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Immunology and Infection

इमेजिंग प्रवाह Cytometry का उपयोग कर मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा Synapse के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/55345
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

Summary

यहां, हम प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं और प्रतिजन-पेश कोशिकाओं के बीच प्रतिरक्षा synapses के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पूर्ण कार्यप्रवाह का वर्णन । विधि इमेजिंग फ्लो cytometry, जो समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि के भीतर अधिग्रहण और कई हजार सेल छवियों के मूल्यांकन की अनुमति देता है पर आधारित है ।

Abstract

प्रतिरक्षा synapse के बीच संचार का क्षेत्र है टी कोशिकाओं और प्रतिजन-पेश कोशिकाओं (APCs). टी कोशिकाओं सतह रिसेप्टर्स और प्रतिरक्षा synapse की दिशा में प्रोटीन का ध्रुवीकरण के लिए एक स्थिर बाध्यकारी और संकेत विनिमय आश्वासन देता हूं । शास्त्रीय फोकल, TIRF, या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी प्रतिरक्षा synapse अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । चूंकि इन तरीकों मैनुअल छवि अधिग्रहण और समय लेने वाली ठहराव की आवश्यकता होती है, दुर्लभ घटनाओं की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है । यहाँ, हम एक कार्यप्रवाह है कि कोशिकाओं के हजारों के दसियों के रूपात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है का वर्णन. इम्यून synapses को पैन-ल्युकोसैट तैयार करने में प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के बीच प्रेरित किया जाता है और Staphylococcus aureus enterotoxin बी (एसईबी)-्ज् के रूप में भरी APCs कोशिकाएं. छवि अधिग्रहण इमेजिंग प्रवाह cytometry के साथ किया जाता है, में भी कहा जाता है प्रवाह माइक्रोस्कोपी, जो एक प्रवाह cytometer और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की सुविधाओं को जोड़ती है. टी सेल/APC जोड़ों की पहचान करने और प्रतिरक्षा synapses का विश्लेषण करने के लिए एक पूर्ण गेटिंग रणनीति प्रदान की जाती है । इस कार्यप्रवाह के रूप में शुद्ध पान-ल्युकोसैट की तैयारी में प्रतिरक्षा synapses के विश्लेषण की अनुमति देता है और इसलिए रक्त की केवल एक छोटी मात्रा (यानी, 1 मिलीलीटर) की आवश्यकता है, यह रोगियों से नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, कई नमूनों तैयार किया जा सकता है, मापा, और समानांतर में विश्लेषण ।

Introduction

टी कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रमुख नियामकों रहे है और प्रतिजनी पेप्टाइड्स कि प्रमुख histocompatibility परिसरों (MHC) के संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे है के माध्यम से सक्रिय कर रहे हैं । पूर्ण टी सेल सक्रियकरण दो संकेतों, प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर (TCR)/CD3 जटिल और गौण रिसेप्टर्स के माध्यम से costimulatory संकेत के माध्यम क्षमता संकेत की आवश्यकता है । दोनों संकेतों प्रतिजन-पेश कोशिकाओं (APCs) के साथ टी कोशिकाओं की सीधी बातचीत के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं । परिपक्व APCs MHC-पेप्टाइड परिसरों के माध्यम से टी-सेल सक्रियण के लिए क्षमता संकेत प्रदान करते हैं, और वे costimulatory लाइगैंडों व्यक्त (जैसे, CD80 या CD86) टी सेल सक्रियण1की प्रगति को आश्वस्त करने के लिए । costimulation का एक महत्वपूर्ण कार्य actin cytoskeleton2,3,4की पुनर्व्यवस्था है । cortical एफ actin टी कोशिकाओं आराम में अपेक्षाकृत स्थिर है । प्रतिजन-असर APCs के माध्यम से टी सेल उत्तेजना actin cytoskeleton की एक गहन पुनर्व्यवस्था की ओर जाता है । Actin गतिशीलता (यानी, फास्ट Actin बहुलकीकरण/depolymerization हलकों) टी कोशिकाओं को सक्षम बलों है कि प्रोटीन या organelles, उदाहरण के लिए परिवहन के लिए उपयोग किया जाता है बनाने के लिए । इसके अलावा, actin cytoskeleton टी कोशिकाओं और APCs के बीच एक विशेष संपर्क क्षेत्र के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, प्रतिरक्षा synapse कहा जाता है । प्रतिरक्षा synapse के लिए actin cytoskeleton के महत्व के कारण, यह करने के लिए तरीकों का विकास आवश्यक हो गया है टी कोशिकाओं के actin cytoskeleton में परिवर्तन यों तो5,6,7,8 , 9.

