Summary
Traditionell modellering av partiell blåsutloppsobstruktion hos gnagare är fylld med djurdödlighet. En denervering skador från dissektion runt proximala urinröret och blåshalsen är också av stor betydelse. Vi utvecklade och utvärderade en säker och pålitlig mid-uretral obstruktion modellen undviker bristerna i den traditionella modellen.
Abstract
Partiell blåstömningsobstruktion (pBOO) har en hög förekomst orsakar betydande patientens börda, och enorma vårdkostnader. Den vanligaste djurmodell för att undersöka blås ombyggnad i pBOO är hongnagare genomgår partiell obstruktion i den proximala urinröret. Variation i graden av obstruktion och djurdödlighet är stora problem med proximal hinder. Vidare dissekera runt den proximala urinröret och blåshalsen äventyrar blås innervation.
Vi utvecklade en nervsparande mitten urin obstruktion (NEMO) modell för pBOO undvika nackdelarna med den traditionella modellen. Vi närmade urinröret bara underlägsen blygdbenssammanfogningen, vilket undanröjt behovet av laparotomi samt för dissekering på detta område, även förblev strimmig urinrörets ringmuskel orörd. Vi utförde NEMO i Sprague-Dawley-råttor (12 hinder, 6 sken djur) såväl som hos kvinnliga C57 / BL6-möss (20 obstruktions, 18 sken djur). Efter två veckor, utvärderade vi blåsfunktion, urinblåsa massa och kroppsmassa.
Vi hade inga dödlighet bland obstructed- eller skenopererade honråttor; såsom beskrivits för den traditionella proximala pBOO-metoden, bundet vi suturen runt den proximala urinröret och ett temporärt placeras 0,9 mm metallstav. NEMO inducerade en ökning av blåsmassan 85% efter två veckor, återstående genomsnittliga urinvolymen var 0,4 ml i partiellt blocke råttor medan endast 0,03 ml i simulerade djur. I möss, testade vi 3 storlekar av kanyler som vi placeras längs urinröret när man binder suturen. Vi fann att med hjälp av en 27-gauge kanyl resulterade i över 50% djur dödlighet; placera 25-gauge kanyl gav inte det önskade svaret i att öka blås massa; utnyttjande av en 26-gauge kanyl gav gynnsamma resultat med minimal djurdödlighet (1/8) Ännu en signifikant ökning två gånger i blåsan massa.
Introduction
Partiell blåsutloppsobstruktion (pBOO) har en hög prevalens och kan resultera i allvarlig blåsdysfunktion 1; spektrat sträcker sig från medfödda missbildningar såsom bakre urinrörsventiler eller hypospadi, över förvärvade urinrörsförträngningar till benign prostatahyperplasi. Den senare drabbar mer än 30% av männens sextio år och äldre 2. Stort patienten börda och enorma vårdkostnader i samband med pBOO motivera avsevärda forskningsinsatser tas i studera urinblåsan ombyggnad som svar på ökat utflöde Resistance 3. Från 2006 fram till 2015, mer än 220 PubMed indexerade artiklar publicerades om effekten av pBOO på urinblåsan.
