco de laboratório, e uma máscara facial. - Adicionar 50 uL de mistura de coloração das células (o volume total de células é agora de 100 uL) e incubar as células com a mistura de anticorpos, protegido da luz e de 20 min em gelo.
- Preparar a mistura de anticorpo com um volume total de 50 L por mancha. Para 50 ul de tampão de ST, adicione os seguintes anticorpos conjugados para coloração básica: CD45 (0,5 ul; 1: 200; 0,1 g / mancha), CD31 (0,5 ul; 1: 200; 0,25 g / mancha), ASGPR1 (1 mL ; 1: 100; 0,2 ug / mancha), podoplanina (1 ul de uma diluição de 1:14; 1: 1400 de diluição final; 0,014 ug / mancha) e CD133 (3 uL; 0,09 ug / mancha).
NOTA: Tabela1 resume os clones de anticorpos e diluições utilizadas para manchas básicas e de marcadores de superfície adicionais dos vários subgrupos. Preparar suspensões de células adicionais para a combinação de anticorpo contendo os controlos correspondentes de isotipo e / ou fluorescência menos um controlos (QOM), como representado na Tabela 2. - Adicionar 400 mL de tampão de ST para cada amostra e centrifuga-se as células durante 4 minutos a 300 xg e 4 ° C.Discard o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL de mistura de anticorpo secundário contendo 0,125 mL de IgG anti-cabra de burro (1: 800; 0,25 ug / mancha) e 0,25 ul de estreptavidina fluorescente conjugado (1: 400; 0,25 ug / mancha) em 100 mL de tampão de ST.
- Incubar as células, enquanto protegida da luz e com a mistura de anticorpos durante 20 min em gelo. Adicionar 400 uL de tampão de ST para cada amostra e centrifuga-se as células durante 4 minutos a 300 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 mL de ST lustreer contendo 0,25 ug / ml de PI.
NOTA: A viabilidade celular das células progenitoras diminui com o tempo; Portanto, sugere-se para medir amostras frescas o mais rapidamente possível.
5. Magnetic enriquecimento por Microbead de células progenitoras
- Transferir uma alíquota da suspensão de uma única célula do fígado contendo 1,5-2 x 10 6 células, com base na contagem de células foi determinada como descrito no passo 3, para um novo tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
- Centrifugar as células durante 8 minutos a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
NOTA: Tipicamente, uma C57BL / 6 de fígado de rato saudável (ou 1 g de tecido de fígado) terão de ser separados em três 15 mL tubo de centrífuga cónico. - Ressuspender as células em 400 uL de HBSS 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA) e adicionar 40 ul de microesferas anti-CD31 e 30 ul de microesferas anti-CD45. Incubam-se as células durante 15 min a 4 ° C.
NOTA: Não exceda tele tempo de incubação, como a pureza da separação será significativamente reduzido. - Adicionar 5 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA para as células e centrifugar-los durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
- Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de esferas de remoção de células mortas e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. No entanto, preparar uma coluna de separação de LS e a sua calibragem com 3 mL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA.
NOTA: Não exceda o tempo de incubação, como a pureza da separação será significativamente reduzido. - Adicionar 900 uL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA para as células, filtrá-los usando 100 mícrons de malha de filtro de poliamida, e carregá-los na coluna de separação LS.
NOTA: Carregue um fígado inteiro para uma coluna de separação LS. - Lava-se a coluna três vezes com 3 mL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA e recolher o fluxo de passagem.
- Centrifuga-se o fluxo de passagem de 8 min a 180 xg e 4 ° C (usando Acce reduzidaleration / 4 e desaceleração / 2).
- Ressuspender o sedimento de células, quer em tampão de lavagem (RB) (PBS e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) contendo BSA a 0,5% (v / v) ou tampão de ST, dependendo do procedimento experimental ulterior.
baseada em Microbead 6. Magnetic Automated celular purificação de subconjuntos de células progenitoras combinados de múltiplas Fígados
NOTA: Uma vez que os subconjuntos de células progenitoras representam populações de células raras, combinando células de vários fígados é muitas vezes necessária para atingir o número de células suficientes para novas experiências. Como um exemplo, CD133 + e gp38 + separação de células é descrita abaixo.
- Isolamento de células progenitoras CD133 +
- Após o passo 5.9, a contagem das células, como descrito no passo 3, e ressuspender até 10 6 células (tipicamente 4-6 agrupamento de amostras de fígado saudável) em 100 mL de RB.