actin cytoskeletal सहायता, सतह रिसेप्टर्स और संकेतन प्रोटीन के माध्यम से प्रतिरक्षा synapse के भीतर supramolecular सक्रियण क्लस्टर (SMACs) में अलग कर रहे हैं. प्रतिरक्षा synapse की स्थिरता रिसेप्टर्स के बंधन से एफ actin बंडलों कि actin cytoskeleton की लोच बढ़ाने के लिए आश्वासन दिया है । प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है । vivo में एक दोषपूर्ण प्रतिरक्षा synapse गठन के हानिकारक प्रभाव पहले Wiskott Aldrich सिंड्रोम से पीड़ित रोगियों में महसूस किया गया (था), एक रोग जिसमें actin बहुलकीकरण और, concomitantly, प्रतिरक्षा synapse गठन परेशान कर रहे हैं10 . रोगियों एक्जिमा, गंभीर आवर्तक संक्रमण, स्व-प्रतिरक्षित रोग, और melanomas से पीड़ित कर सकते हैं । इस खोज के बावजूद, यह वर्तमान में ज्ञात नहीं है कि प्रतिरक्षा synapse गठन स्वस्थ व्यक्तियों और प्रतिरक्षा दोष या स्व-प्रतिरक्षित रोगों से पीड़ित रोगियों की टी कोशिकाओं में अलग है ।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सहित, फोकल, TIRF, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, प्रतिरक्षा synapse11,12,13,14की वास्तुकला को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन प्रणालियों के उच्च संकल्प और लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन की संभावना actin cytoskeleton और प्रतिरक्षा synapse में सतह या intracellular प्रोटीन के बारे में सटीक, spatio-लौकिक जानकारी के संग्रह में सक्षम बनाता है । कई परिणाम, तथापि, टी कोशिकाओं के केवल कुछ दसियों के विश्लेषण पर आधारित हैं । इसके अलावा, टी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के इन प्रकार के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए । तथापि, कई शोध प्रश्नों के लिए, पतित कोशिकाओं के उपयोग के बजाय उच्चतम-संभव संकल्प अत्यंत महत्व का है । यह प्रासंगिक है अगर रोगियों से टी कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं, के बाद से दान रक्त की मात्रा सीमित है और वहां के लिए समानांतर में कई नमूनों की प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है ।

हम सूक्ष्म तरीके कि मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा synapse में actin cytoskeleton के विश्लेषण की अनुमति की स्थापना की15,16,17। इन तरीकों इमेजिंग प्रवाह cytometry पर आधारित हैं, में भी कहा जाता है-प्रवाह माइक्रोस्कोपी18। multispectral प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बीच एक संकर के रूप में, इमेजिंग प्रवाह cytometry रूपात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने में अपनी ताकत है और विषम कोशिका आबादी में प्रोटीन स्थानीयकरण, जैसे पान-ल्यूकोसाइट्स से परिधीय रक्त । हम एक पद्धति है कि हमें टी में एफ actin-सेल/पूरे रक्त के नमूनों से मानव टी कोशिकाओं के APC conjugates, समय की जरूरत है और महंगा शुद्धीकरण कदम17की आवश्यकता के बिना सक्षम बनाता है शुरू की । यहां प्रस्तुत तकनीक पूरे कार्यप्रवाह शामिल है, प्रतिरक्षा synapse में एफ actin के ठहराव के लिए रक्त का नमूना प्राप्त करने से ।