Även om djurmodeller för pBOO har uppfunnits i flera arter 4, såsom råtta 5, kanin 6, gris 7, och mouse 8, 9, utan tvekan den mest använda djurmodell är emellertid honråttor som genomgår partiell obstruktion av den proximala urinröret; tillgång till djurens buk, exteriorizing i urinblåsan, och dissektion runt blåshalsen är oundvikliga med denna traditionella proximala urin obstruktion teknik. Variabilitet i graden av obstruktion och djurdödlighet är bara några av de problem som är förknippade med detta förfarande 10, 11; vi visade att i skenopererade djur, dissektion runt den proximala urinröret leder till fysiologiska förändringar som korrelerar med förlusten av nervfibrer vid blåshalsen 12. Detta indikerar, att den mest använda pBOO djurmodell, som innebär åtkomst till proximala urinröret hos kvinnliga gnagare, leder till en denervering skada med associerade strukturella och funktionella förändringar i urinblåsan, som påverkarbluff och hindras djur. Därför var en alternativ metod att undvika denervation skada behövs. Vårt labb utvecklats och utvärderats en Nerve sparande Mid-uretral obstruktion (NEMO) tillvägagångssätt, effektiv vid inducering förväntade obstruktion associerade förändringar i urinblåsan, såsom ökning i organvikt och kvarvarande urin, medan skenopererade djur var oskiljbara från oanvänd kontrolldjur . Dessutom förblev strimmig urinrörets ringmuskel orörd eftersom det ligger proximal till nivån för dissekering. Vidare variabilitet i obstruktion-inducerad ökning av blås massan var betydligt lägre än i traditionell proximala urinrörsobstruktion och djurens dödlighet var noll.
Vi framgångsrikt tillämpats även Nemo i honmöss med en mindre än 10% dödlighet hos obstruerade djur, medan alla pBOO modeller för möss som beskrivs hittills var associerade med en dödlighet kring 50%. Studera blås ombyggnad i samband med pBOO i möss kommer att gynnas av applicabilatt av hela spektrat av transgena modifikationer.
Dissekera runt mitten av urinröret hos kvinnliga gnagare inducerar inte de oönskade och confounding strukturella eller funktionella förändringar i urinblåsan observerades i den traditionella proximala hindret modell. Icke desto mindre, att framkalla en partiell obstruktion vid mitt uretral nivå fortfarande inducerar blåsan hypertrofi och ökad kvarvarande urin, som förväntat från en djurmodell för pBOO. Viktigare, utför NEMO i möss öppnar undersökning av urinblåsan remodellering i pBOO till transgena metoder, som är praktiskt taget inte tillgänglig i större gnagare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande experimentella protokoll godkändes av institutionens djurvård kommitté.
1. NEMO hos honråttor
- Förberedelse
- Placera en Sprague-Dawley-råtta vägande omkring 200 g under 3% isoflurananestesi, väga djuret, och raka och desinficera prepubic området 3 gånger med användning av en jod kirurgisk skrubba.
- På en värmedyna, tape bakbenen och svansen ned och ANVÄNDA KATETER blåsan med en 20-gauge angiokateter, som också är varsamt tejpas fast för att förhindra glidning.
- Dissektion
- Använda en skalpell för att utföra en 8 mm longitudinell hudincision från påtaglig blygdbenssammanfogningen mot uretra meatus. Lyft bort huden på båda sidor för att underlätta senare tillslutning av sår.
- Dissekera rakt på sak att identifiera den stentade urinröret genom längd sprids med fina sax. Placera fina själv behålla huden krokar för att öka exponeringenav urinröret.
- Utföra vissa mild longitudinell spridning med användning böjd sax dorsal till urinröret för att utveckla planet mellan urinrör och vagina. Sedan rakt på sak passera en 4-0 silke sutur bakom urinröret och förbereda den dubbla kasta av en kirurgknut.
- Partiell urin obstruktion
- Avlägsna angiokateter, placera en 0,9 mm metallstång parallellt med urinröret, och dra sedan åt knuten runt urinröret och metallstången, så att den senare fortfarande glider ut lätt därefter.
- Säkra knut med tre mer kast användning av försiktig spänning innan du tar bort stången. Skära suturen slutar ca 3 mm long, eller 4 mm om senare frisättning av obstruktion är en del av experimentet.
- sårtillslutning
- Närma paraurethral körtlar med användning av en begravd enda stygn av absorberbar flätad sutur 4-0.
- Stäng huden med en nedgrävd horisontell madrass stygn använder samma absorber SUTure. Notera: Även om det kan verka okonventionella att använda en absorber sutur för en hud-penetrerande stygn vi inte stöter på komplikationer såsom sårinfektioner och att sutur avlägsnande kan undvikas.
