Summary
げっ歯類の部分膀胱出口閉塞の伝統的なモデリングは、動物の死亡率をはらんでいます。近位尿道や膀胱頸部の周りの解剖から除神経損傷が主要な関心事でもあります。私たちは、従来のモデルの欠点を回避し、安全で信頼性の高いミッド尿道閉塞モデルを開発し、評価しました。
Abstract
部分膀胱出口閉塞（pBOO）、高い有病率を持っている重要な患者の負担、そして巨大な医療費が発生します。 pBOOで膀胱改造を調査するための最も一般的な動物モデルは、近位尿道の部分閉塞を受けた女性の齧歯類です。障害物や動物の死亡率の程度の変動は、近位閉塞との主要な関心事です。さらに、近位尿道や膀胱の首に解剖することは膀胱神経支配を脅かします。
私たちは、従来のモデルの欠点を回避pBOOための神経温存半ば尿道閉塞（NEMO）モデルを開発しました。私たちは、この分野での解剖のためだけでなく、開腹手術の必要性を回避恥骨結合、のすぐ下尿道に近づきました。また、横紋筋尿道括約筋はそのまま残りました。私たちは、20の閉塞（メスSprague-Dawleyラット（12の障害物、6匹の偽動物）ならびにメスC57 / BL6マウスでニモを行いましたS、18匹の偽動物）。 2週間後、私たちは、膀胱機能、膀胱質量、および体重を評価しました。
私たちは、obstructed-または偽手術雌ラットの間には死亡しませんでした。伝統的な近位pBOO法について記載したように、我々は、近位尿道の周りに縫合糸を結び、一時的に0.9ミリメートルの金属棒を入れました。 NEMOは、2週間後に膀胱質量の85％の増加を誘導した偽動物においてのみ0.03 mLのながら、平均残尿量は、部分的に閉塞ラットにおいて0.4 mLでした。マウスでは、我々は、縫合糸を結ぶときに我々が尿道に沿って配置されたカニューレの3つのサイズを試験しました。私たちは、27ゲージのカニューレを使用すると、50％の動物の死亡率の上にもたらしたことがわかりました。 25ゲージのカニューレを配置する膀胱質量を増加させることで所望の応答を生じませんでした。 26ゲージのカニューレを利用すると、最小限の動物の死亡率（1/8）まだ膀胱質量の有意な2倍の増加と良好な結果が得られました。
Introduction
部分膀胱出口閉塞（pBOO）は、高い有病率を有し、重度の膀胱機能不全1をもたらすことができます。スペクトルは、良性前立腺肥大、取得した尿道狭窄の上、そのような後部尿道弁又は尿道下裂などの先天性奇形の範囲です。男性60歳、2年上の30％以上に影響を与え、後者。グレート患者負担とpBOOに関連付けられている巨大な医療費が増加した流出抵抗3に対応して勉強膀胱改造に入れ、かなりの研究努力を正当化。 2006年から2015年まで、220以上のPubMedのインデックス付けの記事は、膀胱にpBOOの影響に関する発表されました。
pBOOのための動物モデルは、ラット5、ウサギ6、豚7、および覚書などのいくつかの種4に考案されてきたがE 8、9、間違いなく最も一般的に使用される動物モデルは、しかし、近位尿道の部分閉塞を受けた雌ラットです。動物の腹部へのアクセス、膀胱のexteriorizing、および膀胱頸部の周りの解剖は、この伝統的な近位尿道閉塞技術と避けられません。閉塞および動物の死亡率の程度の変動は、この手順10、11に関連した問題のいくつかです。私たちは、偽手術動物では、近位尿道の周りの解剖が膀胱頸部12で神経線維の損失と相関の生理的変化をもたらすことを示しました。この知見は、女性のげっ歯類で近位尿道にアクセスすることを含む、最も一般的に使用されるpBOO動物モデルは、影響を与える、膀胱の関連する構造的および機能的変化で除神経損傷につながることを示し、シャムと閉塞動物。したがって、除神経損傷を避け、代替的なアプローチが必要でした。偽手術動物は非操作コントロール動物と区別できなかった一方で我々の研究室では、そのような器官質量の増加および残留尿などの膀胱の予想される障害物に関連する変化を誘導するのに有効な、神経温存ミッド尿道閉塞（NEMO）アプローチを開発し、評価しました。それは解剖のレベルに近位に位置しても、横紋筋尿道括約筋はそのまま残りました。さらに、膀胱質量の閉塞により誘導される増加の変動は、死亡率はゼロであった伝統的な近位尿道閉塞および動物よりも有意に低かったです。
これまでに説明したマウスのためのすべてのpBOOモデルは50％の周りの死亡率と関連していた間、私達はまた成功し、閉塞した動物において10％未満の死亡率と雌マウスにニモを適用しました。マウスでのpBOOのコンテキストで膀胱の再構築を検討することはapplicabilの恩恵を受けるトランスジェニック改変の全体スペクトルのITY。
