Summary
lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.
Abstract
Pendant les blessures chroniques du foie, les cellules progénitrices se développer dans un processus appelé réaction canalaire, ce qui implique également l'apparition de infiltrat cellulaire inflammatoire et l'activation des cellules épithéliales. La population de cellules souches au cours de telles réactions inflammatoires a surtout été étudié en utilisant des marqueurs de surface uniques, soit par une analyse histologique ou par des techniques à base de cytométrie en flux. Cependant, de nouveaux marqueurs de surface identifiés divers sous-ensembles fonctionnellement distinctes au sein de l'ancêtre du foie / tige compartiment cellulaire. La méthode présentée ici décrit l'isolement et organigramme détaillé cytométrie analyse des sous-ensembles progénitrices en utilisant des combinaisons de marqueurs roman de surface. En outre, il montre comment les différents sous-ensembles de cellules progénitrices peuvent être isolés par des méthodes de tri de haute pureté en utilisant automatisé magnétique et FACS. Surtout, nouveau et simplifié dissociation enzymatique du foie permet l'isolement de ces populations de cellules rares avec une viabilité élevéequi est supérieure en comparaison avec d'autres méthodes existantes. Ceci est particulièrement pertinent pour étudier davantage les cellules progénitrices in vitro ou pour l' isolement de l' ARN de haute qualité pour analyser le profil d'expression génique.
Introduction
La régénération hépatique est principalement associée à la capacité d'auto-renouvellement des hépatocytes. Néanmoins, les lésions chroniques du foie se produisent avec l' activation des cellules progénitrices et l' expansion, qui ont été associés à leur capacité à se différencier en hépatocytes et cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Ceci est particulièrement pertinent parce que, au cours des blessures chroniques, la prolifération des hépatocytes est pas efficace. En dépit de nombreuses études de traçage génétique ciblant les cellules souches, leur rôle dans la régénération du foie reste controversée 5, 6, 7, 8. En outre, l'activation des cellules progénitrices a été liée à une augmentation de la réponse fibrotique dans le foie, ce qui soulève des questions quant à leur rôle exact pendant 9 blessures, 10.
Le caractère hétérogène du compartiment de cellules progénitrices a longtemps été suggérée par des études d'expression génique , qui isole des cellules progénitrices exprimant un marqueur de surface unique en utilisant une microdissection ou une cellule méthodes basées sur le tri 1, 11. En effet, tout récemment, une nouvelle combinaison de marqueurs de surface à l' aide gp38 (podoplanin) lié sans équivoque des marqueurs individuels précédents de progéniteurs de 12 différents sous - ensembles. Surtout, ces sous - ensembles non seulement diffèrent par leur expression de marqueurs de surface , mais aussi présentaient des altérations fonctionnelles pendant 12 blessures.
Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour étudier l'activation des cellules progénitrices et la régénération du foie. Il semble que les différents types de blessures favorisent l'activation des sous - ensembles de cellules souches 12 différentes. Cela pourrait expliquer le phdivergence enotypic de la réaction ductulaire observée chez les humains 4. Ainsi, les analyses phénotypiques et fonctionnels complexes de cellules progénitrices sont essentiels pour comprendre leur rôle dans les blessures et la vraie signification de la réaction canalaire dans les maladies du foie.
Outre les combinaisons de marqueurs de surface, les différences cruciales dans les protocoles d'isolement de cellules compliquent encore davantage les conclusions fondées sur des études antérieures 2. Une quantité importante d'études a évoqué le rôle des cellules progénitrices qui diffèrent grandement dans leur protocole d'isolement (par exemple, la dissociation du foie (combinaison de l' enzyme et la durée du processus), de densité moyenne, et la vitesse de centrifugation) 2. Une technique d'isolation optimisée, offrant une meilleure viabilité des populations de cellules rares et de réflexion de la composition du sous - ensemble, a été développé et publié récemment 12. Le but de cet article est de fournir un plus detailed protocole de la procédure d'isolement des cellules du foie et de l'analyse du sous-ensemble pour permettre une bonne reproduction de la technique. En outre, le protocole comprend une comparaison avec la méthode d'isolement préalable pour démontrer les différences par rapport au nouveau protocole.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été menées avec l'approbation des comités d'éthique et de soins aux animaux de University Medical Center Homburg.
1. Préparation des matériaux et Tampons
- Fraîchement préparer tous les tampons nécessaires à la digestion du foie en utilisant des composants stériles et une hotte laminaire pour éviter toute contamination bactérienne.
- Préparer le tampon de collecte (CB) en mélangeant 49,5 ml de milieu RPMI et 0,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS; endotoxine faible, inactivé à la chaleur) pour atteindre 1% (v / v). Conserver la solution sur de la glace jusqu'à son utilisation ultérieure.
