تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي
Summary
وهنا يصف لنا سير عمل كاملة للتحليل النوعي والكمي مأمن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية الأولية وتقديم مستضد الخلايا. ويستند الأسلوب التصوير التدفق الخلوي، التي تسمح باكتساب وتقييم عدة آلاف خلية الصور خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن.
Abstract
المشبك المناعي هو مجال الاتصال بين خلايا T وخلايا مستضد-عرض (Apc). استقطاب خلايا تي مستقبلات سطحية والبروتينات نحو المشبك المناعي لضمان ربط مستقرة وتبادل الإشارات. وقد استخدمت مجهرية [كنفوكل]، TIRF، أو دقة فائقة الكلاسيكية لدراسة المشبك محصنة. منذ هذه الأساليب تتطلب الحصول على دليل الصور والقياس الكمي تستغرق وقتاً طويلاً، تصوير الأحداث النادرة الصعبة. هنا، يمكننا وصف سير عمل التي تمكن من تحليل الخصائص المورفولوجية لعشرات آلاف خلايا. هي الناجم عن الاشتباكات العصبية المناعية بين خلايا تي البشرية الأولية في الأعمال التحضيرية لعموم-الكريات البيض وخلايا راجي محملة ب سيب معوي المكوّرات العنقودية الذهبية كناقلات الجنود المدرعة. يتم الحصول على الصور بالتصوير التدفق الخلوي، وتسمى أيضا الفحص المجهري في التدفق، الذي يجمع بين ميزات cytometer تدفق ومجهر الأسفار. تقدم استراتيجية النابضة كاملة لتحديد الخلية T/APC الأزواج وتحليل الاشتباكات العصبية المناعية. كما يقوم سير العمل هذا يسمح تحليل المناعة synapses في الأعمال التحضيرية لعموم أونبوريفيد-الكريات البيض ومن ثم يتطلب سوى كمية صغيرة من الدم (أي، 1 مل)، فإنه يمكن تطبيقها على عينات من المرضى. الأهم من ذلك، عدة عينات يمكن أعدت، وقياسها، وتحليلها بالتوازي.
Introduction
خلايا T المنظمين الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ويتم تنشيطها عن طريق الببتيدات مستضدي التي ترد في سياق مجمعات histocompatibility الرئيسية (MHC). يتطلب التنشيط تي خلية كاملة إشارتين، إشارة الكفاءة عن طريق مستقبلات تي خلية محددة مستضد (تكر)/CD3 المعقدة وإشارة كوستيمولاتوري عن طريق مستقبلات التبعي. كلا إشارات يتم إنشاؤها من خلال التفاعل المباشر للخلايا T مع عرض مستضد الخلايا (Apc). ناقلات الجنود المدرعة ناضجة توفر إشارة اختصاص لتنشيط تي خلية عن طريق المجمعات MHC-الببتيد، ويعربون عن يغاندس كوستيمولاتوري (مثل، CD80 أو CD86) لضمان تطور تي خلية التنشيط1. واحدة من الوظائف الهامة كوستيمولاتيون هو إعادة ترتيب أكتين سيتوسكيليتون2،،من34. واو-أكتين القشرية ثابتة نسبيا في استراحة خلايا تي. التحفيز تي خلية عن طريق ناقلات الجنود المدرعة تحمل مستضد يؤدي إلى إعادة ترتيب عميقة cytoskeleton أكتين. ديناميات أكتين (أي الدوائر البلمرة/ديبوليميريزيشن، أكتين سريعة) تمكين الخلايا T لإنشاء القوات التي تستخدم لنقل البروتينات أو العضيات، على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، المهم cytoskeleton أكتين لتطوير منطقة خاصة لاتصال بين خلايا تي وناقلات الجنود المدرعة، تسمى المشبك محصنة. نظراً لأهمية cytoskeleton أكتين المشبك المناعية، فقد أصبح أساسيا لتطوير أساليب لقياس التغيرات في سيتوسكيليتون أكتين تي الخلايا5،6،،من78 , 9.