女性のげっ歯類で半ば尿道の周りに解剖することは、伝統的な近位閉塞モデルにおいて観察された膀胱における望ましくないと交絡構造的または機能的変化を誘導しません。それにもかかわらず、半ば尿道レベルでの部分的な閉塞を誘発することは、まだ膀胱肥大を誘導し、pBOOのための動物モデルから予想されるように、残尿を増加させました。重要なことに、マウスにおけるNEMOを行うことも大きいげっ歯類において実質使用できないトランスジェニック法にpBOOにおける膀胱リモデリングの調査を開きます。
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Protocol
以下の実験プロトコルは、金融機関の動物管理委員会によって承認されました。
雌ラットの1 NEMO
- 準備
- 、3％イソフルラン麻酔下で約200グラム体重の雌のSprague-Dawleyラットを配置し動物を秤量、およびヨウ素の外科用スクラブを用いて恥骨前領域を3回剃ると消毒。
- ダウン加熱パッド、テープ後肢および尾部に、また穏やかに摺動防止するダウンテープで20ゲージの血管カテーテルと膀胱カテーテルを挿入。
- 解剖
- 尿道口への触知恥骨結合から8ミリメートル縦皮膚切開を行うためにメスを使用してください。後の創傷閉鎖を容易にするために、いずれかの側に皮膚をオフに持ち上げます。
- 長手細かいハサミで拡散によりステント尿道を識別するために鈍切開。露出を高めるために、細かい自己保持、皮膚のフックを配置尿道の。
- いくつかの穏やかな長手方向が尿道と膣との間の面を開発するために尿道に湾曲したはさみの背部を使用して拡散行います。その後、ぶっきらぼうに尿道の背後に4-0絹縫合糸を渡し、外科結びの双投を準備します。
- 部分的尿道閉塞
- 後者は依然として容易その後アウトスライドするように、血管カテーテルを除去尿道0.9ミリメートルの金属棒と平行に配置し、その後尿道と金属棒の周りに結び目を締めます。
- 3以上で結び目を固定し、ロッドを取り外す前に、穏やかテンションを使用してスローします。閉塞の後の放出は、実験の一部である場合、縫合糸は、長約3mm、または4ミリメートルを終了切断。
- 創傷閉鎖
- 吸収性編組縫合糸4-0の埋め込み単一のステッチを使用して尿道傍腺を近似します。
- 同じ吸収SUTを使用して埋め水平マットレスステッチで皮膚を閉じますURE。注意：それは皮膚浸透ステッチのための吸収性縫合糸を使用するように型にはまらないように思えるかもしれませんが、我々は、創傷感染症などの合併症が発生していなかった、とその縫合糸の除去を回避することができます。
- アフターケア
- 注入ブプレノルフィンを0.1mg / kgの皮下に回復ケージにラットを配置する前に。
- 単一収容されたラットへの最初の24時間のためにいくつかのソフトリカバリの食事を提供します。この期間の後、手続き前と同じペアで再び家の動物は、彼らはよくやっと同じ処置グループに属して提供されます。
- 膀胱のサイズと一般的な幸福のために毎日ラットをチェックしてください。 1週間に1回以上、体重を記録します。
雌マウスで2 NEMO
- 準備
- 約18グラム体重の雌性C57BL / 6マウスを置き、ステップ1.1.1で詳述するように進みます。
- 24ゲージのANGを使用する以外、ステップ1.1.2で詳述するように進んでくださいiocatheter。
- 解剖
- 触診可能な恥骨結合から尿道口に向けて6mmの長手方向の皮膚切開を行うためにメスを使用する。
- 細かいはさみで縦に広げてステント留置尿道を確認するために鈍的に解剖する。類似の鈍的解剖によって尿道の腹側に走っている神経管束を持ち上げる。
- 尿道と膣の間に平面を展開するために、尿道の後ろに湾曲したはさみを使っていくらか穏やかに縦方向に広げる。次に、尿道の後ろに5-0の非吸収性編組縫合糸をしっかりと通し、外科医の結び目の二重の投げを準備する。
- 部分的な尿道閉塞
- 血管カテーテルを1 mLシリンジで接続し、生理食塩水0.1 mLを膀胱に注入します。
- 26ゲージのカニューレを尿道に平行に置きます。尿道とカニューレの周りの結び目を静かに締め、アンギオを戻します目。
- 3以上で結び目を固定したカニューレを取り外す前に、穏やかテンションを使用してスローします。
- 動物の膀胱にやさしい圧力に尿道口に現れる尿のためのテスト。尿を発現することができない場合はネクタイを緩めます。それ以外の場合は、縫合糸は、長さ約3ミリメートルを終了カット。
- 創傷閉鎖
- 5-0編組吸収性縫合糸を使用して埋め水平マットレスステッチで皮膚を閉じます。
- アフターケア