NOTE: Environ 25 ml de CB est nécessaire pour digérer toute une foie. - Préparer le tampon de digestion (DB) à l'aide des ingrédients suivants: milieu RPMI, 1% (v / v) de FBS (faible endotoxine, inactivé par la chaleur), la collagénase P (0,2 mg / ml), de DNase I (0,1 mg / mL) et la dispase (0,8 mg / ml).
NOTE: Environ 25 ml de DB est nécessaire pour digérer toute une foie. Préchauffer la DB en til 37 ° C bain d'eau avant utilisation. - Reconstituer les enzymes à l' arrivée dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS; collagense P et dispase) ou dans DNase I tampon (50% (v / v) de glycérol, MgCl2 1 mM et Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) , aliquoter, et le stocker à -20 ° C. Rangez la DNase I tampon à 4 ° C et l'utiliser dans les deux mois.
2. Préparation du foie unicellulaire Suspension
- Euthanasier non traitées des souris de type sauvage par dislocation cervicale, conformément à l'éthique et comités locaux de protection des animaux.
- Placez la souris sur une planche de dissection et mouiller la fourrure avec 70% d'éthanol. À l'aide des ciseaux, ouvrir l'abdomen avec une incision médiane de la peau, suivie par une incision en Y vers les branches. Ouvrir le péritoine jusqu'au sternum, à l'aide des ciseaux. Afin de découvrir le foie, déplacer l'intestin doucement sur le côté droit en utilisant un coton-tige.
- Avec l'aide de ciseaux et des pinces, retirer les lobes du foie,en laissant la vésicule biliaire arrière, et éviter une contamination par du tissu conjonctif. Peser le foie et le placer sur la glace dans une boîte de Pétri contenant HBSS.
- Placez les lobes du foie sur une boîte de Pétri sec et couper le tissu du foie en cubes homogènes environ 2 mm d'un côté à l'aide d'un scalpel. Transférer les morceaux dans un tube de centrifugation conique de 15 ml.
- Ajouter 2,5 mL de DB au tube conique centrifugeuse de 15 ml contenant les morceaux de foie et de le placer dans un bain d'eau à 37 ° pour démarrer le processus de digestion (un foie sain prend 60-70 min et un foie cirrhotique prend 80-90 min ).
REMARQUE: si l'ensemble de foie est une digérée, le foie doit être scindé en deux tubes de 15 ml centrifugeuse conique pour assurer une bonne viabilité des cellules. - Préparer un nouveau tube conique centrifugeuse de 15 ml pour recueillir des cellules hépatiques libérés. Placer un polyamide 100 um filtre maille sur la partie supérieure du tube et mouiller le maillage avec 800 ul de CB. Placer le tube de centrifugeuse conique sur la glace.
- Mélanger le samples dans le bain d'eau à 37 ° C après 5 et 10 min afin de soutenir le processus de digestion en secouant le tube conique centrifugeuse de 15 ml contenant les morceaux de foie.
- 15 min après le début de la digestion, mélanger délicatement les morceaux de foie en utilisant une pipette de 1000 pi avec une pointe de coupe qui permet aux morceaux de foie de passer facilement. Placer les tubes dans le bain d'eau et laisser les pièces se déposer pendant 2 min.
- Retirer le surnageant contenant les cellules disséminées (typiquement 2x 700 pi) et l'ajouter au tube préparé à l'étape 2.6. Remplacer le surnageant enlevé avec DB (2x 700 pi) et placez-le dans le bain d'eau à 37 °.
- Répétez la procédure décrite à l'étape 2.8 (typiquement à 30, 40, 50, 55, et 60 min) jusqu'à environ 60-70 min se sont écoulées depuis le début de la digestion. De 40 min avant, les morceaux de foie restants devraient être assez petit pour passer à travers une pointe non coupée de la pipette de 1000 pi.
NOTE: le foie sain est digested pleinement dans 60-70 min, tandis que le foie fibrotique a besoin typiquement 80-90 min. Par ce point de temps, le tissu hépatique ne devrait pas être visible dans le tube de centrifugeuse de 15 ml conique contenant les morceaux de foie, et toutes les cellules libérées doit être transféré dans le tube préparé à l'étape 2.6. - A la fin du processus de digestion, de recueillir les cellules et de les centrifuger pendant 8 min à 180 x g et 4 ° C (en utilisant réduite d'accélération / décélération et 4/2).
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de chlorure d'ammonium et de potassium (ACK) de tampon de lyse et on incube pendant 1 min à température ambiante afin de lyser les globules rouges. Arrêter la réaction en ajoutant 5 ml de CB, puis centrifuger les cellules pendant 8 minutes à 180 x g et 4 ° C (en utilisant réduite d'accélération / décélération et 4/2). Resuspendre les cellules dans 4 ml de CB et de les stocker sur la glace. Compter les cellules, tel que décrit dans l'étape 3.
