Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/55345
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

Summary

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

Abstract

הסינפסה החיסון הוא האזור של תקשורת בין תאי T, תאים אנטיגן (נגמ שים). תאי T polarize רצפטורים משטח וחלבונים לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית כדי להבטיח איגוד יציב אות exchange. מיקרוסקופ קונפוקלי, TIRF או רזולוציה סופר קלאסי שימשו ללמוד הסינפסה המערכת החיסונית. מאז שיטות אלו דורשות ייבוא תמונות ידנית, כימות גוזלת זמן, ההדמיה של מאורעות נדירים הוא מאתגר. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח מורפולוגי של עשרות אלפי תאים. הסינפסות המערכת החיסונית הם המושרה בין ראשי בתאי T אנושיים בהכנות פאן-ליקוציט Staphylococcus aureus enterotoxin ראג'י טעון-B SEB תאים כמו נגמ שים. ייבוא תמונות מתבצע באמצעות הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ, המשלבת תכונות של cytometer זרימה של מיקרוסקופ זריחה. אסטרטגיה חסימה מלאה לזוגות תא T/APC ואבחון הסינפסות החיסון הינו מסופק. כאשר זרימת עבודה זו מאפשרת הניתוח של החיסון synapses בהכנות ולזרימה פאן-ליקוציט ודורש ומכאן רק נפח קטן של דם (קרי, 1 מ"ל), ניתן להחיל אותה על דגימות מחולים. חשוב לציין, מספר דגימות מוכן, ולהשוואה ניתח במקביל.

Introduction

תאי T הרגולטורים העיקריים של מערכת החיסון מסתגלת, מופעלים באמצעות פפטידים antigenic המוצגים בהקשר של מתחמי histocompatibility הגדולות (MHC). הפעלה מלאה של תא T דורש שני אותות, האות כשירות באמצעות הקולטן תא T אנטיגן ספציפי (TCR) / CD3 מתחם, האות costimulatory באמצעות קולטנים אביזר. שני אותות שנוצרו באמצעות האינטראקציה הישירה של תאי T עם אנטיגן תאים (נגמ שים). נגמ שים בוגרים מספקים את האות מיומנות להפעלת T-cell דרך MHC-פפטיד מתחמי, הם מבטאים ליגנדים costimulatory (למשל, CD80 או CD86) כדי להבטיח את ההתקדמות של T-cell הפעלה1. פונקציה חשובה אחת של costimulation היא התארגנות מחודשת של3,42,שלד התא אקטין. בקליפת המוח F-אקטין היא סטטית יחסית ב נח בתאי T. תא T גירוי דרך מניבי אנטיגן נגמ שים מוביל שחלוף עמוקה של שלד התא אקטין. אקטין דינמיקה (קרי, אקטין מהר פלמור/depolymerization מעגלים) מאפשרים תאי T ליצור כוחות אשר משמשים להעברת חלבונים או organelles, למשל. יתר על כן, שלד התא אקטין חשוב לפיתוח אזור קשר מיוחד בין תאי T נגמ שים, שנקרא הסינפסה המערכת החיסונית. בשל חשיבות שלד התא אקטין את הסינפסה המערכת החיסונית, זה הפך חיוני לפתח שיטות כדי לכמת שלד התא אקטין של T תאים5,6,7,8 שינויים , 9.

על-ידי סיוע cytoskeletal אקטין, קולטנים משטח וחלבונים איתות מובדלים באשכולות הפעלה סופרא מולקולרית (SMACs) בתוך הסינפסה המערכת החיסונית. היציבות של הסינפסה המערכת החיסונית מובטחת על ידי קשירה של קולטני חבילות F-אקטין המגבירים את האלסטיות של שלד התא אקטין. היווצרות סינפסה החיסון הוכח להיות קריטית עבור הדור של ההיענויות החיסון מסתגלת. השפעות מזיקות של צורה פגומה סינפסה המערכת החיסונית ויוו התממשו קודם בחולים הסובלים מ תסמונת אולדריץ ויסקוט (WAS), מחלה אשר פלמור אקטין, / ת, נגרמת הפרעה היווצרות מערכת החיסון סינפסה10 . היה מטופלים עלולים לסבול אקזמה, דלקות חוזרות ונשנות חמורים, מחלות אוטואימוניות, מלנומה. למרות ממצא זה, כרגע לא ידוע אם המערכת החיסונית סינפסה היווצרות שונה בתאי T אנשים בריאים וחולים הסובלים החיסון מולדים או מחלות אוטואימוניות.