- efter vård
- Injicera buprenorfin 0,1 mg / kg subkutant innan de placeras råttan i en återhämtning bur.
- Erbjuder några mjuka återhämtning diet för de första 24 h för den inre Inrymt råtta. Efter denna period hus djur igen i samma par som innan förfarandet förutsatt att de mår bra och hör till samma behandlingsgrupp.
- Kontrollera råttorna dagligen i urinblåsan storlek och allmänt välbefinnande; registrera sin vikt minst varje vecka.
2. nemo i honmöss
- Förberedelse
- Placera en C57BL / 6 mus vägande ca 18 g och fortsätt som i detalj i steg 1.1.1.
- Gör så detaljerad i steg 1.1.2, med undantag för att använda en 24-gauge angiocatheter.
- Dissektion
- Använda en skalpell för att utföra en 6 mm longitudinell hudincision från påtaglig blygdbenssammanfogningen mot uretra meatus.
- Dissekera rakt på sak att identifiera den stentade urinröret genom längd sprids med fina sax. Lyft av neuro-vaskulära bunt kör ventralt på urinröret genom analog dissektion.
- Utföra vissa mild longitudinell spridning med användning böjd sax dorsal till urinröret för att utveckla planet mellan urinrör och vagina. Sedan rakt på sak passera en 5-0 icke absorber flätad sutur bakom urinröret och förbereda den dubbla kasta av en kirurgknut.
- Partiell urin obstruktion
- Ansluta angiokateter med en 1 ml spruta och injicera 0,1 ml av normal saltlösning in i urinblåsan.
- Placera en 26-gauge kanyl parallellt med urinröret. Försiktigt åt knuten runt urinröret och kanyl samtidigt som du drar tillbaka angiocath.
- Säkra knut med tre mer kast med hjälp av mild spänning innan du tar bort kanylen.
- Test för urin som uppträder vid meatus vid lätt tryck på djurets urinblåsa; lossa slips om det inte går att uttrycka urin. Annars skär suturen slutar ca 3 mm long.
- sårtillslutning
- Stäng huden med en nedgrävd horisontell madrass stygn med hjälp av en 5-0 flätad absorberbar sutur.
- efter vård
- Injicera 0,1 mg / kg buprenorfin subkutant innan de placeras musen i en återhämtning bur.
- Erbjuder några mjuka återhämtning diet för de första 48 h för den inre Inrymt musen. Efter denna period hus djur igen i samma grupper som innan förfarandet förutsatt att de mår bra och hör till samma behandlingsgrupp.
OBS: Möss med en påtaglig utspänd blåsa 24 timmar efter ingreppet som inte ogiltig vid hantering är över hindras och kommer att dö inom nEXT 1 - 2 dagar om inte tas tillbaka under narkos för borttagning av hindrande ligatur. - Kontrollera mössen dagligen i urinblåsan storlek och allmänt välbefinnande; registrera sin vikt minst varje vecka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nervsparande Mid-uretral obstruktion (NEMO) i honråttor
Dödlighet
Vi gjorde en mid-uretral obstruktion på över 40 honråttor hittills och hade inga dödlighet.
Bladder massa
Genomsnittlig relativ blåsmassa (blåsa-till-kropp-massförhållande) i skenopererade djur var 0,33% två veckor efter förfarandet, medan obstruerade råttor hade en genomsnittlig relativ blåsan massa av 0,60%, vilket leder till en ökning 85% (p = 0,004 ; Figur 1).
residualurin
Sham opererade råttor hade nästan ingen residualurin som vi kunde sugagenom direkt blåspunktion vid organskörd, mid-uretral obstruktion djur i kontrast hade en signifikant större genomsnittlig mängd av kvarvarande urin av 0,42 ml (p = 0,01; Figur 2).