NOTE: Le culot cellulaire est lâche, et donc le surnageant est pipeté loin au lieu d'être décanté.3. Détermination de la numération des cellules par cytométrie en flux
NOTE: Pour déterminer le nombre de cellules, un compteur de cellules automatique ou, idéalement, la quantification des cellules à base de cytométrie de flux décrit ci-après est proposée au lieu de la méthode classique à base en forme de chambre de Neubauer. La suspension du foie une seule cellule décrite à l'étape 2 contient parenchymateuses et non parenchymateuses cellules (NPC) avec des tailles et des granularités grandement différentes. L'exclusion appropriée des débris cellulaires ainsi que le déclenchement sur diffusion vers l' avant, la dispersion latérale (FSC-SSC) caractéristique des PNJ lors de l' utilisation de cytométrie en flux assure le succès du protocole décrit 12.
- Préparer une aliquote de la suspension de cellules du foie (20 pl) et ajouter 174 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et 6 ul d'iodure de propidium (PI; concentration finale de 0,375 ug / ml). Ajouter des perles de comptage qui permettent la quantification des cellules.
- Gate SSC-A-FSC-A afin d'éviter les débris et les exclure encore doublets utilisant FSC-H et FCS-A.
NOTE: Il est important de suivre la stratégie de déclenchement représentée sur la figure 2. - Porte sur les cellules mortes PI-positives, mesurent 30 pi de vos échantillons, et d'enregistrer les événements. Suivez les directives du fabricant pour calculer le nombre de cellules.
REMARQUE: Suivez les étapes 4 pour cytométrie en flux mesure, les étapes 5 et 6 pour l'isolement de cellules progénitrices à base magnétique, et les étapes 7 cytométrie de flux sorte de sous-populations progénitrices.
4. Coloration du foie Suspension unique cellule pour la Fow cytométrie Analyse des progéniteurs des sous-ensembles
Anticorps Cloner Hôte / Isotype Stock Concentration [mg / ml] Dilution CD64 X54-5 / 7.1 Mouse IgG1, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Rat IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 IgG2b de rat, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rat IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 Polyclonaux IgG de chèvre 0,2 1: 100 podoplanin 1/8/2001 Hamster syrien IgG 0,2 1: 1400 podoplanin 1/8/2001 Hamster syrien IgG 0,5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 Rat IgG1 0,03 3 ul CD133 315-2C11 Ig de ratG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Rat IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 Souris IgG2b, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Rat IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Rat IgG2a, κ 0,03 10 ul Souris IgG2b, κ MPC-11 0,2 Rat IgG1 RTK2071 0,2 IgG2b de rat, κ RTK4530 0,2 Rat IgG2a, κ RTK2758 0,5 Rat IgG2a, κ RTK2758 0,2 Hamster syrien IgG SHG-1 0,2 Hamster syrien IgG SHG-1 0,5 Contrôle Goat IgG normale Polyclonaux IgG de chèvre 1 Âne anti-IgG de chèvre âne IgG 2 1: 800 Streptavidin 1 1: 400 Tableau 1.
Anticorps 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 IgG2b de rat, κ
0,5 ul+ + + + CD31 Biotin + Rat IgG2a, κ
0,5 ul+ + + ASGPR1 purifié + + Contrôle Goat IgG normale
0,2 pi+ + podoplanin APC + + + Hamster syrien IgG
1 ul d'une dilution 1:14+ CD133 PE + + </ Td> + + Rat IgG1
0,45 piÂne anti-chèvre
Alexa Fluor 488+ + + + + Streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tableau 2.
- Placer une aliquote de la suspension cellulaire de l' étape 2.11 dans un tube de réaction (1,5 ml) contenant 2,5 x 10 5 cellules, déterminée comme décrit dans l' étape 3.
- Centrifuger les cellules pendant 3 minutes à 300 x g et à 4 ° C en utilisant une microcentrifugeuse.
NOTE: A ce stade, une pompe à vide peut être utilisé pour retirer soigneusement le surnageant. - Remettre en suspension le culot cellulaire dans Fc-bloc mélange et on incube pendant 5 minutes sur de la glace. Préparer Fc-bloc mélange avec un volume total de 50 ul par tache. Ajouter 10 ul de réactif FcR-bloquant, 1 ul de purifié anti- CD64 (1: 100; 0,5 pg / tache) et 40 pi de tampon de coloration (tampon ST: HBSS à 1% (v / v) de FBS et 0,01% azoture de sodium) par tache.
NOTE: L'azoture de sodium est très toxique. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié, tels que des gants en nitrile, une blouse de laboratoire, et un masque facial. - Ajouter 50 ul de mélange de coloration dans les cellules (le volume total de cellules est maintenant de 100 ul) et incuber les cellules avec le mélange d'anticorps, à l'abri de la lumière et pendant 20 minutes sur de la glace.
- Préparer le mélange d'anticorps avec un volume total de 50 ul par tache. Pour 50 pi de ST tampon, ajouter les anticorps suivants conjugués pour la coloration de base: CD45 (0,5 pi; 1: 200; 0,1 pg / tache), CD31 (0,5 pi; 1: 200; 0,25 pg / tache), ASGPR1 (1 pi ; 1: 100; 0,2 pg / tache), podoplanin (1 pi d'une dilution 1:14; dilution 1: 1400 de fin; 0,014 pg / tache), et CD133 (3 pi; 0,09 pg / tache).