מיקרוסקופ פלורסצנטיות, כולל וידאו, TIRF, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ, שימשו לגלות את הארכיטקטורה המערכת החיסונית סינפסה11,12,13,14. הרזולוציה הגבוהה של מערכות אלה ועל האפשרות של ביצוע הדמיה לחיות תאים מאפשרת איסוף מידע מדויק, -עתיים על שלד התא של אקטין, פני שטח או תאיים חלבונים ב הסינפסה המערכת החיסונית. עם זאת, תוצאות רבות, מבוססות על ניתוח רק כמה עשרות תאי T. יתר על כן, תאי T חייבים להיטהר עבור סוגים אלה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עבור שאלות מחקר רבות, השימוש של תאים ולזרימה ולא את הרזולוציה הגבוהה ביותר-האפשר זאת, חשיבות עליונה. זה רלוונטי אם T תאים מחולים מנותחים, שכן כמות הדם שנתרמו מוגבל, ייתכן שיש צורך לעבד דוגמאות רבות במקביל.

הקמנו שיטות מיקרוסקופיים לאפשר הניתוח של שלד התא אקטין ב הסינפסה מחוסן16,15,המערכת האנושית17. שיטות אלה מבוססות על הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ18. כמו הכלאה בין זרימה מולטי ספקטריאליות cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הדמיה cytometry זרימה יש הייתרונות בניתוח מורפולוגי פרמטרים ולוקליזציה חלבון באוכלוסיות הטרוגניות התא, כגון פאן-לויקוציטים מ דם היקפיים. הצגנו מתודולוגיה המאפשרת לנו לכמת F-אקטין ב- T-תא/APC conjugates של תאים אנושיים T מדגימות דם מלא, ללא צורך זמן רב ויקרות טיהור צעדים17. הטכניקה המובאת כאן כוללת כל זרימת העבודה, מלקבל את דגימת הדם על כימות של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פאן-לויקוציטים

  1. צייר 1 מ"ל של דם היקפיים תורם בריא (או החולה) במזרק heparinized. הקפד לקבל אישור על-ידי ועדת האתיקה אחראי על תרומת דם.
  2. לערבב 1 מ"ל של ציוד היקפי האנושי דם עם 30 מ של מאגר פירוק ACK (150 מ מ NH4קלרנית, 1 מ מ KHCO3ו- 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.0) בשפופרת 50 מ ל, תקופת דגירה של 8 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. למלא את הצינורות עם PBS, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 6 דקות לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב30 מ"ל ACK פירוק המאגר.
  4. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3 עד תגובת שיקוע ברור. לבסוף, רוחצים את התאים ב- PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר, את resuspend בגדר תא ב- 2 מ של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

2. טעינת ראג'י תאים עם סאב

  1. להכין שני צינורות בז 15 מ"ל עם 1.5 x 106 תאים ראג'י למחזור. ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) וזורקים את תגובת שיקוע.
  2. Resuspend התאים שיורית בינוני (בערך 50 – 100 µL), להוסיף µL 1.9 (1.9 µG) סאב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוסף 5 מ של תרבות בינוני, ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) ואת resuspend בגדר תרבות בינוני (RPMI 1640 + 10% FCS)-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....