Nervsparande Mid-uretral obstruktion (NEMO) i honmöss
Dödlighet
Sammantaget 18 honmöss genomgick en bluff nemo förfarande, och en av dem dog. För att kalibrera den nödvändiga graden av obstruktion, utvärderade vi 3 olika diametrar på kanyler (25-gauge, 26-gauge och 27-gauge) placerade längs urinröret när man binder suturen. Ingen av de 5 möss dog när vi använde en 25-gauge kanyl som en platshållare längs urinröret (figur 3). Å andra sidan, dödlighet ökat markant med mindre storlek platshållare. 1/8 eller 5/8 möss dog vid användning av en 26-gauge eller 27-gauge kanyl, respektive (p = 0,039, Fishers exakta test).
Bladder massa
NEMO hos kvinnliga möss med användning av en 25-gauge kanyl inte effektivt öka blåskroppsmassförhållande till (Figur 4). Användningen av en 26-gauge kanyl resulterade i en över två-faldig ökning i relativ blåsan massa (p = 0,04). När vi tillämpat en platshållare 27-gauge inträffade en ökning av relativ blåsan massa under 60% efter 2 veckor (p = 0,004).
residualurin
Liknande till råttor, honmöss tenderar att annullera vid induktion av anestesi. Vid skörd blåsorna, vi ockluderas blåshalsen med pincett och väges blåsan med urin och efter tömning av urin, detta tillåts för exakt beräkning av kvarvarande urin närvarande vid blåsan skörd. PBOO placera en 25-gauge eller en 26-gauge kanyl längs urinröret inte resulterade i en förändring av kvarvarande urin inom 2 veckor (Figur 5). Noterbart är endast mycket få djur ogiltigförklaras under induktion av anestesi, vilket står i kontrast till råttor som så gott som alla tomrum när inducerade. I de 3 möss överlevande NEMO med användning av en 27-gauge kanyl, medelvärde residualurin ökades med 3-faldigt jämfört med de respektive shams. Men skillnaden inte att uppnå statistisk signifikans, troligtvis på grund av den låga n.
Figur 1. NEMO inducerar Ökning i urinblåsan Mass efter 2 veckor effektivt. NEMO lett till en ökning 85% av blås-till-kropp-massförhållande inom 2 veckor (p = 0,004; §).
/55288/55288fig2.jpg"/>
Figur 2. Markerade Ökning av Residual Urin 2 Veckor efter NEMO. Medan skenopererade råttor hade nästan ingen resturin som kan vara nål-aspireras vid blås skörd, mid-uretral obstruktion djuren hade nästan 0,4 ml av kvarvarande urin vid genomsnittet (p = 0,013, §).
Figur 3. Dödligheten Ökar med graden av partiell obstruktion. En av 18 möss dog efter bluff NEMO förfarande. Vid användning av en 25-gauge kanyl som en platshållare längs urinröret, alla 5 drivs möss överlevde, medan 1/8 eller 5/8 möss dog vid användning av en 26-gauge eller 27-gauge kanyl, respektive (p = 0,039, Fishers exakta testa).
<strong> Figur 4. 26-gauge och 27-gauge Platshållare under NEMO resultera i effektiv Ökning av Relativ Bladder Mass efter 2 veckor. NEMO hos kvinnliga möss med användning av en 25-gauge kanyl resulterade inte i en signifikant ökning av relativ blåsan massa (§); när en enda 26-gauge kanyl användes, inträffade en över två-faldig ökning i relativ blåsan massa (p = 0,04; †); hinder med en platshållare 27-gauge resulterade i en ökning i relativ blåsan massa överstiger 60% (p = 0,004; ‡).