- Adicionar anti-CD64 a 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 para as células e incubcomeu-os em gelo por 5 min. Adicionar 1: 100 de anticorpo biotinilado anti-CD133 para as células e incubar em gelo durante mais 10 min.
- Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
- Ressuspender as células em 400 uL de RB e adicionar 10 ul de microesferas anti-biotina. Incubar a amostra durante 15 min a 4 ° C. Não exceda o tempo de incubação, como o que reduz a pureza das amostras.
- Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2). Ressuspender o sedimento em 1 ml de RB.
- Isolamento de GP38 + progenitores
- Após o passo 5.9, a contagem das células, como descrito no passo 3, e ressuspender até 10 6 células (tipicamente 4-6 agrupamento de amostras de fígado saudável) em 100 mL de RB.
- Adicionar anti-CD64 a 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 para as células e incubar em gelo durante 5 min. Em seguida, adicione 1:100 anti-gp38 anticorpo biotinilado para as células e incubar em gelo durante mais 10 min.
- Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
- Ressuspender as células em 400 uL de RB e adicionam-se 5 ul de microesferas anti-biotina. Incubar a amostra durante 15 min a 4 ° C. Não exceda o tempo de incubação, como o que reduz a pureza das amostras.
- Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
- Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de RB.
- passos comuns após o passo 6.1 ou 6.2
- Colocar o tubo de centrífuga cónico de 15 ml contendo as suspensões de células marcadas magneticamente sobre uma cremalheira 5 frio com dois tubos vazios adicionais para a recolha das fracções positivas e negativas. Coloque a cremalheira frio sobre a plataforma de separação do separador.
- Utilize o programa de selecção positiva(Possel_d2) com um passo de lavagem extensiva entre cada amostra (opção de lavagem).
Nota: O uso de separação manual baseado na coluna de células, em vez do separador automático irá reduzir a pureza da amostra. - Recolher a fracção positiva e centrifuga-se durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
- Ressuspender o sedimento de células, quer em tampão RB ou ST, dependendo do procedimento experimental ulterior.
- Para uma verificação de pureza, tomar uma alíquota das células e mancham-los conforme descrito na etapa 4.
7. Citometria de Fluxo Seleção celular
NOTA: Uma elevada pureza tipo de qualquer subconjunto de células progenitoras pode ser obtida com o protocolo descrito abaixo. O rendimento total de células é muito inferior à que se descreveu no passo 6 e é melhor para a análise de expressão génica.
Parâmetro Configuração Bico Tamanho 85 uM Freqüência 46,00-46,20 Amplitude 38,30-55,20 Estágio 0 gota Delay 28,68-28,84 Atenuação Fora primeiro Gota 284-297 alvo Gap 9.-14 Pressão 45 psi Tabela 3.
- Adquirir células do enriquecimento magnético à base de (descrito na etapa 5); contá-los, tal como descrito no passo 3; e mancham-los para os marcadores progenitoras (CD133, gp38), CD31, e CD45 ASGPR1, tal como explicado no passo 4.
- Prepare triagem médio (SM): fenol-vermelho livre DulbecMeio de modificação co de Eagle (DMEM) contendo 0,5% (v / v) de BSA e 0,01% (v / v) de azida de sódio. Volte a suspender as células coradas em SM, transferi-los para um tubo de polipropileno de fundo redondo de, e colocá-los no gelo.
NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Use equipamento de protecção individual adequado, como luvas de borracha nitrílica, um casaco de laboratório, e uma máscara facial. Não utilizar azida de sódio se as células escolhidas são utilizadas para ensaios funcionais. - Usar o software apropriado para o tipo de classificador utilizado para o isolamento de células. Abra o software e seguir as instruções do fabricante para configurar os parâmetros de classificação e especificações da máquina.
NOTA: As especificações da máquina encontram-se resumidos na Tabela 3. Apesar das especificações da máquina poderia ser diferente em diversas instituições, é importante notar que a redução de pressão de triagem e de um tamanho maior do bico é necessário (45 psi e bocal 85 uM) para aumentar a viabilidade da célula progenitora populatde iões e a qualidade do ARN preparado a partir das células separadas. É importante a utilização de células progenitoras do fígado enriquecido para definir a compensação. Outras populações de fígado ou leucócitos têm diferentes auto-fluorescência e resultado numa resolução subóptima de a população estromal e em uma estratégia gating falsa. - Calibrar a máquina e colocar um tubo de fundo redondo de 5 mL de polipropileno contendo 350 mL de SM no dispositivo de recolha de classificação. Comece a aquisição de amostras e classificar. Recolha 1.000 eventos da subpopulação e parar o fluxo da amostra.