عن طريق المعونة cytoskeletal أكتين، المستقبلات السطحية والبروتينات مما يشير إلى فصل في مجموعات التنشيط سوبراموليكولار (سماكس) داخل المشبك محصنة. وأكد استقرار المشبك محصنة بربط مستقبلات لحزم واكتين أن زيادة مرونة cytoskeleton أكتين. تشكيل المشبك المناعي قد ثبت أن تكون حاسمة لتوليد الاستجابات المناعية التكيفية. الآثار الضارة لتشكيل المشبك مأمن المعيبة المجراة في تحققت أولاً في المرضى الذين يعانون من ويسكوت ألدريتش متلازمة (WAS)، مرض في بلمرة الأكتين فيها، وفي الوقت ذاته، نشعر بالقلق تشكيل المشبك مأمن10 . وكان يمكن أن المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة وأمراض المناعة الذاتية، الاكزيما والالتهابات الحادة المتكررة. وعلى الرغم من هذا الاستنتاج، حاليا لا يعرف عما إذا كان تشكيل المشبك المناعي يختلف في خلايا تي من الأشخاص الأصحاء والمرضى الذين يعانون من عيوب في المناعة أو أمراض المناعة الذاتية.
مجهرية الأسفار، بما في ذلك [كنفوكل]، TIRF ومجهرية فائقة القرار، استخدمت للكشف عن بنية المشبك محصنة ضد11،12،،من1314. عالية الدقة لهذه النظم وإمكانية أداء تصوير خلية يعيش يتيح جمع المعلومات الدقيقة، والزمانية عن cytoskeleton أكتين والبروتينات السطحية أو داخل الخلايا في المشبك محصنة. ومع ذلك، العديد من النتائج، تستند إلى تحليل سوى بضع عشرات من خلايا تي. وعلاوة على ذلك، يجب تنقية الخلايا T لهذه الأنواع من الأسفار مجهرية. ومع ذلك، للعديد من الأسئلة البحثية، استخدام الخلايا أونبوريفيد بدلاً من هذا القرار أعلى درجة ممكنة أهمية قصوى. وهذا ذات الصلة إذا كان يتم تحليل خلايا تي من المرضى، نظراً لكمية الدم المتبرع به محدودة وقد تكون هناك الحاجة معالجة العديد من العينات في نفس الوقت.
وأنشأنا الطرق المجهرية التي تسمح بتحليل cytoskeleton أكتين في المشبك محصنة في ال16،15،نظام الإنسان17. وتستند هذه الأساليب التصوير التدفق الخلوي، كما دعا في التدفق المجهري18. هجين بين مجهرية متعددة الأطياف التدفق الخلوي والأسفار، التصوير التدفق الخلوي بقوتها في تحليل معلمات المورفولوجية والتعريب البروتين في الخلية غير متجانسة من السكان، مثل عموم-الكريات البيضاء من الدم المحيطي. قدمنا منهجية التي تمكننا من قياس واكتين في تي-خلية/APC يصرف الخلايا البشرية من عينات الدم كله، دون الحاجة إلى خطوات تنقية تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا17. التقنية المقدمة هنا يشمل سير العمل كله، من الحصول على عينة الدم للتحديد الكمي لواو-أكتين في المشبك محصنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكين سير العمل المقدمة هنا التحديد الكمي للمناعة نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية (السابقين فيفو) وناقلات الجنود المدرعة. جدير بالذكر أن تفكيك كرات الدم الحمراء عموم الكريات البيضاء استخدمت كمصادر تي خلية، مما يجعل خطوات تنقية تي خلية يمكن الاستغناء عنها. خط خلية سرطان الغدد الل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل الذي كان يموله مجلس البحوث الألمانية (DFG) مع منح لا SFB-938-M و SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