Figur 5. Bibehållen Bladder Tömning 2 Veckor efter NEMO. Med användning av en 25-gauge eller en 26-gauge kanyl längs urinröret under NEMO förfarande resulterade inte i en förändring av kvarvarande urin efter 2 veckor (§). Ökningen 3-faldig i genomsnittlig återstående urine volym i 27-gauge-gruppen jämfört med shams inte nådde statistisk signifikans (hindras n = 3; †).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurdödligheten är en av de största problemen för den traditionella modellen för pBOO vid den proximala urinröret, vid 15% eller mer i många rapporter 10, 11, 13. NEMO verkar ha minimal dödlighet när de appliceras i honråttor. Proximal urin hinder i möss är tekniskt mer utmanande än hos råttor och därmed ännu mer benägna att komplikationer. Med hjälp av en 26-gauge kanyl som platshållare för vår mid-urinrörets tillvägagångssätt, hade vi bara minimal djur dödlighet. I en pågående studie där vi tillämpat NEMO i honmöss med användning av en 26-gauge kanyl endast två ut av 18 möss över blockerat (data ej visade). Med användning av en mindre platshållare, såsom en 27-gauge kanyl under halv av blocke mössen dog på grund av över-obstruktion med urinretention eller blås bristning. Därför anser vi en platshållare 26-gauge vara en rimlig kaliber för honmöss av ca 18 g.
Ökning av urinblåsan massa är ett av kännetecknen av pBOO i human sjukdom. Vi identifierade NEMO att effektivt framkalla en betydande ökning av urinblåsan massan efter bara två veckor hos råttor samt möss. Genomsnittlig ökning av urinblåsan massan efter pBOO vid den proximala urinröret är över 2,5-faldigt efter 2 veckor och därmed mycket högre än vad vi observerat efter NEMO 12. En sådan kraftig ökning i organmassan dock inte återspeglar de flesta infravesical obstruktiv uropathies som forskare syftar till att modellera vid tillämpningen pBOO; i detta avseende, Nemo erbjuder en mindre invasiv och väl tolererad pBOO modell med en mer moderat remodeling-svar som är mycket närmare mänsklig patologi än den traditionella proximala pBOO. Desto mer uttalad ökning av blås massa i proximala pBOO är mest sannolikt relaterade till en denervering skada till följd av dissektion runt blåshalsen; denervering kan sedan äventyra detrusor-sfinkter överhörning ennd orsaka en funktionell loppsobstruktion även i skenopererade djur 12.
Kvarvarande urin också signifikant ökad hos honråttor som genomgår nemo efter bara två veckor. I möss på andra sidan, endast med hjälp av 27-gauge kanyl som en platshållare tenderade att öka mängden av kvarvarande urin i möss. Men medan råttor praktiskt taget alla tomrum när den placeras under gasformigt anestesi, vi inte observera detta i möss där endast mycket få annullerade när inducerade. Denna icke-tömningsbeteende hos möss förmodligen masker den sanna mängden kvarvarande urin och kräver en annan stimulans för att framkalla urinering i framtida studier.
Medan graden av obstruktion med användning av en 0,9 mm stång längs urinröret hos honråttor verkar vara lämpligt, att kombinera minimal djurdödlighet med en tydlig ökning av urinblåsan massan och kvarvarande urin, kalibrering av graden av obstruktion för NEMO i honmöss är merutmanande. Å ena sidan, med hjälp av en 25-gauge kanyl inte leda till en detekterbar ökning i urinblåsan massa, med hjälp av 27-gauge kanyl å andra sidan lett till över hinder i mer än hälften av mössen som genomgår pBOO. Endast 26-gauge kanyl hade en rimlig reaktion i termer av tillväxt orgel tillsammans med låg djurdödlighet.
Eftersom pBOO är klart vanligare hos män än hos kvinnor skulle använda handjur vara att föredra vid modellering av mänskliga pBOO. Vår nervsparande mitten urin obstruktion (NEMO) teknik uppenbarligen inte ta itu med denna brist att acceptera djurens hormonstatus påverkar inflammatoriska responsen som initierar vävnadsombildning. Den låga variabilitet och låg djurdödlighet av NEMO i möss, emellertid, kommer att göra undersökning av urinblåsan remodeling mottaglig för hela spektrumet av transgena metoder, som är mycket begränsade i större gnagare.