- 回復ケージにマウスを置く前に0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン皮下に注入します。
- 単一収容され、マウスへの最初の48時間のためにいくつかのソフトリカバリの食事を提供します。この期間の後、手続き前と同じグループで、再び家の動物は、彼らはよくやっと同じ処置グループに属して提供されます。
注：過遮られ取り扱う際に無効にしていないとnの中に死んでしまうの手順の後に触知可能な膨張した膀胱24時間を有するマウスEXT 1 - 妨害結紮の除去のために麻酔下でバック取らない限り、2日間。 - 膀胱のサイズと一般的な幸福のために毎日マウスを確認してください。 1週間に1回以上、体重を記録します。
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Representative Results
雌ラットの神経温存ミッド尿道閉塞（NEMO）
死亡
我々はこれまでに40以上の雌ラットに半ば尿道閉塞を行い、何の死亡がなかったです。
膀胱質量
閉塞ラットは85％の増加（P = 0.004に変換0.60％の平均相対膀胱質量を有していた偽手術動物における平均相対膀胱質量は（膀胱 - ボディ質量比）、二週間処置後に0.33％でした; 図1）。
残尿
偽手術ラットは、我々が吸引可能性がほとんど残尿がありませんでした臓器収穫時の直接膀胱穿刺によって、コントラストの中間尿道閉塞の動物は0.42ミリリットル（; 図2、P = 0.01）の残尿の有意に高い平均量を有していました。
雌マウスにおける神経温存ミッド尿道閉塞（NEMO）
死亡
全体的に、18匹の雌マウスは、偽のニモの手続きを受け、そのうちの1人が死亡しました。閉塞の必要度を較正するために、我々は、縫合糸を結ぶときに尿道に沿って配置されたカニューレ（25ゲージ、26ゲージ、27ゲージ）の3つの異なる直径を評価しました。我々は、尿道（ 図3）に沿ってプレースホルダとして25ゲージカニューレを使用した場合に5匹のマウスのいずれも死亡しませんでした。一方、死亡率が有意に小さいサイズのプレースホルダとともに増加しました。 26ゲージまたは27を使用した場合の1/8または5/8マウスが死亡しました（P = 0.039、Fisher's exact test）。
膀胱質量
25ゲージのカニューレを用いた雌マウスのNeMOは、膀胱と体の質量比を効果的に増加させなかった（ 図4 ）。 26ゲージのカニューレを使用すると、相対的な膀胱質量が2倍以上増加した（p = 0.04）。 27ゲージのプレースホルダを使用した場合、2週間後に60％以上の相対的な膀胱質量の増加が生じました（p = 0.004）。
残尿
ラットと同様に、雌マウスは麻酔の誘導時に無効になる傾向がある。膀胱を収穫する際には、膀胱頸部を鉗子で閉塞し、膀胱の重量を尿で測り、尿を排出した後、残尿を正確に計算することができました膀胱収穫。 PBOOは尿道に沿って25ゲージまたは26ゲージのカニューレは2週間以内に残尿の変化（ 図5）をもたらさなかった置きます。注目すべきは、ごく少数の動物は、事実上すべてのボイド誘発ラットとは対照的であり、麻酔導入、中に無効。 27ゲージカニューレを使用してNEMO生存3匹のマウスでは、平均残留尿量は、それぞれのシャムと比較して3倍増加しました。しかし、違いはほとんどの場合、低Nによる統計的有意性を達成していませんでした。
図1 NEMOを効果的に2週間後に膀胱質量の増加を誘導します。 NEMOは、2週間以内に膀胱-ボディ質量比で85％の増加をもたらした（p = 0.004;§します ）。
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図2は、2 週間後のニモ残尿の増加をマーク。偽手術ラットは膀胱収穫時に針吸引することができ、事実上残留尿を有さなかったが、中間尿道閉塞の動物は平均に残尿のほぼ0.4 mLであった（p = 0.013;§します ）。
部分的な閉塞の程度と 図3. 死亡率が増加します。 18匹のマウスのうちの一つは、偽ニモ手続き後に死亡しました。尿道に沿ってプレースホルダとして25ゲージのカニューレを使用する場合、すべて5はフィッシャーの正確確率（P = 0.039、それぞれ、26ゲージまたは27ゲージのカニューレを使用する場合の1/8または5/8のマウスが死亡したマウスは、生存操作しましたテスト）。
<2週間後の相対膀胱質量の効果的な増加でニモ結果の間に強い>図4. 26ゲージと27ゲージのプレースホルダ。 25ゲージのカニューレを用いて雌マウスにおけるNEMOは、相対的な膀胱質量（§）の有意な増加をもたらしませんでした。唯一の26ゲージのカニューレを用いた場合、相対膀胱質量の上2倍の増加が生じた（p = 0.04;†）。 27ゲージのプレースホルダと障害物が相対膀胱質量の60％以上増加した（P = 0.004;‡）。