NOTE: Le tableau1 résume les clones et les dilutions utilisées pour les taches de base et pour les marqueurs de surface supplémentaires des différents sous - ensembles d' anticorps. Préparer des suspensions de cellules supplémentaires pour le mélange d'anticorps contenant les témoins isotypes correspondants et / ou de la fluorescence moins un témoin (COM), comme cela est représenté dans le tableau 2. - Ajouter 400 ul de tampon ST à chaque échantillon et centrifuger les cellules pendant 4 min à 300 x g et 4 ° C.Discard le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de mélange d'anticorps secondaire contenant 0,125 pi d'âne IgG anti-chèvre (1: 800; 0,25 pg / tache) et 0,25 pi de streptavidine fluorescente conjuguée (1: 400; 0,25 pg / tache) dans 100 ul de tampon ST.
- Incuber les cellules tout en étant protégé de la lumière et avec le mélange d'anticorps pendant 20 minutes sur la glace. Ajouter 400 pi de ST tampon pour chaque échantillon et centrifuger les cellules pendant 4 min à 300 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 300 pi de ST buffer contenant 0,25 pg / mL PI.
REMARQUE: La viabilité cellulaire des cellules souches diminue avec le temps; par conséquent, il est suggéré de mesurer des échantillons frais le plus rapidement possible.
5. Magnetic Enrichissement base Microbead-des cellules progénitrices
- Transférer une aliquote de la suspension du foie unicellulaire contenant 1,5-2 x 10 6 cellules, sur la base du nombre de cellules déterminées comme décrit dans l' étape 3, dans un nouveau tube conique de centrifugeuse de 15 ml.
- Centrifuger les cellules pendant 8 minutes à 180 x g et 4 ° C (en utilisant réduite d'accélération / décélération et 4/2).
NOTE: En règle générale, une souris C57BL / 6 de foie de souris en bonne santé (ou 1 g de tissu hépatique) devra être séparé en trois 15 ml tube à centrifuger conique. - Remettre en suspension les cellules dans 400 ul de HBSS 0,5% (v / v) de sérum-albumine bovine (BSA) et ajouter 40 ul de microbilles CD31 et anti- 30 ul de microbilles anti-CD45. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 ° C.
NOTE: Ne pas dépasser tIl temps d'incubation, comme la pureté de la séparation sera considérablement réduite. - Ajouter 5 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA dans les cellules et les centrifuger pendant 8 min à 180 x g et 4 ° C (en utilisant réduite d'accélération / décélération et 4/2).
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de billes mortes d'élimination des cellules et incuber à température ambiante pendant 15 min. Pendant ce temps, préparer une colonne de séparation LS et calibrer avec 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA.
REMARQUE: Ne pas dépasser le temps d'incubation, comme la pureté de la séparation sera considérablement réduite. - Ajouter 900 ul de HBSS 0,5% (v / v) de BSA dans les cellules, de les filtrer à l'aide de 100 um filtre en polyamide mesh, et de les charger sur la colonne de séparation LS.
REMARQUE: Chargez une foie entier sur une colonne de séparation de LS. - Laver la colonne trois fois avec 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA et de recueillir l'écoulement.
- Centrifuger l'écoulement pendant 8 minutes à 180 xg et 4 ° C (en utilisant acce réduiteaccélé- / 4 et de décélération / 2).
- Remettre en suspension le culot cellulaire soit dans le tampon (RB) (PBS et 2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) contenant 0,5% (v / v) de BSA ou le tampon ST, selon la procédure expérimentale de rinçage supplémentaire.
à base de microbilles 6. Magnetic cellulaire Purification automatisée des progénitrices sous-ensembles cellulaires combinés de Livers multiples
REMARQUE: Etant donné que les sous-ensembles de cellules progénitrices représentent des populations de cellules rares, en combinant plusieurs cellules provenant de foies sont souvent nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour d'autres expériences. A titre d'exemple, CD133 + et gp38 + séparation des cellules est décrit ci - dessous.
- Isolement des progéniteurs CD133 +
- Après l' étape 5.9, compter les cellules, comme décrit à l' étape 3, et resuspendre jusqu'à 10 6 cellules (mise en commun typiquement 4-6 échantillons de foie en bonne santé) dans 100 pi de RB.
- Ajouter l'anti-CD64 1: 100 et anti-CD16 / 32 1: 100 pour les cellules et Incubles mangea sur la glace pendant 5 min. Ajouter 1: 100 d'anticorps anti-CD133 biotinylé aux cellules et incuber sur de la glace pendant encore 10 min.
- Ajouter 5 ml de RB et centrifuger pendant 8 min à 180 xg et 4 ° C (à l'aide réduite d'accélération / décélération 4 et / 2).