3. אינדוקציה של המערכת החיסונית הסינפסות, צביעת פרוטוקול

  1. פיפטה µL 500 של הכנת ראג'י טעון-SEB תאים לתוך צינור FACS, 500 µL ההכנה של תאים ראג'י לפרוק לתוך צינור FACS אחר. להוסיף µL 650 פאן-וחריגה של כל צינור ו ספין למטה התאים (300 גר' x 10 דקות בטמפרטורת החדר). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 150 µL של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (בדרך כלל למשך 45 דקות).
  2. בעדינות מערבולת התאים (10 s ב 1,000 סל"ד) ו להוסיף 1.5 מ של paraformaldehyde (1.5%) במהלך המערבולת כדי לתקן את התאים. לעצור את הקיבעון על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA. גלולה התאים (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר, resuspension בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS + 1% BSA לאחר המקננת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  3. גלולה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend תאי µL 100 של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize את התאים (96-ובכן לוח, בצורת U).
  4. לשטוף את התאים PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין עם צנטריפוגה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend בגדר תא ב- 50 µL של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין המכיל נוגדנים מתויג fluorophore או תרכובות (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), ודאפי (1:3, 000)).
  5. דגירה התאים בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות לשטוף את התאים 3 פעמים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA + סאפונין 0.1%. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות בטמפרטורת החדר. Re-resuspend תאי µL 60 ל- PBS עבור הדמיה cytometry זרימה.

4. התמונה רכישה באמצעות Cytometer של זרימה

הערה: הבאים התמונה רכישה בהליך ניתוח ממצאים מבוססים על הדמיה cytometry זרימה באמצעות תוכנה כגון imagestream (IS100), אינספייר ורעיונות. עם זאת, cytometers זרימה אחרים תוכנת ניתוח יכול לשמש גם.

  1. פתח ניתוח תוכנה על המחשב מחובר cytometer זרימה, לחץ על אתחל פלואידיקה של התפריט מכשיר הדמיה. להחיל את החרוזים ביציאה הנכונה כאשר תתבקש לעשות זאת.
  2. לטעון את התבנית שתוגדר כברירת מחדל מתוך תפריט קובץ ולחץ על הפעל/התקנה. לבחור חרוזים מתוך התפריט הנפתח ' תצוגה '.
  3. התאם את אלומת האור הבהיר-שדה על-ידי לחיצה על הגדר עוצמת אם הערך שצוין הוא מתחת ל-200.
  4. הפעל את הכיול של שיגרת הבדיקה בכרטיסיה סיוע על-ידי לחיצה על התחל כל.
  5. לחץ על סומק/נעל/לטעון ולהחיל את הדגימות בנמל השמאלי כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר טעינת התאים cytometer זרימה, לפתוח את המסווג תא ולהתאים את הערכים כדלקמן: שיא עוצמת הגבול העליון-1,022 עבור כל ערוץ, שיא עוצמת הגבול התחתון 50 בערוץ 2 (דאפי) וכל ערוץ 5 (CD3-Pe-TxR), אזור הגבול התחתון-50 ערוץ 1 (לצד פיזור) והגבול העליון ב- 1,500.
  6. לשנות את עוצמת הלייזר עירור 405 ננומטר (15 מגוואט), 488 ננומטר (200 mW), ו 647 nm (90 mW) בכרטיסיה התקנה.
  7. לעבור את התפריט הנפתח בתצוגת בין תאים, חרוזים כדי להעריך את ההתאמות כוח תא המסווג ולייזר.
    הערה: ודא כי כל התאים וזוגות תא נמצאו התצוגה תא כי תא גושים, פסולת, תמונות עם פיקסלים רווי נמצאים בתצוגה פסולת על-ידי שינוי המסווגים את התא ו/או כוחות לייזר עירור.
  8. להגדיר השם לדוגמה ואת כמות תמונות לרכוש (15,000 – 25,000 לדוגמאות) ו-500 עבור פקדים פיצוי הכרטיסיה התקנה לחץ על התקנה/הפעלה כדי להפעיל את הרכישה.