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Protocol

1. पान-ल्यूकोसाइट्स की तैयारी

  1. एक heparinized सिरिंज में एक स्वस्थ दाता (या रोगी) से परिधीय रक्त की 1 मिलीलीटर ड्रा । रक्तदान के लिए जिम्मेदार आचार समिति द्वारा स्वीकृति लेना सुनिश्चित करें ।
  2. lysis बफर के 30 मिलीलीटर (१५० मिमी एनएच4सीएल, 1 मिमी KHCO3, और ०.१ मिमी EDTA, पीएच ७.०) में एक ५० मिलीलीटर ट्यूब और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए मशीन के साथ मानव परिधीय रक्त की 1 मिलीलीटर मिश्रण ।
  3. पंजाबियों के साथ ट्यूबों भरें और 6 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक महाप्राण supernatant और ले lysis बफर के 30 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  4. दोहराएँ चरण १.२ और १.३ जब तक supernatant स्पष्ट है । अंत में, पंजाब में कोशिकाओं को धोने, कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, और संस्कृति मध्यम (RPMI1640 + 10% FCS) के 2 मिलीलीटर में सेल गोली स्थगित । ६० मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।

2. एसईबी के साथ ्ज् कोशिकाओं की लोडिंग

  1. तैयार २ १५ एमएल बाज़ ट्यूबों के साथ १.५ x 10 ट्यूब प्रति6 ्ज् कोशिकाओं । कोशिकाओं के नीचे स्पिन (३०० कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए एक्स जी ) और supernatant त्यागें ।
  2. अवशिष्ट मध्यम (के बारे में 50-100 µ एल) में कोशिकाओं resuspend, जोड़ें १.९ µ एल (१.९ µ जी) एसईबी, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, नीचे (३०० एक्स जी कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए) कोशिकाओं स्पिन, और संस्कृति मध्यम में गोली resuspend (RPMI १६४० + 10% FCS) के घनत्व पर 1 x 106 कोशिकाओं/

3. प्रतिरक्षा Synapses और दाग प्रोटोकॉल की प्रेरण

  1. पिपेट ५०० एक FACS ट्यूब में एसईबी लोड ्ज् कोशिकाओं की तैयारी के µ एल और एक और µ ट्यूब में उतारा ्ज् कोशिकाओं की तैयारी के ५०० FACS एल. प्रत्येक ट्यूब के लिए पैन-ल्यूकोसाइट्स के ६५० µ एल जोड़ें और कोशिकाओं को नीचे स्पिन (३०० एक्स जी कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए) । supernatant त्यागें और १५० µ में गोली resuspend संस्कृति माध्यम के एल (RPMI1640 + 10% FCS) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (आमतौर पर ४५ मिनट के लिए) ।
  2. धीरे भंवर कोशिकाओं (10 १,००० rpm पर एस) और paraformaldehyde के १.५ मिलीलीटर (१.५%) जोड़ने के लिए कोशिकाओं को ठीक भंवर के दौरान । पंजाब के 1 मिलीलीटर + 1% BSA को जोड़कर निर्धारण बंद करो । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए (३०० x g कोशिकाओं गोली और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीनिंग के बाद 1% BSA पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspension ।
  3. गोली (कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी ) और पंजाब के १०० µ एल में कोशिकाओं + 1% BSA + ०.१% saponin के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize (९६-well प्लेट, यू के आकार) resuspend ।
  4. पंजाब में कोशिकाओं को धो + 1% BSA + ०.१% saponin के साथ (३०० कमरे के तापमान पर 10min के लिए एक्स जी ) और सेल गोली resuspend में ५० µ के एल. सी. + १% BSA + ०.१% saponin युक्त fluorophore-बला एंटीबॉडी या यौगिकों (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), और DAPI (1:3000)) ।
  5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को साफ करने के लिए कोशिकाओं को धो 3 बार पंजाबियों की 1 मिलीलीटर + 1% BSA + ०.१% saponin जोड़कर । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर केंद्रापसारक । इमेजिंग फ्लो cytometry के लिए पंजाब के ६० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।