Sammanfattningsvis är Nemo för honråttor och honmösslätt att göra, har en låg djurdödlighet, och undviker denervering skada på blåsan resulterar från dissektion runt blåshalsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female rat | Charles-River Canada | Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400 | about 200 g |
| Isoflorane vaporizer | Benson medical industries inc. | TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO | |
| Isoflorane | Fresenius Kabi Animal Health | Isoflorane; product code CP0406V2 | 250 mL bottle |
| Disposable scalpel | Ted Pella, Inc. | #15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S | |
| Microscopy forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443 | |
| Adson forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9 | |
| Curved surgical scissors | Ted Pella, Inc. | Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376 | |
| 0.9 mm inox metal rod | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| Skin hooks - self made from inox steel | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| 4-0 Silk suture | esutures.com | 4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640 | |
| 5-0 Vicry suture | esutures.com | 5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H | |
| Needle holder | Medsupplier.com | Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC |
|
| Temgesic (Buprenorphine) | first veterinary supply | Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701 | |
| 1 mL syringe with 27 G needle | Fisher Scientific | BD Tuberculin Syringe, BD 309623 | |
| 20 G Angiocath | Fisher Scientific | Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906 | |
| Recovery diet | clearh2o | DietGel 31M; 72-08-5022 | |
| C57Bl/6 female mice | Charles-River Canada | C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027 | about 18 g |
| 24 G angiocath | Fisher Scientific | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340 | |
| 5-0 Ethibond | esutures.com | 5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H | |
| 26 G syringe needle | Sigma-Aldrich | BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392 | |
| Normal Saline | Baxter | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043 |
References
- Andersson, K. E. Storage and voiding symptoms: pathophysiologic aspects. Urology. 62 (5), 3-10 (2003).
- Boyle, P., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms in men and women in four centres. The UrEpik study. BJU Int. 92 (4), 409-414 (2003).
- Coyne, K. S., Wein, A., Nicholson, S., Kvasz, M., Chen, C. I., Milsom, I. Economic burden of urgency urinary incontinence in the United States: a systematic review. J Manag Care Pharm. 20 (2), 130-140 (2014).
- Buttyan, R., Chen, M. W., Levin, R. M. Animal models of bladder outlet obstruction and molecular insights into the basis for the development of bladder dysfunction. Eur. Urol. 32 (Suppl 1), 32-39 (1997).
- Mattiasson, A., Uvelius, B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 128 (6), 1340-1342 (1982).
- Chang, S., et al. Alteration of the PKC-mediated signaling pathway for smooth muscle contraction in obstruction-induced hypertrophy of the urinary bladder. Lab Invest. 89 (7), 823-832 (2009).
- Moore, J. A., Brading, A. F. A porcine model of bladder outlet obstruction incorporating radio-telemetered cystometry. BJU Int. 100 (5), 1192-1193 (2007).
- Beamon, C. R., Mazar, C., Salkini, M. W., Phull, H. S., Comiter, C. V. The effect of sildenafil citrate on bladder outlet obstruction: a mouse model. BJU Inte. 104 (2), 252-256 (2009).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Kang, Y. J., et al. Early Sequential Changes in Bladder Function after Partial Bladder Outlet Obstruction in Awake Sprague-Dawley Rats: Focus on the Decompensated Bladder. Korean J Urol. 52 (12), 835-837 (2011).
- Schroeder, A., et al. Protective effect of an oral endothelin converting enzyme inhibitor on rat detrusor function after outlet obstruction. J Urol. 172 (3), 1171-1174 (2004).
- Sidler, M., Aitken, K., Jiang, J., Bijos, D., Bägli, D. "sometimes a sham is just a sham" - why the rodent model of partial bladder outlet obstruction needs adjustment. J Urol. 195 (4), e379 (2016).
- Jin, L. H., et al. Persistent detrusor overactivity in rats after relief of partial urethral obstruction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (4), R896-R904 (2011).