5. ניתוח נתונים

  1. העברת קבצים תמונת raw (.rif) אל המחשב ניתוח נתונים ופתחו את תוכנת ניתוח.
  2. לייצר מטריצה פיצוי ועקוב אחר ההוראות של מהרשימה הנפתחת פיצוי. שמירת המטריקס פיצויים comp_Date.ctm.
  3. פתח את קובץ תמונת raw לדוגמה (.rif) ולהחיל את comp_Date.ctm בחלון שמופיע לייצר את קובצי התמונה מדובבים (.cif), קובץ ניתוח הנתונים המוגדר כברירת מחדל (.daf).
  4. פתח את קובץ התמונה מדובבים. המרת התמונות למצב צבע ולהתאים את טבלאות בדיקת מידע כדי לקבל צבעים אופטימלית גלוי בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. להשיג את התמונה התמזגו RGB באמצעות הכרטיסיה הפרדות של הכלים מאפייני גלריית תמונות.
  5. פתח את מנהל מסכת מהרשימה הנפתחת ניתוח. ליצור מסכות להגדיר תאי T של הסינפסה המערכת החיסונית, כדלקמן:
    1. בחר את המסכה T-cell: "((Threshold_Ch05, 60) מילוי." בחר את המסכה העמק: "Valley(Ch02,3)." בחר את המסכה סינפסה T-cell: "T-cell המסכה של עמק (M02, Ch02, 3)."
  6. פתח את מנהל תכונה מהרשימה הנפתחת ניתוח. לחשב את התכונות הבאות:
    1. עבור הביטוי CD3 סה ב- T תאים, בחר "Intensity_T-cells_Ch5." עבור הסכום הכולל של F-אקטין בתאי T, בחר "Intensity_T-cells_Ch6." להבעה CD3 הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch5." עבור כמות F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch6."
    2. כדי לחשב את השטח T-cell, בחר "Area_T-התאים." כדי לחשב את השטח סינפסה המערכת החיסונית T-cell, בחר "Area_T-תא סינפסה."
  7. לקבוע את F-אקטין והעשרה CD3 ב הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות המשוואה במנהל תכונה:
    Equation
  8. להחיל את האסטרטגיה הבאה חסימה באמצעות היסטוגרמות ומתכנן נקודה מאזור הניתוח (עבור עוד פרטים, ראה הפניות 17, 19):
    1. למחוק את התאים out-of-להתמקד על ידי התוויית "RMS_M2_Ch2 מעבר" בהיסטוגרמה; הגדר את הסף בגיל 15.
    2. מגרש בבית המשפט לביטחון המדינה נגד CD3 בעוצמה בחלקה נקודה. להגדיר שער על אירועים CD3-חיוביות.
    3. העלילה על "יחס" של M02 (דאפי כתם) לעומת האזור של M02 (דאפי כתם). שער ב- T-cell ללבישה ותא זוגות בהתאם. תקן לזוגות תא נכון תוך שימוש בשטח המסכה סינפסה, כפי שתואר לעיל17,19.
    4. לקבוע את כמות F-אקטין ב- T-cell ללבישה ותאי T של T-תא/APC זוגות, האחוזים של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יעד מרכזי של השיטה המתוארת כאן היא כימות של העשרה חלבונית (למשל, F-אקטין) ב הסינפסה המערכת החיסונית בין אם פונדקאית נגמ שים (ראג'י תאים) ותאי T ב ולזרימה פאן-לויקוציטים נלקחו דגימות דם אדם בנפח נמוך (1 מ"ל). צילום מסך באיור 1 נותן סקירה של האסטרטגיה המגביל קריטי של שיטה זו. זה מראה את גלריית תמונות בצד השמאל ואת האזור ניתוח מימין (איור 1). גלריית תמונות מראה את השער "במבט חדש". התמונות מתוארים הן בעיקר גרנולוציטים ו T-תא/APC שני זוגות. F-אקטין, CD3 מועשרים במספר בני הזוג 30272 של התאים. האסטרטגיה המגביל לכמת את כמות תא זוגות עם העשרה כזה מוצג באזור הניתוח, מתואר בפרוטוקול (ראה שלב 5.8) או במקום אחר17,19. העלילה נקודה אחרונה באזור הניתוח מציג את הסכום (אחוז חלבון) של CD3 (ציר x) ו- F-אקטין (ציר y) ב הסינפסה המערכת החיסונית. אם יותר מ 30% של החלבון היה ממוקם בתוך המסיכה סינפסה המערכת החיסונית, הוא נחשב כמו העשרה חלבונית המערכת החיסונית סינפסה20. נקודה חלקות העשרה המכיל נתונים שימשו כדי לייצר תוצאה סופית (איור 2 א). דימויים משמאל מציגה תמונות לדוגמה של conjugates T-תא/APC, עם כמויות נמוכות של CD3 ו F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית, ואילו בצד הימין, conjugates T-תא/APC מתוארים עם העשרת חזקה של CD3 ו F-אקטין. הכמות של CD3-הסינפסה המערכת החיסונית (אחוז חלבון) מותווה בציר ה-x, הכמות של F-אקטין-הסינפסה המערכת החיסונית מותווה בציר ה-y. האחוז בשער מייצגת את כמות תאי T יש של העשרה של CD3 ו F-אקטין-הסינפסה המערכת החיסונית בנוכחות סופר אנטיגן. בהיעדר סופר אנטיגן, 15% אחוז תאי T הראו העשרה על הסינפסה המערכת החיסונית של CD3 ו- F-אקטין. כמות התאים עלה ל 29% בנוכחות סופר אנטיגן. כימות יחיד של CD3 העשרה (איור 2B) או F-אקטין העשרה (איור 2C) מוצג את הנוכחות ואת היעדר סופר אנטיגן. תוצאות אלו מראות כי בהיעדר של סופר אנטיגן, 18.3 ± 3.5%, בנוכחות סופר אנטיגן, ± 34.3 4.0% מן הסכום הכולל F-אקטין התאים היו הצטברו הסינפסה המערכת החיסונית. מעניין, היה כבר הצטברות CD3 בהיעדרו של סופר אנטיגן (16.6 ± 2.1% מהסכום הכולל CD3), אשר היה משמעותי מוגברת על ידי התוספת של סופר אנטיגן (24.6 ± 3.0% מהסכום הכולל CD3). שיטה זו מאפשרת כימות של כמה חלבון שנצבר על הסינפסה המערכת החיסונית בין תאי T נגמ שים.