4. एक प्रवाह Cytometer का उपयोग कर छवि अधिग्रहण

नोट: निम्न छवि प्राप्ति प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण imagestream (IS100), प्रेरणा, और विचारों जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग प्रवाह cytometry पर आधारित होते हैं. हालांकि, अन्य फ्लोर cytometers और एनालिसिस सॉफ्टवेयर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. इमेजिंग प्रवाह cytometer से जुड़े कंप्यूटर पर विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और साधन मेनू के प्रारंभ Fluidics पर क्लिक करें । सही बंदरगाह पर मोतियों को लागू करें जब ऐसा करने के लिए प्रेरित किया ।
  2. फ़ाइल मेनू से डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट लोड और रन/सेटअप पर क्लिक करें । दृश्य ड्रॉपडाउन मेनू से मोतियों का चयन करें ।
  3. इंगित मान २०० से नीचे है, तो सेट तीव्रता पर क्लिक करके ब्राइट-फील्ड प्रकाशक समायोजित करें ।
  4. सभी प्रारंभ पर क्लिक करके सहायता टैब में अंशांकन और परीक्षण रूटिन चलाएँ ।
  5. फ्लश/लॉक/लोड पर क्लिक करें और ऐसा करने के लिए संकेत दिए जाने पर बाएँ पोर्ट में नमूने लागू होते हैं । प्रवाह cytometer में कक्षों को लोड करने के बाद, कक्ष वर्गीकारक खोलें और मानों को निम्नानुसार समायोजित करें: प्रत्येक चैनल के लिए चोटी की तीव्रता ऊपरी सीमा १,०२२ पर, चरम तीव्रता निचली सीमा चैनल 2 के लिए ५० पर (DAPI) और चैनल 5 (CD3-Pe-TxR), क्षेत्र निचली सीमा के लिए ५० पर चैनल 1 (साइड स्कैटर), और १,५०० पर ऊपरी सीमा ।
  6. उत्तेजना लेजर पावर को ४०५ एनएम (15 मेगावाट), ४८८ एनएम (२०० मेगावाट), और ६४७ एनएम (९० मेगावाट) को सेटअप टैब में बदलें ।
  7. कक्ष वर्गीकारक और लेज़र पावर समायोजन का मूल्यांकन करने के लिए कक्षों और मोतियों के बीच दृश्य ड्रॉपडाउन मेनू पर स्विच करें.
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी कक्षों और सेल जोड़ों सेल दृश्य पाया जाता है और उस कोशिका के झुरमुट, मलबे, और संतृप्त पिक्सल के साथ छवियों को मलबे दृश्य में सेल classifiers और/या उत्तेजना लेजर शक्तियों को बदल कर पाया जाता है ।
  8. नमूना नाम और प्राप्त करने के लिए छवियों की मात्रा निर्धारित करें (15000 – 25000 नमूनों के लिए और ५०० क्षतिपूर्ति नियंत्रण के लिए) सेटअप टैब में, स्थापना प्रारंभ करने के लिए चलाएँ/