図5は、 ニモ後2週間を空にする膀胱を維持しました。 NEMO手順の間に、25ゲージ又は尿道に沿って26ゲージカニューレを使用して（§）2週間後残尿の変化をもたらしませんでした。平均残留URの3倍の増加統計的有意性に達しなかったシャムと比較して、27ゲージのグループにINE体積は（N妨げ= 3;†）。
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Discussion
動物の死亡率は、多くの報告10、11、13、15％以上で、近位尿道におけるpBOOの伝統的なモデルの主要な関心事の一つです。ニモは、雌ラットに適用した場合に、最小限の死亡率を持っているように見えます。マウスでは、近位尿道閉塞は、技術的に困難なラットに比べので、さらに発生しやすい合併症です。私たちの半ば尿道的アプローチのためのプレースホルダとして26ゲージのカニューレを使用して、我々は最小限の動物の死亡率を持っていました。我々はわずか2アウト18のマウスが過閉塞した26ゲージのカニューレを用いて雌性マウスにおいてNEMOを適用し、進行中の研究では（データは示さず）。閉塞したマウスの半分以上が、このような27ゲージのカニューレとして小さなプレースホルダを使用することにより、オーバー閉塞尿閉や膀胱破裂で死亡しました。したがって、我々は、26ゲージのプレースホルダーは、約18グラムの雌マウスのための合理的な口径であると考えています。
膀胱質量の増加は、ヒト疾患におけるpBOOの顕著な特徴の1つです。私たちは、効果的にラットならびにマウスで唯一の2週間後に膀胱質量の有意な増加を誘導するためにNEMOを同定しました。近位尿道でpBOO後の膀胱質量の平均増加は、我々はNEMO 12後に観察されたものよりもはるかに高いので、2週間後に2.5倍以上です。臓器質量の過剰な増加は、しかし、研究者がpBOOを適用するときにモデル化することを目指してinfravesical閉塞性uropathiesの大部分を反映していません。この点で、NEMOは、伝統的な近位pBOOよりもヒト病理に非常に近い、より緩やかな改造・レスポンスと低侵襲性と良好な忍容性pBOOモデルを提供しています。近位pBOOで膀胱質量のより顕著な増加は、最も可能性の高い膀胱頸部の周りの解剖起因する除神経損傷に関連しています。除神経は、排尿筋・括約筋のクロストークaを危険にさらすことNDでも偽手術動物12で機能的な出口閉塞を引き起こします。
残尿も大幅にわずか2週間後にニモを受けた雌ラットで増加しました。一方マウスでは、唯一のプレースホルダとして27ゲージカニューレを使用してマウスで残尿量を増加させる傾向がありました。ガス状の麻酔下に置かれたとき、ラット、事実上すべてのボイドながらしかし、我々は非常に少数のボイドを誘導マウスでこれを観察しませんでした。おそらく、このマウスの非排尿行動マスク残尿の真の量と今後の研究で排尿を誘導するために、別の刺激を必要とします。
雌ラットに尿道に沿って0.9ミリメートルのロッドを使用して閉塞の程度が適切であると思われるが、膀胱質量の明らかな増加および残尿と最小の動物の死亡率を組み合わせること、雌マウスにおけるNEMOのための閉塞の程度を較正することは多いです挑戦。一方で、25ゲージのカニューレを使用する一方、27ゲージのカニューレを使用して、膀胱質量の検出可能な増加をもたらさなかったがpBOOを受けたマウスの半分以上に過剰に閉塞をもたらしました。唯一の26ゲージのカニューレは低い動物の死亡に伴う臓器の成長の面で合理的な反応を示しました。
pBOOは女性よりも男性に明確に、より流行しているので、人間pBOOをモデリングする際に、雄の動物を使用することが好ましいであろう。半ば尿道閉塞（NEMO）技術を温存私たちの神経は明らかに組織の再構築を開始し、炎症反応に影響を与える動物のホルモン状態を受け入れるのこの欠点を解決しません。低い変動性マウスにおけるNEMOの低い動物の死亡率は、しかし、大きなげっ歯類において非常に限られているトランスジェニック法の完全なスペクトルに適し改造膀胱の調査を行います。
要約すると、雌ラットおよび雌マウスのためのニモがありますやるのは簡単、低動物の死亡率を持ち、かつ膀胱首解剖の結果、膀胱に除神経損傷を回避することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female rat | Charles-River Canada | Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400 | about 200 g |
| Isoflorane vaporizer | Benson medical industries inc. | TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO | |
| Isoflorane | Fresenius Kabi Animal Health | Isoflorane; product code CP0406V2 | 250 mL bottle |
| Disposable scalpel | Ted Pella, Inc. | #15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S | |
| Microscopy forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443 | |
| Adson forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9 | |
| Curved surgical scissors | Ted Pella, Inc. | Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376 | |
| 0.9 mm inox metal rod | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| Skin hooks - self made from inox steel | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| 4-0 Silk suture | esutures.com | 4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640 | |
| 5-0 Vicry suture | esutures.com | 5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H | |
| Needle holder | Medsupplier.com | Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC |
|
| Temgesic (Buprenorphine) | first veterinary supply | Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701 | |
| 1 mL syringe with 27 G needle | Fisher Scientific | BD Tuberculin Syringe, BD 309623 | |
| 20 G Angiocath | Fisher Scientific | Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906 | |
| Recovery diet | clearh2o | DietGel 31M; 72-08-5022 | |
| C57Bl/6 female mice | Charles-River Canada | C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027 | about 18 g |
| 24 G angiocath | Fisher Scientific | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340 | |
| 5-0 Ethibond | esutures.com | 5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H | |
| 26 G syringe needle | Sigma-Aldrich | BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392 | |
| Normal Saline | Baxter | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043 |
References
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