- Remettre en suspension les cellules dans 400 ul de RB et ajouter 10 ul de microbilles anti-biotine. Incuber l'échantillon pendant 15 min à 4 ° C. Ne dépassent pas le temps d'incubation, car cela réduit la pureté des échantillons.
- Ajouter 5 ml de RB et centrifuger pendant 8 min à 180 xg et 4 ° C (à l'aide réduite d'accélération / décélération 4 et / 2). Reprendre le culot dans 1 ml de RB.
- Isolement des progéniteurs + GP38
- Après l' étape 5.9, compter les cellules, comme décrit à l' étape 3, et resuspendre jusqu'à 10 6 cellules (mise en commun typiquement 4-6 échantillons de foie en bonne santé) dans 100 pi de RB.
- Ajouter l'anti-CD64 1: 100 et anti-CD16 / 32 1: 100 aux cellules et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 1:100 anti gp38 anticorps biotinylé aux cellules et incuber sur la glace pendant encore 10 min.
- Ajouter 5 ml de RB et centrifuger pendant 8 min à 180 xg et 4 ° C (à l'aide réduite d'accélération / décélération 4 et / 2).
- Resuspendre les cellules dans 400 pi de RB et ajouter 5 ul de microbilles anti-biotine. Incuber l'échantillon pendant 15 min à 4 ° C. Ne dépassent pas le temps d'incubation, car cela réduit la pureté des échantillons.
- Ajouter 5 ml de RB et centrifuger pendant 8 min à 180 xg et 4 ° C (à l'aide réduite d'accélération / décélération 4 et / 2).
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de RB.
- Étapes communes après l'étape 6.1 ou 6.2
- Placer le tube de centrifugeuse conique de 15 ml contenant les suspensions de cellules marquées magnétiquement sur un bâti 5 de refroidissement avec deux tubes vides supplémentaires pour recueillir les fractions positives et négatives. Placer la grille de refroidissement sur la plate-forme de séparation du séparateur.
- Utilisez le programme de sélection positive(Possel_d2) avec une étape de lavage étendue entre chaque (option de rinçage) de l'échantillon.
REMARQUE: L'utilisation de la séparation manuelle basée sur les colonnes des cellules au lieu du séparateur automatique réduira la pureté de l'échantillon. - Recueillir la fraction positive et centrifuger pendant 8 min à 180 x g et 4 ° C (en utilisant réduite d'accélération / décélération et 4/2).
- Remettre en suspension le culot cellulaire soit dans le tampon RB ou ST, en fonction de la nouvelle procédure expérimentale.
- Pour un contrôle de pureté, prélever une aliquote des cellules et tacher comme décrit à l'étape 4.
7. cytométrie de flux Tri cellulaire
NOTE: Une sorte de haute pureté d'une cellule sous-ensemble progénitrices pourrait être atteint avec le protocole décrit ci-dessous. Le rendement global des cellules est beaucoup plus faible que celle qui est décrite dans l'étape 6 et est le meilleur pour l'analyse d'expression génique.
Paramètre Réglage Buse Taille 85 pm La fréquence 46,00 à 46,20 Amplitude 38,30 à 55,20 Phase 0 Retard Goutte 28,68 à 28,84 Atténuation De Première baisse 284-297 Gap cible 9.-14 Pression 45 psi Tableau 3.
- Acquérir des cellules de l'enrichissement magnétique à base (décrit dans l'étape 5); compter, comme décrit à l'étape 3; et les tacher pour les marqueurs progénitrices (CD133, gp38), CD31, CD45 et ASGPR1, comme expliqué à l'étape 4.
- Préparer le milieu de tri (SM): gratuit Dulbec de phénol-rougeModified Eagle Medium co (DMEM) contenant 0,5% (v / v) de BSA et 0,01% (v / v) d'azoture de sodium. Resuspendre les cellules colorées dans SM, les transférer dans un tube à fond rond en polypropylène, et les placer sur la glace.
NOTE: L'azoture de sodium est très toxique. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié, tels que des gants en nitrile, une blouse de laboratoire, et un masque facial. Ne pas utiliser l'azoture de sodium si les cellules triées sont utilisées pour des tests fonctionnels. - Utilisez le logiciel approprié pour le type de trieuse utilisé pour l'isolement cellulaire. Ouvrez le logiciel et suivez les instructions du fabricant pour configurer les paramètres de tri et spécifications de la machine.
REMARQUE: Les spécifications de la machine sont résumées dans le tableau 3. Alors que la machine spécifications pourraient être différentes à diverses institutions, il est important de noter que la réduction de la pression de tri et une taille de buse plus grande est nécessaire (45 psi et la buse de 85 um) pour augmenter la viabilité de la cellule souche populations et la qualité de l'ARN préparé à partir des cellules triées. Il est important d'utiliser des cellules progénitrices du foie enrichi pour régler la compensation. D'autres populations du foie ou des leucocytes ont différentes auto-fluorescence et le résultat dans une résolution optimale de la population stromale et dans une stratégie de gating fausse. - Calibrer la machine et placer un tube à fond rond de 5 ml polypropylène contenant 350 pi de SM dans le dispositif de collecte de tri. Lancer l'acquisition des échantillons et trier. Recueillir 1.000 événements de la sous-population et arrêter l'écoulement de l'échantillon.