5. डेटा विश्लेषण

  1. raw छवि फ़ाइलें (. मोरोक्कन) डेटा विश्लेषण कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें ।
  2. मुआवजा ड्रॉपडाउन के निर्देशों के बाद एक मुआवजा मैट्रिक्स का उत्पादन । मुआवजा मैट्रिक्स comp_Date. सीटीएम के रूप में सहेजें ।
  3. एक नमूना raw छवि फ़ाइल (. मोरोक्कन) खोलें और क्षतिपूर्ति छवि फ़ाइलें (. सीआईएफ) और डिफ़ॉल्ट डेटा विश्लेषण फ़ाइल (. डीएएफ) बनाने के लिए प्रकट होता है जो विंडो में comp_Date. सीटीएम लागू होते हैं ।
  4. क्षतिपूर्ति की गई छवि फ़ाइल खोलें । छवियों को रंग मोड में कनवर्ट करें और छवि गैलरी गुण उपकरण पट्टी में इष्टतम दृश्यमान रंग प्राप्त करने के लिए लुकअप तालिकाओं को समायोजित करें । छवि गैलरी गुण उपकरण पट्टी के मिश्रित टैब का उपयोग करके एक RGB-मर्ज की गई छवि प्राप्त करें ।
  5. विश्लेषण ड्रॉपडाउन से मास्क प्रबंधक खोलें । इस प्रकार के रूप में टी कोशिकाओं और प्रतिरक्षा synapse, परिभाषित करने के लिए मास्क बनाएं:
    1. T-कक्ष मास्क का चयन करें: "(भरण (Threshold_Ch05, ६०)." घाटी मास्क का चयन करें: "घाटी (Ch02, 3)." t-cell synapse मास्क का चयन करें: "t-सेल मास्क और घाटी (M02, Ch02, 3)."
  6. विश्लेषण ड्रॉपडाउन से सुविधा प्रबंधक खोलें । निम्न सुविधाओं की गणना:
    1. T कक्षों में कुल CD3 व्यंजक के लिए, "Intensity_T-cells_Ch5." का चयन करें T कक्षों में F-actin की कुल मात्रा के लिए, "Intensity_T-cells_Ch6." का चयन करें प्रतिरक्षा synapse में CD3 व्यंजक के लिए, "Intensity_T-cell synapse_Ch5." का चयन करें प्रतिरक्षा synapse में F-actin की मात्रा के लिए, "Intensity_T-cell synapse_Ch6." का चयन करें
    2. T-cell क्षेत्र परिकलित करने के लिए, "Area_T-कक्षों" का चयन करें । T-cell प्रतिरक्षा synapse क्षेत्र की गणना करने के लिए, "Area_T-कक्ष synapse." का चयन करें
  7. F-actin और CD3 संवर्धन प्रतिरक्षा synapse में सुविधा प्रबंधक में समीकरण का उपयोग करके निर्धारित करें:
    Equation
  8. विश्लेषण क्षेत्र से हिस्टोग्राम और डॉट भूखंडों का उपयोग करके निंन गेटिंग कार्यनीति लागू करें (अधिक विवरण के लिए, संदर्भ 17 और 19 देखें):
    1. हिस्टोग्राम में "ग्रेडिएंट RMS_M2_Ch2" प्लॉट करके आउट-ऑफ़-फ़ोकस कक्षों को छोड़ें; 15 पर थ्रेशोल्ड सेट करें ।
    2. एक डॉट प्लाट में एसएससी बनाम CD3 तीव्रता का प्लाट । CD3 पर एक गेट सेट-सकारात्मक घटनाओं ।
    3. M02 (DAPI दाग) के क्षेत्र बनाम M02 (DAPI दाग) के "पहलू अनुपात" प्लाट । टी सेल पर गेट singlets और सेल कपल तदनुसार । सच सेल जोड़ों के लिए सही synapse मुखौटा के क्षेत्र का उपयोग कर, जैसा कि पहले17,19वर्णित है ।
    4. टी सेल में एफ-actin की मात्रा निर्धारित singlets और टी कोशिका के टी कोशिकाओं/APC जोड़ों और प्रतिरक्षा synapse में f-actin का प्रतिशत ।

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Representative Results

यहाँ वर्णित विधि का एक प्रमुख लक्ष्य है प्रोटीन संवर्धन की ठहराव (जैसे, एफ-actin) के बीच प्रतिरक्षा synapse में सरोगेट APCs (्ज् कोशिकाओं) और शुद्ध पैन में टी कोशिकाओं-कम मात्रा (1 मिलीलीटर) से लिया ल्यूकोसाइट्स मानव रक्त के नमूने. चित्रा 1 में स्क्रीनशॉट इस पद्धति की महत्वपूर्ण गेटिंग रणनीति का एक सिंहावलोकन देता है । यह बाईं ओर छवि गैलरी दिखाता है और सही (चित्रा 1) पर विश्लेषण क्षेत्र । छवि गैलरी "फोकस में" गेट से पता चलता है । चित्रित छवियों को मुख्य रूप से granulocytes और दो टी सेल/ एफ actin और CD3 सेल युगल संख्या ३०२७२ में समृद्ध कर रहे हैं । गेटिंग रणनीति इस तरह के संवर्धन के साथ सेल जोड़ों की मात्रा को बढ़ाता है विश्लेषण क्षेत्र में दिखाया गया है और प्रोटोकॉल में वर्णित है (५.८ कदम देखें) या कहीं और17,19। विश्लेषण क्षेत्र में अंतिम डॉट प्लॉट CD3 (x-अक्ष) और प्रतिरक्षा synapse में F-actin (y-अक्ष) की मात्रा (प्रतिशत प्रोटीन) प्रदर्शित करता है । यदि प्रोटीन के 30% से अधिक प्रतिरक्षा synapse मुखौटा के भीतर स्थित था, यह प्रतिरक्षा synapse20में प्रोटीन संवर्धन के रूप में माना जाता था । संवर्धन डेटा युक्त डॉट भूखंडों के लिए एक विशिष्ट अंतिम परिणाम (चित्रा 2a) का उत्पादन किया गया । बाईं ओर कल्पना टी के नमूने छवियों-सेल/apc conjugates, CD3 की कम मात्रा और प्रतिरक्षा synapse में एफ-actin के साथ दिखाता है, जबकि सही पर, टी सेल/apc conjugates CD3 और एफ actin के एक मजबूत संवर्धन के साथ चित्रित कर रहे हैं । प्रतिरक्षा synapse (प्रतिशत प्रोटीन) पर CD3 की मात्रा x-अक्ष पर रची जाती है, और प्रतिरक्षा synapse पर F-actin की मात्रा वाई-अक्ष पर रची जाती है । फाटक में प्रतिशत टी कोशिकाओं की राशि है कि एक superantigen की उपस्थिति में प्रतिरक्षा synapse पर CD3 और एफ-actin के एक संवर्धन है का प्रतिनिधित्व करता है । superantigen के अभाव में, टी कोशिकाओं के 15% प्रतिशत दोनों CD3 और एफ actin की प्रतिरक्षा synapse में एक संवर्धन दिखाया । कोशिकाओं की मात्रा superantigen की उपस्थिति में 29% की वृद्धि हुई । CD3 संवर्धन की एक एकल ठहराव (चित्रा 2 बी) या एफ actin संवर्धन (चित्रा 2c) उपस्थिति और superantigen की अनुपस्थिति में दिखाया गया है । इन परिणामों से पता चलता है कि, superantigen के अभाव में, १८.३ ± ३.५% और, superantigen की उपस्थिति में, कुल F-actin राशि के ३४.३ ± ४.०% कोशिकाओं में प्रतिरक्षा synapse पर जमा थे । दिलचस्प है, वहां पहले से ही था superantigen के अभाव में CD3 संचय (कुल CD3 राशि का १६.६ ± २.१%) है, जो काफी superantigen के अलावा द्वारा वृद्धि हुई थी (कुल CD3 राशि का २४.६ ± ३.०%) । इस विधि टी कोशिकाओं और APCs के बीच प्रतिरक्षा synapse पर कितना प्रोटीन जमा है की ठहराव की अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्र 1: पान-ल्युकोसैट की तैयारियों में प्रतिरक्षा synapses की पहचान के लिए गेटिंग रणनीति । आंकड़ा सॉफ्टवेयर के एक स्क्रीनशॉट दिखाता है और CD3 और एफ के मूल्यांकन के लिए एक पूर्ण विश्लेषण कार्यप्रवाह शामिल टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा synapse में actin संवर्धन APCs की उपस्थिति में एसईबी करने के लिए संयुग्मित । छवियां बाईं ओर छवि गैलरी में प्रदर्शित की जाती है (Ch2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; और विलय = संयुक्त Ch2, Ch5, और Ch6 युक्त छवि) । सॉफ़्टवेयर लुकअप तालिकाओं, मास्क प्रदर्शन और रंग/ग्रेस्केल मोड के लिए समायोजित करने के लिए एक छवि प्रदर्शन उपकरण पट्टी प्रदान करता है । स्क्रीनशॉट का दायां भाग विश्लेषण क्षेत्र और विश्लेषण उपकरण पट्टी दिखाता है । विश्लेषण क्षेत्र में हिस्टोग्राम और डॉट प्लॉट निम्नानुसार हैं: 1) हिस्टोग्राम DAPI धुंधला के ग्रेडिएंट RMS सुविधा के अनुसार फ़ोकस में कक्षों को ढूँढने के लिए. 2) CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-अक्ष) और साइड स्कैटर प्रोफ़ाइल (Intensity_MC_Ch01, y-अक्ष) की अभिव्यक्ति के अनुसार टी कोशिकाओं पर गेटिंग । 3) DAPI दाग (पहलू ratio_M02, y-अक्ष) और साइड स्कैटर प्रोफ़ाइल (Intensity_MC_Ch01, x-अक्ष) के पहलू अनुपात के अनुसार संभावित टी सेल/APC जोड़ों पर गेटिंग । 4) गेटिंग पर सच टी सेल/APC जोड़ों के अनुसार क्षेत्र synapse मुखौटा (x-अक्ष) और CD3 दाग (y-अक्ष) के क्षेत्र । 5) CD3 (x-अक्ष) और प्रतिरक्षा synapse में एफ actin (y-अक्ष) के (अंतरफलक में > 30% प्रोटीन सामग्री) संवर्धन द्वारा परिभाषित परिपक्व प्रतिरक्षा synapses पर गेटिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: CD3 और F-actin संवर्धन पर इमेजिंग प्रवाह cytometry डेटा प्रतिरक्षा synapse में । (क) केंद्र में डॉट भूखंडों को प्रतिरक्षा synapse में CD3 (एक्स-एक्सिस) और एफ-actin (वाई-एक्सिस) का प्रतिशत दिखाते हैं. T-cell/APC conjugates के साथ एक परिपक्व प्रतिरक्षा synapse में अनुपस्थिति (ऊपरी भाग) या उपस्थिति (एसईबी के निचले भाग) को दर्शाया गया है । CD3 और एफ-actin संवर्धन की एक कम डिग्री के साथ छोड़ दिया शो टी सेल/apc जोड़ों पर छवियों, जबकि सही प्रदर्शन टी पर छवियों-सेल/CD3 और एफ के एक उच्च डिग्री के साथ-actin संवर्धन (परिपक्व प्रतिरक्षा synapse) । स्केल बार = 10 µm (कम बाएं) । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है. (बी-सी) meaning CD3 (B) or F-actin (C) प्रतिरक्षा synapse में एसईबी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में संवर्धन प्रतिशत प्रोटीन के रूप में दिखाया गया है (n = 3; SE). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह मानव टी कोशिकाओं (पूर्व vivo) और APCs के बीच प्रतिरक्षा synapses के ठहराव को सक्षम करता है । विशेष रूप से, एरिथ्रोसाइट-लीजड ड पैन-ल्यूकोसाइट्स टी सेल सूत्रों के रूप में इस्तेमाल किया गया, टी सेल शुद्धि कदम औषधालय बना । बी सेल लिंफोमा सेल लाइन ्ज् किराए APCs के रूप में सेवा की । यह महत्वपूर्ण लाभ भालू, क्योंकि यह प्रतिरक्षा synapse के टी सेल पक्ष के रक्त दाताओं के बीच तुलना की अनुमति देता है । इसके अलावा, ऑटोलॉगस dc शायद ही परिधीय मानव रक्त से सीधे उपलब्ध हैं । monocyte-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (moDCs) के उत्पादन में कई दिन लगते हैं, नैदानिक अध्ययन चुनौतीपूर्ण करने के लिए आवेदन कर. हालांकि, इमेजिंग प्रवाह cytometry और विश्लेषण रणनीति यहां प्रस्तुत अंय APCs (जैसे, transdifferentiated न्यूट्रोफिल)20के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, यह प्रदर्शन किया गया था कि CD4 टी कोशिकाओं और पूर्व vivo dc9 या B कोशिकाओं21 के बीच प्रतिरक्षा synapse इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर चूहों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रकार, इस विधि के लिए टी सेल की ओर प्रतिरक्षा synapse के अलावा APC समारोह का आकलन व्यापक किया जा सकता है ।

इस पद्धति का सबसे महत्वपूर्ण कदम पान-ल्यूकोसाइट्स और APCs एक छोटी मात्रा में मिश्रण कर रहे है और सही गेटिंग रणनीति प्रदर्शन झूठी सकारात्मक घटनाओं को बाहर करने के लिए, जबकि एक ही समय में सच प्रतिरक्षा synapses के नुकसान को कम करने । हम CD3 और एफ-actin संचय के माप का वर्णन करते हैं, इस विधि इन प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित नहीं है और एलएफए के रूप में अन्य सतह रिसेप्टर्स, करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है-117,19. इसके अलावा, fluorophore लेबल एंटीबॉडी के अलावा टी सेल उपसमूह की पहचान (जैसे, CD4, सीडी 8, CD45RA, या chemokine रिसेप्टर्स) टी एक निश्चित प्रतिरक्षा synapse phenotype प्रदर्शित कोशिकाओं की प्रकृति की खोज के लिए अनुमति होगी । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तरह के एक विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि रक्त की मात्रा (अधिकतम: 1 मिलीलीटर) कम है । जबकि इमेजिंग प्रवाह cytometers की पहली पीढ़ी के रूप में यहां इस्तेमाल किया (IS100), के बारे में १०० कोशिकाओं की एक छवि अधिग्रहण दर है/एस, इमेजिंग प्रवाह cytometers (IsXMKII) की तीसरी पीढ़ी की अनुमति देता है बहुत उच्च छवि अधिग्रहण दर (२,००० कोशिकाओं को/ एक 40x उद्देश्य का उपयोग करना) । इस प्रकार, वास्तविक कार्यप्रवाह, डेटा विश्लेषण करने के लिए रक्त ड्राइंग से, एक काफी कम समय अवधि की आवश्यकता है (यानी, एक दिन). विशेष रूप से, जबकि प्रस्तुत छवि विश्लेषण इमेजिंग प्रवाह cytometry पर आधारित है, सेल तैयारी और प्रतिरक्षा synapses की प्रेरण (यानी, कार्यप्रवाह के पहले भाग) अन्य इमेजिंग तकनीकों के लिए लागू किया जा सकता है22.