Figure 1
איור 1: Gating אסטרטגיה לצורך זיהוי מערכת החיסון סינפסות ליקוציט פאן תכשירים. האיור מציג צילום מסך של התוכנה ומכיל זרימת עבודה ניתוח מלא על ההערכה של העשרת CD3 ו F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית של תאי T מצומדת כדי נגמ שים בנוכחות SEB. תמונות מוצגות בגלריית תמונות בצד השמאל (Ch2 = דאפי; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; מיזוג = image משולבים המכילים Ch2, Ch5 ו- Ch6). התוכנה מספקת סרגל הכלים של תצוגת תמונה להתאמת טבלאות בדיקת מידע, מסיכת תצוגה של מצב צבע/גווני אפור. מחלקו הימני של המסך מציג את אזור הניתוח ואת הכלים ניתוח. אזור הניתוח מכיל היסטוגרמות ומתכנן נקודה כדלקמן: 1) להיסטוגרמה כדי למצוא תאים במיקוד על פי התכונה RMS הדרגתי של ההכתמה דאפי. 2) gating בתאי T על פי הביטוי של CD3 (Intensity_MC_Ch05, ציר x), פרופיל פיזור הצד (Intensity_MC_Ch01, ציר ה-y). Gating 3) פוטנציאל T-תא/APC לזוגות על פי יחס הרוחב-גובה הכתם דאפי (היבט ratio_M02, ציר y) והפרופיל לצד פיזור (Intensity_MC_Ch01, ציר x). 4) gating לזוגות T-תא/APC נכון על פי המסכה סינפסה באזור (ציר x) ואזור של הכתם CD3 (ציר y). 5) gating על בוגר הסינפסות המערכת החיסונית שהוגדרו על-ידי העשרה (> 30% תכולת החלבון בממשק) של CD3 (ציר x) ו- F-אקטין (ציר y) ב הסינפסה המערכת החיסונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הדמיה על העשרה CD3 ו F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית נתונים cytometry זרימה. (א) הנקודה במרכז מראים את האחוז של CD3 (ציר x) ו- F-אקטין (ציר y) ב הסינפסה המערכת החיסונית. T-תא/APC conjugates עם סינפסה המערכת החיסונית בוגר בהעדר (החלק העליון) או נוכחות (החלק התחתון) של סאב מתוארים. הדימויים בתכנית השמאלי T-תא/APC זוגות עם רמה נמוכה של העשרה CD3 ו F-אקטין, ואילו התמונות על הזכות להציג זוג T-תא/APC עם רמה גבוהה של העשרה CD3 ו F-אקטין (בוגר המערכת החיסונית סינפסה). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (השמאלי התחתון). התוצאה היא נציגה של 3 ניסויים עצמאית. (בג) זאת אומרת CD3 (B) או F-אקטין (C) העשרה של הסינפסה המערכת החיסונית ב נוכחות או היעדרות של סאב מוצג אחוז חלבון (n = 3; SE). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר כימות של המערכת החיסונית הסינפסות. בין תאי T אנושיים (ex-vivo) נגמ שים. ראוי לציין, פן כדוריות דם אדומות-lysed-לויקוציטים שימשו כמקורות T-cell, ביצוע פעולות טיהור T-cell לוותר. הקו תא B-cell לימפומה ראג'י שימש הפונדקאית נגמ שים. זה נושא יתרונות משמעותיים, שכן הוא מאפשר השוואות בין תורמים דם של הצד T-cell של הסינפסה המערכת החיסונית. יתר על כן, עצמיים DCs זמינים בקושי ישירות מן הפריפריה דם אנושי. הייצור של תאים דנדריטים נגזר מונוציט (moDCs) אורכת מספר ימים, שהופך את היישום מחקרים קליניים מאתגר. עם זאת, מיכשור הדמיה ואסטרטגיה ניתוח המובאות כאן ניתן ליישם אחרים נגמ שים (למשל, transdifferentiated נויטרופילים)20. יתר על כן, הוכח כי המערכת החיסונית הסינפסה בין תאי CD4 T ו- ex-vivo DCs9 או תאי B21 יכול להידרש עבור עכברים באמצעות הדמיה cytometry זרימה. לכן, בשיטה זו ניתן ולעשותו כדי להעריך את הפונקציה APC בנוסף לצד T-cell של הסינפסה המערכת החיסונית.