- Prenez le tube sur le dispositif de tri et de mesurer les cellules triées sur le cytomètre de flux. Identifier le pourcentage de la population de cellules triées présente parmi les cellules vivantes. Ce pourcentage donne la pureté des cellules triées.
- Si sorte de pureté supérieure à 95%, placer un tube à fond rond de 5 ml polypropylène contenant 350 pi de tampon de lyse RLT dans le dispositif de collecte de tri.
- Démarrez le tri et la collecte 7,000-10.000 événements par stroma sous-population.
- Transférer le tampon de lyse RLT contenant les cellules triées dans un tube de réaction et DNase sans RNase et conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'à analyse ultérieure.
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Representative Results
La procédure présentée ici pour la digestion du foie en utilisant un nouveau mélange d'enzymes conduit à une suspension unicellulaire contenant parenchymateuses et les cellules hépatiques non parenchymateuses (figures 1 et 2a). Après la lyse ACK des globules rouges, l'écoulement direct de l' analyse par cytométrie la suspension à cellule unique est possible (figures 1 et 2). La stratégie de déclenchement implique l'exclusion des doublets et les cellules mortes (Figure 2a). Les cellules qui sont négatives pour CD45, CD31 et ASGPR1 sont déclenchés. Cette population comprend des cellules de progéniteurs du foie et peuvent être regroupées en fonction de leur expression de CD133 et gp38 (figure 2a). Les gp38 + CD133 + et la gp38 - CD133 + représentent les populations les plus abondantes de cellules parmi CD45 - CD31 - - ASGPR1 cellules dans le liv sain de souris adulteer (Figure 2a, b). Ces sous - ensembles diffèrent dans l'expression des marqueurs de surface supplémentaires précédemment associés à des cellules progénitrices, telles que EpCAM, Sca-1 et CD34 (figure 2c).
Les cellules progénitrices peuvent être appauvris à partir hématopoiétiques et parenchymateuses cellules, telles que les hépatocytes et les cellules endotheliales hépatiques sinusoïdales (LSECs) (figures 1 et 3), et des cellules souches pourraient être davantage purifié avec une isolation à base de microbilles magnétiques (figure 3a, b) ou de haute pureté de tri (figures 1 et 4). L'isolement magnétique à base de microbilles-de CD133 + ou GP38 + cellules résultats dans plus de 90% de pureté (Figure 3a, b) en ce qui concerne les cellules CD45, CD31, ou ASGPR1 + contaminantes, et les cellules restent très viables (Figure 3a, b).
2. Ceci est particulièrement important pour le choix du mélange d'enzymes utilisé pour la dissociation des tissus. Ici, au lieu de la collagénase P collagénase D a été utilisé pour le foie 1, 2, 8. Fait important, le taux d'expression de CD133 sur les cellules progénitrices et le rendement des populations de cellules isolées ont été fortement réduits en présence de collagénase D (figure 5a, b). En plus de cela, notre mélange contenait dispase, ce qui est très approprié pour la ventilation douce et repiquages de divers types de cellules 13. Collagénase P représente conjointement avec la dispaseune combinaison idéale pour la dissociation des cellules du foie pour l'analyse de cellules progénitrices. Cette combinaison est également supérieure à la digestion à la trypsine ou de la pronase à base, du foie (données non présentées). Il est également important de noter que la centrifugation de densité, telles que l' enrichissement à base de Percoll 2, 14, n'a pas été nécessaire pour le progéniteur analyses présentées dans ce protocole.
Figure 1: Workflow du protocole décrit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Classification Novel de sous - ensembles de progéniteurs du foie. Une seule cellulesuspension a été préparée à partir de foies sains et ensuite colorées avec un panel de marqueurs de surface: CD45, CD31, CD133 et gp38 (A). Pour morts exclusion de cellules, l'iodure de propidium (PI) a été utilisé. tracés de points représentatifs avec la stratégie de déclenchement sont représentés. Les portes utilisées pour la détermination de cytométrie de flux de comptage cellulaire sont également marqués. (B) Les pourcentages et le nombre absolu de cellules présentes par gramme de tissu hépatique des différents sous - ensembles de cellules stromales entre les cellules CD45-négatives dans de type sauvage animaux non traités sont présentés. (C) Les histogrammes présentent des caractéristiques de marqueurs distinctifs de sous - ensembles de cellules stromales dans un foie sain. Une expression élevée de CD90.2 et de la présence de CD157 sont spécifiques pour A, alors que le CD34 est spécifique pour la sous-population B. Sca-1 est présent dans B, C, D et EpCAM est présent seulement dans la population C et D. La moyenne ± SEM; les données (AC) représentent 2-3 expériences indépendantes avec n = 3-4 par expérience. Le wer de donnéese comparée à l' aide d' un apparié, à deux queues test T * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: l' enrichissement à base de microbilles-magnétique et la purification de cellules automatisé. (A) magnétique enrichissement à base de microbilles-de CD45 -, CD31 - et ASGPR1 - cellules sont représentés avant et après enrichissement. (B) représentant des emplacements de points des isolations à base de microbilles de cellules automatisés sont représentés pour CD133 + et + GP38 cellules, sur la gauche. A droite, la viabilité des populations de cellules avant et après enrichissement sont présentés comme le pourcentage del'iodure de propidium (PI) des cellules séronégatifs. Moyenne ± ETM; les données (AB) représentent 3 expériences indépendantes avec n = 3 par expérience. Les données ont été comparées à l' aide d' un non apparié à deux queues test T * P <0,05, ** P <0,005, *** p <0,0001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: cytométrie de flux sorte de sous - ensembles progénitrices avec une grande pureté. parcelles Dot représentent la pureté des populations de cellules dans les échantillons triés (post-tri). Les données représentent 3 expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5: Comparaison des enzymes de digestion. La suspension de cellules isolées a été préparée en utilisant de la collagénase P (tel que décrit dans l'étape 2) ou à la collagénase D (1 mg / ml + DNase I à 0,1 mg / ml) à partir de foies sains et a été ensuite colorée avec un panel de marqueurs de surface: CD45, CD31, CD133 et gp38 (A). Les pourcentages de cellules présentes par gramme de tissu hépatique des différents sous-ensembles de cellules stromales entre les cellules CD45-négatives dans de type sauvage animaux non traités sont présentés. (B) L'intensité de fluorescence médiane de CD133 est représenté pour la population de cellules CD133 +. Moyenne ± ETM; les données (AB) représentent 2 expériences indépendantes avec n = 3 par expérience. Les données ont été comparées à l' aide d' un non apparié à deux queues test T * P <0,05, ** P <0,005, *** p <0,0001.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Inflammation du foie et des blessures de différentes origines déclenchent les processus de régénération du foie qui sont accompagnés par l' expansion des cellules progénitrices et activation 2, 3. Ces cellules progénitrices hépatiques possèdent souches caractéristiques cellulaires et jouent probablement un rôle important dans le mécanisme pathogénique de diverses maladies du foie.
L'hétérogénéité des progéniteurs hépatiques a longtemps été suggérée. La réévaluation des sous - ensembles de progéniteurs du foie en utilisant une combinaison de marqueurs de surface roman de CD133 et gp38 pourrait identifier des sous - ensembles qui portent différents marqueurs de surface et d' exprimer un ensemble unique de gènes liés à l' inflammation lors de lésions du foie 12. La méthode décrite ici permet l'écoulement direct cytométrie analyse de cellules rares et leur comparaison directe dans divers modèles de lésion du foie. Ceci est particulièrement pertinent, car diverses blessures déclenchent l'activation de multiples progéniteur subsets qui pourrait être le reflet de l'hétérogénéité cellulaire observée dans des réactions canalaire 3, 4, 11, 12. Notamment, une petite fraction de tissu hépatique de souris (0,2 g) est suffisante pour isoler les cellules suffisantes pour l'analyse par cytométrie en flux de précurseurs à l'aide de la méthode décrite.
Cytométrie de flux de tri fournissant des populations de haute pureté des sous-ensembles est nécessaire d'explorer leurs profils uniques d'expression génique. Les rapports précédents flux décrit l'isolement de cellules souches à base de cytométrie-15, 16. Néanmoins, le protocole présenté ici fournit un procédé optimisé qui garantit la haute pureté et la viabilité de ces cellules. Notamment, in vitro des techniques de culture et d' expansion décrites précédemment peuvent être bien combinés avec le protocole présenté ici 15
De nombreux types de flux cytométrie trieurs sont disponibles dans diverses institutions, et leurs instrumentations particulières peuvent être légèrement différentes. Cependant, les principes généraux de tri cellulaire sont présentés dans le protocole décrit. En général, une pression plus basse et plus grande taille de la buse sont absolument nécessaires, indépendamment des types et des spécifications machine. En outre, l'utilisation d'un moyen de tri approprié peut augmenter de façon significative la viabilité et la qualité de l'ARN des cellules triées, ce qui est un facteur important, en particulier pour des études d'expression génique. Le tri des cellules progénitrices, cependant, réduit considérablement la viabilité des cellules, et le rendement des cellules après le tri est relativement faible (de haute pureté sorte de 7-10,000 événements / sous-population, 4-5 foies sains doivent être mis en commun). Cela pourrait être un facteur de limitation pour plus d' analyses in vitro. Nous suggérons l' isolement à base de microbilles magnétiques dansdes essais in vitro, en raison de son rendement élevé et de la viabilité cellulaire et cytométrie de flux de tri pour l' analyse de l' expression génique, en particulier lorsque des analyses plus sous - ensemble spécifié et les isolations sont nécessaires.
Sur la base du fait que la viabilité des cellules est considérablement réduite après cytométrie de flux de tri, une isolation à base de microbilles magnétiques automatisé de cellules progénitrices a été développé et présenté ici. Elle permet l'isolement d'un plus grand nombre de cellules progénitrices avec une grande pureté (combinant plusieurs foies). En outre, la viabilité des cellules est maintenue, étant donné que le temps nécessaire pour le processus d'isolement est considérablement réduit. Alors que le nombre plus faible de cellules progénitrices peuvent être développées in vitro 1, 2, 15, 16, il est recommandé d'examiner comment ces manipulations in vitro pourraient modifier les caractéristiques cellulaires de souches / Progencellules Itor décrites pour d' autres populations mésenchymateuses et cellules stromales 17, 18.
La principale limitation de l'isolement à base de microbilles magnétique présentée est que le CD133 + et les populations de GP38 + cellules représentent des cellules hétérogènes. marqueurs de surface supplémentaires pourraient être nécessaires pour identifier les populations de cellules plus petites.
La compréhension de la façon dont les cellules et les progéniteurs souches hépatiques se rapportent les uns aux autres est loin d' être complète, malgré d' excellentes études par Lola Reid et d' autres 1, 8, 19. Ainsi, l'examen attentif des techniques conduisant à des rendements plus élevés et de la viabilité, comme celle proposée ici, pourrait contribuer à étendre les analyses des sous-ensembles de progéniteurs et la compréhension de leurs relations interconnectées.
Dans l'ensemble, nous avons décrit til a détaillé l' isolement et l' analyse des sous - ensembles de progéniteurs du foie qui ont été récemment distingués 12. De plus, en utilisant une combinaison d'enzymes roman, progéniteurs rares pourraient être analysées par des mesures directes de cytométrie de flux. En outre, le protocole montre comment enrichir les cellules progénitrices avec une grande pureté, en utilisant soit le tri cellulaire ou une technique à base de microbilles-automatisé.
Dépannage:
Les pourcentages de débris cellulaires et les cellules qui meurent sont élevés
Si, lors de la digestion (étape 2), le pipetage des échantillons de foie est trop dur, le pourcentage de cellules qui meurent dans les monocellulaires suspension augmente. Si le foie est coupé en gros morceaux que ne le suggère, la digestion est moins efficace et des résultats dans plus de mort cellulaire lors de la préparation.
Après avoir terminé la procédure décrite dans l'étape 5, la pureté des échantillons est insuffisant
Si les pourcentages des débris cellulaires et les cellules meurent dans la suspension monocellulaire préparée à l'étape 2 sont trop élevées, les microbilles se lient de manière non spécifique et, par conséquent, la pureté de l'isolement est considérablement réduit.
Faible nombre de cellules après purification à base de microbilles-
Pour la réussite du protocole décrit, il est important que le rapport entre les cellules à microbilles est optimale, comme il est suggéré dans le protocole. En utilisant des microbilles de plus réduit la pureté et diminue le rendement et la viabilité des cellules isolées. Si les marqueurs de surface autres que celles présentées dans le protocole sont utilisées pour l'isolement progéniteur de sous-ensemble, le rapport optimal de cellules à microbilles doit être déterminée.
Magnetic microbille isolation à base de gp38 + CD133 - population
Suivez les étapes dans la section 5. Dans l' étape 5.3 ajouter en outre 10 ul anti-CD133 + microbilles, puis suivez les étapes 5, 6.2 et 6.3 comme décritré.
Calcul du nombre de cellules absolues
Le poids du foie est utilisé pour calculer le nombre de cellules d'un certain sous-ensemble sont présents par gramme de tissu hépatique.
(% De la sous-population des cellules vivantes (basé sur la cytométrie de flux) / 100) x nombre total de cellules vivantes isolées à partir de la pièce de foie = Z
(1 / poids de pièce de foie) x Z = nombre de cellules / g de tissu du foie
D'autres populations de cellules qui peuvent être isolées par ce procédé
Il est possible d'isoler les cellules suivantes du foie en utilisant ce protocole de digestion: CD45 + des cellules (ou sous - populations de cellules hématopoïétiques, par exemple des cellules de Kupffer, les cellules dendritiques, les lymphocytes T, les cellules NK, etc.) et LSECs. Le protocole de digestion ne convient pas pour l'isolement des hépatocytes ou des cellules hépatiques étoilées. Ces cellules sont présentes au nombre relativement faible de cellules et ils montrent la viabilité réduite par rapport à other les méthodes disponibles.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Sofja Kovalevskaja Award Alexander von Humboldt à VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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