cytometry प्रवाह के विपरीत, इमेजिंग प्रवाह cytometry-प्राप्त डॉट भूखंड प्रोटीन अभिव्यक्ति डेटा के अलावा प्रोटीन स्थानीयकरण के बारे में जानकारी शामिल हैं । इमेजिंग प्रवाह cytometry की एक ताकत है कि कोशिकाओं (या किसी भी चयनित गेट के सेल जोड़ों) आँख से मूल्यांकन किया जा सकता है; फाटक सीमाओं तदनुसार समायोजित किया जा सकता है, बस डॉट्स पर क्लिक करके और इसी छवि का निरीक्षण । हमारे प्रयोगों में, हमने पाया है कि 30% प्रोटीन संवर्धन एक विश्वसनीय मूल्य के हित समृद्ध के प्रोटीन होने के रूप में संबंधित सेल दंपति पर विचार है । एक बार फाटकों अंततः सेट कर रहे हैं, सुविधाओं और गेटिंग रणनीति एक अलग फ़ाइल (. ast) में बच रहे है और प्रत्येक निंनलिखित नमूने के लिए लागू किया जा सकता है एक निष्पक्ष मूल्यांकन आश्वासन देता हूं ।

इमेजिंग प्रवाह cytometry की कमजोरियों संकल्प में सीमा (०.५ µm एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर) और तथ्य यह है कि केवल एक फोकस विमान विश्लेषण किया जा सकता है । इसलिए, इस विधि प्रतिरक्षा synapse की ठीक संरचना का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं है और14microclusters की घटना । प्रतिरक्षा synapse के इस तरह के वास्तुकला से संबंधित पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए, जैसे फोकल, TIRF, या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के रूप में वैकल्पिक तकनीक, की जरूरत है । इमेजिंग प्रवाह cytometry की ताकत छवियों की राशि है कि प्रति नमूना प्राप्त किया जा सकता है (२५,००० अप करने के लिए) । विशेष रूप से, प्रत्येक छवि विभाजित है, जिसका अर्थ है कि पृष्ठभूमि बाहर खटखटाया है, और वहां आम तौर पर केवल एक एकांत कोशिका या छवि प्रति सेल जोड़ी है । इमेजिंग प्रवाह के इन विशेषताओं cytometry एकल सेल स्तर पर स्वचालित विश्लेषण के लिए आधार बनाते हैं । इसके अलावा, कोशिकाओं है कि प्रति नमूना विश्लेषण कर रहे है की उच्च राशि दुर्लभ घटनाओं की विश्वसनीय पहचान के लिए अनुमति (यानी, उपजनसंख्या या सेल जोड़ों 1% से नीचे एक आवृत्ति के साथ) । महत्वपूर्ण बात, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह प्रतिरक्षा संबंधी रोगों से पीड़ित रोगियों (जैसे, प्राथमिक इम्यूनो विकारों) से पूर्व vivo T-कोशिकाओं में पैन-ल्यूकोसाइट्स में प्रतिरक्षा synapse गठन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

काम जर्मन अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (DFG) अनुदान के साथ नहीं । SFB-९३८-M और SA 393/3-4 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ प्रतिरक्षा synapse प्रवाह cytometer Iimaging प्रवाह cytometry टी कोशिकाओं actin cytoskeleton मानव अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली
इमेजिंग प्रवाह Cytometry का उपयोग कर मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा Synapse के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण
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Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

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