השלבים הקריטיים ביותר של מתודולוגיה זו הם ערבוב של פאן-לויקוציטים ו נגמ שים באמצעי אחסון קטן וביצוע המגביל האסטרטגיה הנכונה כדי לא לכלול חיובי-false אירועים בזמן ובו בזמן למזער את אובדן אמיתי הסינפסות המערכת החיסונית. בעוד אנו מתארים את המדידה של הצטברות CD3 ו F-אקטין, שיטה זו אינה מוגבלת חלבונים אלה, ניתן להרחיב רצפטורים משטח אחרים, כגון LFA-117,19. יתר על כן, התוספת של נוגדנים fluorophore שאותה ניתן להתאים לזהות קבוצות T-cell (למשל, CD4, CD8, CD45RA או כימוקין קולטנים) תאפשר עבור חקר הטבע של תאי T הצגת המערכת החיסונית סינפסה פנוטיפ מסוים. חשוב, כמות הדם הדרוש עבור ניתוח כזה הוא נמוך (מרבי: 1 מ"ל). בעוד הדור הראשון של הדמיה זרימה cytometers, משמש כאן (IS100), יש שיעור רכישת התמונה של-100 תאים/s, הדור השלישי של הדמיה זרימת cytometers (IsXMKII) מאפשר שיעור גבוה יותר של רכישת התמונה (עד 2,000 תאים/s באמצעות מטרה 40 x). לפיכך, זרימת העבודה בפועל, מן הציור הדם כדי ניתוח נתונים, דורש פרק זמן קצר במידה ניכרת (קרי, יום אחד). ראוי לציין, בזמן הניתוח הציג תמונה מבוססת על מיכשור הדמיה, תא והכנה של אינדוקציה של המערכת החיסונית הסינפסות (דהיינו, החלק הראשון של זרימת העבודה) ניתן ליישם טכניקות דימות אחרים22.