- Pegue o tubo para fora do dispositivo de classificação e medir as células ordenadas no citômetro de fluxo. Identificar a percentagem da população celular classificada presente entre as células vivas. Esta percentagem dá a pureza das células separadas.
- Se a pureza tipo excede 95%, colocar um tubo de fundo redondo de 5 mL de polipropileno contendo 350 mL de tampão de lise RLT no dispositivo de recolha de classificação.
- Comece o tipo e recolher 7.00010000 eventos por subpopulação estromal.
- Transferir o tampão de lise contendo RLT as células separadas em um tubo de reacção e DNase isenta de RNase e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até análise posterior.
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Representative Results
O procedimento aqui apresentado para a digestão do fígado utilizando uma nova mistura de enzimas resulta numa suspensão de uma única célula contendo parenquimatosa do fígado e células não-parenquimatosas (Figuras 1 e 2a). Após a lise ACK-de células vermelhas do sangue, o fluxo directo análise de citometria da suspensão de célula única é possível (Figuras 1 e 2). A estratégia envolve a propagação de exclusão de dupletos e células mortas (Figura 2A). As células que são negativas para CD45, CD31, e ASGPR1 está fechado. Esta população inclui as células progenitoras do fígado e podem ser agrupados com base na sua expressão de GP38 e CD133 (Figura 2a). Os gp38 + CD133 + e gp38 - As células CD133 + representam as populações mais abundantes células entre CD45 - CD31 - ASGPR1 - células do liv saudável do rato adultoer (Figura 2a, b). Estes subconjuntos diferem na expressão dos marcadores de superfície adicionais associados anteriormente com células progenitoras, tais como EpCAM, Sca-1 e CD34 (Figura 2c).
Células progenitoras pode ser empobrecido a partir de células hematopoiéticas e do parênquima, tais como hepatócitos e células endoteliais hepáticas sinusoidais (LSECs) (Figuras 1 e 3), e as células progenitoras pode ser adicionalmente purificado com isolamento baseada em microesferas magnéticas (figura 3a, b) ou com de alta pureza triagem (Figuras 1 e 4). O isolamento à base de microesferas magnéticas de CD133 + ou GP38 + células resulta em mais de 90% de pureza (figura 3a, b) em relação a quaisquer células contaminantes CD45, CD31, ou ASGPR1 +, e as células continuam a ser altamente viáveis (figura 3a, b).
2. Isto é especialmente relevante para a escolha da mistura de enzimas utilizadas para a dissociação de tecidos. Aqui, colagenase P em vez de colagenase D foi utilizado para o fígado 1, 2, 8. É importante notar, o nível de expressão de CD133 nas células progenitoras e o rendimento de populações de células isoladas foram grandemente reduzida na presença de colagenase D (Figura 5a, b). Em adição a isto, a mistura continha dispase, que é altamente adequada para a desagregação suave e repicagem de vários tipos de células 13. Colagenase P em conjunto com dispase representauma combinação ideal para a dissociação de células do fígado para a análise de células progenitoras. Esta combinação foi também superior à tripsina ou de digestão à base de pronase do fígado (dados não mostrados). É igualmente importante notar que a centrifugação de densidade, como o enriquecimento base de Percoll-2, 14, não era necessário para o progenitor análises apresentadas neste protocolo.
Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo descrito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: classificação Novel de subconjuntos progenitoras do fígado. Um de uma única célulasuspensão foi preparada a partir de fígados saudáveis e subsequentemente coradas com um painel de marcadores de superfície: CD45, CD31, CD133 e gp38 (A). Para a exclusão de células mortas, foi utilizado iodeto de propídio (PI). gráficos de pontos representativos com a estratégia de gating são retratados. Os portões utilizados para citometria de fluxo determinação da contagem de células são também marcados. (B) As percentagens e o número absoluto de células presentes por g de tecido de fígado das várias subpopulações de células estromais entre as células CD45-negativo no tipo selvagem são mostrados os animais não tratados. (C) Os histogramas apresentam características distintivas marcador de subpopulações de células do estroma em um fígado saudável. Alta expressão de CD90.2 e a presença de CD157 são específicos para A, enquanto que CD34 é específico para a subpopulação B. Sca-1 está presente em B, C, D e EpCAM só está presente na população C e D. Média ± SEM; os dados (AC) representam 2-3 experimentos independentes com n = 3-4 por experimento. O wer dadose comparados usando um não emparelhado, bicaudal T test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: enriquecimento baseada microbead magnética e purificação de células automatizado. (A) o enriquecimento baseada microbead magnética do CD45 -, CD31 - e ASGPR1 - células são retratados antes e depois de enriquecimento. (B) gráficos de pontos representativos dos isolamentos de células à base de microbead automatizados estão representados por CD133 + e GP38 + células, do lado esquerdo. No lado direito, a viabilidade das populações de células antes e após o enriquecimento são apresentados como a percentagem deiodeto de propídio (PI) células -negativas. Média ± SEM; os dados (AB) representam 3 experimentos independentes com n = 3 por experimento. Os dados foram comparados usando um não emparelhado, bicaudal T test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A citometria de fluxo tipo de subconjuntos progenitoras com elevado grau de pureza. Os gráficos de pontos mostram a pureza das populações de células em amostras seleccionadas (pós-classificação). Os dados representam 3 experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5: Comparação de enzimas de digestão. A suspensão de célula única foi preparado utilizando colagenase P (tal como descrito no passo 2) ou colagenase D (1 mg / ml + ADNase-I 0,1 mg / ml) a partir de fígados saudáveis e foi subsequentemente coradas com um painel de marcadores de superfície: CD45, CD31, CD133, e gp38 (A). As percentagens de células presentes por g de tecido de fígado das várias subpopulações de células estromais entre as células CD45-negativo no tipo selvagem são mostrados os animais não tratados. (B) A intensidade de fluorescência média das células CD133 é descrito para a população de células CD133 +. Média ± SEM; os dados (AB) representam 2 experimentos independentes com n = 3 por experimento. Os dados foram comparados usando um não emparelhado, bicaudal T test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Inflamação do fígado e lesões de diferentes origens desencadear processos regenerativos no fígado que são acompanhados pela expansão de células progenitoras e ativação 2, 3. Estas células progenitoras do fígado possuem características de células-tronco e provavelmente desempenham um papel importante no mecanismo patológico de várias doenças do fígado.
A heterogeneidade das células progenitoras do fígado tem sido sugerida. A reavaliação de subconjuntos progenitoras do fígado, utilizando uma combinação de superfície do marcador novela de CD133 e gp38 poderiam identificar subgrupos que carregam diferentes marcadores de superfície e expressar um conjunto único de genes relacionados com a inflamação durante a lesão hepática 12. O método descrito aqui permite o fluxo directo análise de citometria de células raras e a sua comparação directa em vários modelos de lesão do fígado. Isto é especialmente relevante, como várias lesões desencadear a activação de múltiplos progenitoras subsets que poderiam ser reflexo da heterogeneidade celular observada em reações ductulares 3, 4, 11, 12. Notavelmente, uma pequena fracção de tecido do fígado de murino (0,2 g) é suficiente para isolar as células suficientes para a análise de citometria de fluxo de células progenitoras, utilizando o método descrito.
A citometria de fluxo de classificação proporcionando populações de alta pureza dos subconjuntos é necessário explorar seus perfis de expressão genética exclusivos. Relatórios anteriores fluxo descrito baseado em citometria de isolamento de células progenitoras 15, 16. No entanto, o protocolo aqui apresentado fornece um método optimizado que garanta a pureza elevada e a viabilidade destas células. Notavelmente, in vitro de cultivo e expansão técnicas descritas anteriormente pode ser bem combinado com o protocolo apresentado aqui 15
Muitos tipos de citometria de fluxo classificadores estão disponíveis em várias instituições, e as suas instrumentações particulares podem ser ligeiramente diferentes. No entanto, os princípios gerais para separação de células são apresentados no protocolo descrito. Geralmente, uma pressão mais baixa e maior tamanho do bico são absolutamente necessários, independente dos tipos e especificações da máquina. Além disso, a utilização de um meio de classificação adequada pode aumentar significativamente a viabilidade e a qualidade do RNA das células separadas, o que é um factor importante, em particular para estudos de expressão génica. A triagem das células progenitoras, no entanto, reduz significativamente a viabilidade celular, e o rendimento das células após separação é relativamente baixa (em alta pureza tipo de 7-10,000 eventos / subpopulação, 4-5 fígados saudáveis devem ser agrupados). Este poderia ser um fator limitante para mais análises in vitro. Sugerimos isolamento baseada em microesferas para magnética emOs ensaios in vitro, por causa do seu mais elevado rendimento e a viabilidade celular, e triagem de citometria de fluxo para análise da expressão do gene, especialmente quando especificado subconjunto mais análises e isolamentos são necessários.
Com base no facto de que a viabilidade das células é grandemente reduzida após a triagem de citometria de fluxo, um isolamento à base de microesferas magnéticas automatizado de células progenitoras foi desenvolvido e apresentado aqui. Ele permite o isolamento de um maior número de células progenitoras com elevado grau de pureza (da combinação de várias fígados). Além disso, a viabilidade das células é mantida, uma vez que o tempo necessário para o processo de isolamento é grandemente reduzida. Embora os números mais baixos de células progenitoras podem ser expandidas in vitro 1, 2, 15, 16, recomenda-se considerar como essas manipulações in vitro poderiam alterar as características celulares de haste / ProgenItor células descrito para outros mesenquimais e células do estroma populações 17, 18.
A principal limitação do isolamento à base de microbead magnética apresentada é que o CD133 + e as populações GP38 + celulares representam células heterogêneas. marcadores de superfície adicionais podem ser necessárias para identificar populações de células mais pequenas.
A compreensão de como as células-tronco hepáticas e progenitores se relacionam entre si está longe de ser completa, apesar de excelentes estudos realizados por Lola Reid e outros 1, 8, 19. Assim, a consideração cuidadosa das técnicas, resultando em maior produção e viabilidade, como o sugerido aqui, poderia ajudar a ampliar as análises de subgrupos progenitoras e a compreensão de seus relacionamentos interligados.
No geral, nós descrevemos tele detalhou o isolamento e análise de subconjuntos progenitoras do fígado que foram recentemente distinguidos 12. Além disso, através do emprego de uma combinação nova enzima, progenitores raros puderam ser analisados por meio de medições de citometria de fluxo directo. Além disso, o protocolo demonstra a forma de enriquecer as células progenitoras, com uma pureza elevada, utilizando separação de células ou uma técnica baseada em microesferas automatizado.
Solução de problemas:
As percentagens de detritos celulares e as células moribundas são elevados
Se, durante a digestão (passo 2), a pipetagem de amostras de fígado é muito dura, a percentagem de células que morrem na suspensão aumenta de uma única célula. Se o fígado é cortado em pedaços maiores do que o sugerido, a digestão é menos eficiente e resulta em mais morte celular durante a preparação.
Após completar o procedimento no passo 5, a pureza das amostras não é suficiente
Se as percentagens de fragmentos de células e células que morrem na suspensão de uma única célula, preparado no passo 2 são demasiado elevados, as microesferas se ligam não especificamente, e, portanto, a pureza do isolamento é grandemente reduzida.
Baixo número de células após a purificação baseada em microesferas
Para o sucesso do protocolo descrito, é importante que a proporção de células de micropérolas é óptimo, tal como sugerido no protocolo. Utilizando mais micropérolas reduz a pureza e diminui o rendimento e a viabilidade das células isoladas. Se diferentes das apresentadas no protocolo de marcadores de superfície são usadas para o isolamento de células progenitoras subconjunto, deve ser determinada a proporção óptima de células de micropérolas.
Isolamento magnético microbead base de gp38 + CD133 - população
Siga os passos na secção 5. No passo 5.3 adicionar adicionalmente 10 mL anti-CD133 + microbeads, em seguida, siga os passos 5, 6.2 e 6.3 como descreverd.
Calcular o número de células absolutas
O peso do fígado é utilizado para calcular o número de células de um determinado subconjunto estão presentes por grama de tecido de fígado.
(% Da subpopulação de células vivas (baseado em citometria de fluxo) / 100) x número total de células de estar isolado a partir do pedaço de fígado = Z
(1 / peso da peça fígado) x Z = número de células do tecido do fígado / g
Outras populações celulares que podem ser isolados com este método
É possível isolar as seguintes células do fígado, usando este protocolo: digestão células CD45 + (ou sub-populações de células hematopoiéticas, por exemplo, células de Kupffer, células dendríticas, células T, células NK, etc.) e LSECs. O protocolo de digestão não é adequado para o isolamento de hepatócitos ou células estreladas hepáticas. Estas células estão presentes em números de células relativamente baixas e que mostram a viabilidade reduzida em comparação com outrr métodos disponíveis.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Alexander von Humboldt Foundation Award Sofja Kovalevskaja a VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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