בניגוד cytometry זרימה, הדמיה חלקות נקודה שהושג cytometry זרימה מכילים מידע על חלבון לוקליזציה בנוסף לנתונים ביטוי חלבון. כוח אחד של הדמיה cytometry זרימה הוא כי תאים (או זוגות תא) של כל שער שנבחר ניתן להעריך לפי העין; ניתן להתאים את גבולות שער בהתאם, פשוט על ידי לחיצה על הנקודות, בוחן את התמונה המתאימה. בניסויים שלנו, מצאנו כי 30% חלבון העשרה הוא ערך אמין לשקול הזוג תא בהתאמה כבעלי החלבון עניין מועשר. ברגע השערים נקבעו בסופו של דבר, כל המאפיינים, אסטרטגיה המגביל נשמרים בקובץ נפרד (.ast), ניתן להחיל על כל מדגם הבאים כדי להבטיח הערכה לא משוחדת.

החולשות של הדמיה cytometry זרימה הן המגבלה רזולוציה (0.5 מיקרומטר באמצעות מטרה 40 x) ואת העובדה ניתן לנתח את המטוס מוקד אחד בלבד. לכן שיטה זו אינה מתאימה לנתח את המבנה הדק של הסינפסה המערכת החיסונית ואת המופע של microclusters14. כדי לנתח כזה היבטים הקשורים ארכיטקטורה של הסינפסה המערכת החיסונית, לסירוגין טכניקות, כגון וידאו, TIRF, או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר, נדרשים. הכוח של מיכשור הדמיה הוא הכמות של תמונות ניתן לרכוש עבור דגימה (עד 25,000). ראוי לציין, כל תמונה הוא מקוטע, מה שאומר כי הרקע הוא בנוק-אאוט, והוא שם בדרך כלל תא בודד אחד בלבד או כמה תאים לכל תמונה. מאפיינים אלו של cytometry זרימה הדמיה מהווים את הבסיס לניתוח אוטומטיות ברמת תא בודד. יתר על כן, כמות גבוהה של תאים מנותחים לדגימה מאפשרים זיהוי אמין של מאורעות נדירים (קרי, subpopulations או תא זוגות עם תדירות מתחת 1%). חשוב, זרימת העבודה המוצגת כאן ניתן להחיל על המחקר של מערכת החיסון סינפסה-צורה שמחוץ תאי-T ב- pan-לויקוציטים של חולים הסובלים ממחלות הקשורות החיסון (למשל, החיסוני הראשוני הפרעות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה מומן על ידי המועצה למחקר גרמני (DFG) עם מענקים לא. SFB-938-M ו- SA 393/3-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Tags

סינפסה חיסוניים ואימונולוגיה זיהום גיליון 143 זרימה cytometer cytometry זרימה Iimaging תאי T שלד התא אקטין מערכת החיסון האנושית גמישים
ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wabnitz, G., Kirchgessner, H.,… More

Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter