Summary
여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.
Abstract
면역 시 냅 스는 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) 간의 통신의 영역입니다. T 세포 표면 수용 체와 안정적인 바인딩을 확신 하 고 교류 신호를 면역 냅으로 단백질 분극. 클래식 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경 면역 시 냅 스 연구에 사용 되었습니다. 때문에 이러한 방법을 사용 하려면 수동 이미지 수집 및 시간이 걸리는 정량화, 드문 이벤트의 영상 도전 이다. 여기, 우리 세포의 수천 수만의 형태소 분석을 가능 하 게 워크플로 설명 합니다. 면역 시 냅 스는 Apc로 팬 백혈구 준비에 기본 인간 T 세포와 황색 포도상구균 enterotoxin B 셉 로드 들의 삶 문의 세포 사이 유도. 이미지 수집 이미징 cytometry 라고도 흐름에 현미경 검사 법, 교류 cytometer 및 형광 현미경의 기능을 결합 하 여 수행 됩니다. T 세포/APC 커플 식별 하 고 분석 하는 면역 시 냅 스에 대 한 완전 한 제어 전략은 제공 됩니다. 면역 분석 unpurified 팬-백혈구 준비에 synapses 하며 따라서 작은 양의 혈액이이 허용 (즉,, 1 mL), 환자에서 샘플에 적용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 샘플 준비, 측정, 고 병렬로 분석.
Introduction
T 세포는 적응 면역 시스템의 주요 규제 하 고 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC)의 맥락에서 제시 하는 항 원 펩 티 드를 통해 활성화 됩니다. 전체 T 세포 활성화 필요 2 개의 신호, 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCR)를 통해 능력 신호 / CD3 복합물 및 액세서리 수용 체를 통해 costimulatory 신호. 두 신호는 항 원 제시와 T 세포의 직접적인 상호 작용을 통해 생성 된 세포 (Apc). 성숙한 APCs MHC 펩 티 드 복합물을 통해 T 세포 활성화에 대 한 적성 신호를 제공 하 고 그들은 costimulatory ligands 표현 (예:, CD80 또는 CD86) T 세포 활성화1의 진행을 보장 하기 위해서. Costimulation의 1 개의 중요 한 기능 말라 골격2,,34의 재배치입니다. 대뇌 피 질의 F 걸 T 세포 휴식에서 상대적으로 정적입니다. 항 원-베어링 APCs 통해 T 세포 자극 말라 골격의 심오한 재배치에 지도 한다. 말라 역학 (즉,, 빠른 걸 합/depolymerization 원) T 세포를 만드는 단백질 이나 세포, 예를 들어 전송 하는 데 사용 되는 힘을 사용 합니다. 또한, 말라 골격은 T 세포 및 면역 시 냅 스 라고 하는 APCs 사이 특별 한 연락처 영역을 개발 하기 위한 중요 합니다. 면역 시 냅 스를 말라 골격의 중요성 때문에 그것은 T 세포5,6,,78 의 말라 골격에 변화를 측정 하는 방법을 개발 하기 위해 필수적인 되고있다 , 9.
말라 cytoskeletal 원조에 의하여 표면 수용 체와 신호 전달 단백질 supramolecular 활성화 클러스터 (SMACs) 면역 시 냅 스 내에서 차별 됩니다. 면역 시 냅 스의 안정성은 말라 골격의 신축성을 증가 하는 F-말라 번들에 수용 체의 바인딩을 의해 보장 됩니다. 면역 시 냅 스 형성은 적응형 면역 반응의 생성에 대 한 중요 한 것을 보였다. Vivo에서 결함이 있는 면역 시 냅 스 대형의 해로운 효과 했다 깨 달 았에서 Wiskott 올드 리치 증후군 (WAS), 어떤 걸 중 합에는 질병을 고통 받아 환자에서 면역 시 냅 스 형성을 방해 하는 수반, 그리고10 . 환자는 습 진, 심한 재발 성 감염, 자가 면역 질환, 그리고 정면을에서 고통을 수 있습니다 했다. 이 발견에도 불구 하 고 그것은 현재 알 수 없습니다 면역 결함 또는 자가 면역 질환으로 고통 받는 환자와 건강 한 개인의 T 세포에서 면역 시 냅 스 형성 다릅니다 여부.
형광 현미경 검사 법, confocal 포함, TIRF, 및 최고 해결책 현미경 검사 법, 면역 시 냅 스11,12,,1314의 아키텍처를 밝히기 위해 사용 되었다. 이러한 시스템의 높은 해상도 라이브 셀 이미징 수행 가능성 말라 골격과 면역 시 냅 스에 표면 또는 세포내 단백질에 대 한 정확한, spatio 시간적 정보 수집 수 있습니다. 그러나 많은 결과, 몇 수십 T 세포의 분석에 근거한 다. 또한, 이러한 유형의 형광 현미경 검사 법에 대 한 T 세포를 정화 해야 합니다. 그러나, 많은 연구 질문에 대 한 unpurified 셀 보다는 가능한 가장 높은 해상도의 사용은 매우 중요. 이것은 환자에서 T 세포는 분석 때문에 헌 혈 된 혈액의 양을 제한 하 고 동시에 많은 샘플을 처리할 필요가 있을 수 있습니다 하는 경우 이다.
우리 인간의 시스템15,,1617면역 시 냅 스에 걸 골격의 분석을 허용 하는 현미경 방법을 설립 했다. 이러한 메서드는 흐름에 현미경18라고도 cytometry 이미징 기반으로 합니다. Multispectral 흐름 cytometry 및 형광 현미경 사이의 하이브리드, cytometry 이미징 장점이 그것의 형태학 매개 변수 및 다른 유형의 세포 인구에서 팬 백혈구 등에서 단백질 지역화 분석에 주변 혈액입니다. 우리는 우리가 시간과 비용이 많이 드는 정화 단계17의 필요 없이 전체 혈액 샘플에서 인간 T 세포의 T-셀/APC 어원이 같은 말에 F-말라를 계량 수 있습니다 하는 방법 소개. 여기에 제시 된 기술은 면역 시 냅 스에 F 걸의 정량화를 혈액 샘플에서 전체 워크플로 구성 되어 있습니다.
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Protocol
1입니다. 팬 백혈구의 준비
- Heparinized 주사기에 건강 한 기증자 (또는 환자)에서 말 초 혈액의 1 mL를 그립니다. 헌 혈에 대 한 책임 윤리 위원회에 의해 승인 되었는지 확인 합니다.
- 믹스 1 mL의 인간 주변 혈액을 30 mL 50 mL 튜브에 ACK 세포의 용 해 버퍼 (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3, 그리고 0.1 m m EDTA, pH 7.0)와 고 실 온에서 8 분 동안 품 어.
- PBS와 6 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 튜브와 ACK 세포의 용 해 버퍼의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 1.2와 1.3 단계를 반복 하는 상쾌한 분명 하다. 마지막으로, PBS, 실 온에서 6 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에에서 셀을 세척 하 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS) 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 60 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
2. 로드 들의 삶 문의 세 브와 셀
- 1.5 x 10 2 개의 15 mL 송 골 매 관 관 당6 들의 삶 문의 셀을 준비 합니다. 셀 (300 x g 6 분 실 온에서) 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한.
- 잔여 중간에 셀 resuspend (약 50-100 µ L), 1.9 µ µ (1.9 G) L 추가 셉, 그리고 15 분 추가 5 mL의 문화 매체에 대 한 실 온에서 품 어, 셀 (300 x g 실 온에서 6 분), 아래로 회전 및 문화 매체 (RPMI에에서 펠 릿 resuspend 1640 + 10 %FCS) 1 x 106 셀/mL의 조밀도에.
3. 면역 시 냅 스 및 프로토콜을 얼룩이 지기의 유도
- FACS 튜브로 셉 로드 들의 삶 문의 셀의 준비 및 다른 FACS 튜브로 역된 들의 삶 문의 셀의 준비의 500 µ L의 500 µ L 플라스틱 각 튜브와 셀 (실 온에서 10 분 동안 300 x g) 아래로 회전 팬 백혈구의 650 µ L를 추가 합니다. 삭제는 상쾌한 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS)의 150 µ L에 펠 릿을 resuspend. 37 ° C (일반적으로 45 분)에서 품 어.
- 부드럽게 소용돌이 셀 (10 s 1000 rpm에서) 셀을 해결 하기 위해 소용돌이 동안 paraformaldehyde (1.5%)의 1.5 mL를 추가. 1 mL의 PBS + 1 %BSA 추가 하 여 고정을 중지 합니다. 작은 셀 (300 x g 실내 온도 물의 resuspension PBS + 10 분 동안 실내 온도에 잠복기 후 1 %BSA 1 mL에 셀 펠 릿에서 10 분.
- 펠 렛 (300 x g 실 온에서 10 분 동안) 및 세포를 permeabilize PBS + 1 %BSA + 실 온에서 15 분 동안 0.1% 사포닌 100 µ L 셀 resuspend (96-잘 플레이트, U 모양).
- PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 원심 (300 x g 실 온에서 10 분)와 셀을 세척 하 고 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 fluorophore 분류 항 체 또는 화합물 (CD3-PE-TxRed (1:30), 포함 된 50 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend Phalloidin-AF647 (1:150), 그리고 DAPI (1:3, 000)).
- 품 어 30 분 세척에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 셀 셀 3 회 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌의 1 mL을 추가 하 여. 실 온에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심. Re-resuspend 이미징 cytometry에 대 한 PBS의 60 µ L에 셀.
4. 이미지 수집 교류 Cytometer를 사용 하 여
참고: 다음 이미지 수집 절차 및 데이터 분석 이미징 cytometry imagestream (IS100), 영감, 그리고 아이디어와 같은 소프트웨어를 사용 하 여 기반으로 합니다. 그러나, 다른 흐름 cytometers 및 분석 소프트웨어 또한 사용할 수 있습니다.
- 영상 교류 cytometer에 연결 된 컴퓨터에 분석 소프트웨어 열고 초기화 응용 악기 메뉴의를 클릭 합니다. 구슬 그렇게 할 것인지 묻는 메시지가 나타나면 올바른 포트에 적용 됩니다.
- 파일 메뉴에서 기본 서식 파일을 로드 하 고 실행/설치를 클릭 하십시오. 구슬 보기 드롭다운 메뉴에서 선택 합니다.
- 지정 된 값이 200 강도 설정를 클릭 하 여 필드 밝은 조명 기를 조정 합니다.
- 보정을 실행 하 고 모든 시작을 클릭 하 여 지원 탭에서 루틴을 테스트.
- 플러시/잠금/부하에 클릭 하 고 그렇게 하 라는 메시지가 나타나면 왼쪽된 포트에 샘플을 적용. 교류 cytometer 세포를 로드 한 후 셀 분류자 열고 값을 다음과 같이 조정: 각 채널, 피크 강도 낮은 제한 50 채널 2 (DAPI) 및 채널 5 (CD3-Pe-TxR), 50에서 지역 더 낮은 제한에 대 한 1,022에서 피크 강도 상한값 채널 1 (사이드 분산형), 및 1, 500에 상한.
- 405는 레이저 전원을 변경 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), 그리고 647 nm (90 mW) 설정 탭에서.
- 보기 드롭다운 메뉴 셀 분류자 및 레이저 전원 조정 평가 셀 구슬 사이 전환 합니다.
참고: 모든 셀 및 셀 커플 셀 보기 발견 되 고 그 세포 덩어리, 파편, 및 포화 픽셀 이미지에서에서 있다 파편 보기 셀 분류자 및 여기 레이저 능력을 변경 하 여 다는 것을 확인 하십시오. - 설치 탭 클릭 실행/설치 취득 하려면 샘플 이름 및 이미지 (15000-25000 샘플에 대 한)와 보상 컨트롤에 대 한 500를 정의 합니다.
5. 데이터 분석
- 데이터 분석 컴퓨터에 raw 이미지 파일 (.rif)를 전송 및 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 보상 드롭다운의 지침에 따라 보상 매트릭스를 생성 합니다. Comp_Date.ctm로 보상 매트릭스를 저장 합니다.
- 샘플 raw 이미지 파일 (.rif)를 열고 보상된 이미지 파일 (.cif) 및 기본 데이터 분석 파일 (.daf)을 생산 하 고 나타나는 창에서 comp_Date.ctm를 적용 합니다.
- 보상된 이미지 파일을 엽니다. 이미지 색상 모드로 변환 하 고 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 표시 색상을 얻기 위해 조회 테이블을 조정 합니다. 복합 이미지 갤러리 속성 도구 모음 탭을 사용 하 여 RGB 병합 이미지를 가져옵니다.
-
분석에서 마스크 관리자를 엽니다. T 세포와 면역 시 냅 스를 다음과 같이 정의 하는 마스크를 만듭니다.
- T-셀 마스크를 선택: "(작성 (Threshold_Ch05, 60)." 계곡 마스크를 선택: "Valley(Ch02,3)" T-세포 시 냅 스 마스크를 선택: "T-셀 마스크와 밸리 (M02, Ch02, 3)."
-
분석에서 기능 관리자를 엽니다. 다음과 같은 기능을 계산:
- T 세포의 총 CD3 식 선택 "Intensity_T-cells_Ch5." T 세포에서 F-말라의 총 금액에 대 한 선택 "Intensity_T-cells_Ch6." CD3 식 면역 시 냅 스에, "Intensity_T-셀 synapse_Ch5." 선택 F-말라 면역 시 냅 스에, 양을 선택 "Intensity_T-셀 synapse_Ch6."
- T-셀 영역을 계산 하려면 선택 "Area_T-셀." T 세포 면역 시 냅 스 영역을 계산 하려면 "Area_T-셀 시 냅" 선택
- 기능 관리자에서 방정식을 사용 하 여 F-말라와 면역 시 냅 스에서 CD3 농축을 확인 합니다.
-
히스토그램을 사용 하 여 다음과 같은 제어 전략을 적용 하 고 점 (대 한 더 자세한 내용은, 참조 참조 17 및 19) 분석 영역에서 플롯:
- 히스토그램; "그라데이션 RMS_M2_Ch2"을 그려서 초점 아웃 셀 삭제 15에서 임계값을 설정 합니다.
- 점 작의에서 CD3 강도 대 SSC를 플롯 합니다. CD3 양성 이벤트에 대 한 게이트를 설정 합니다.
- M02의 "화면 비율" 플롯 (DAPI 얼룩) M02 영역 대 (Dapi 얼룩). T-셀 singlets 및 셀 게이트 따라 커플. 사실 셀 커플17,19위에서 설명한 대로 냅 마스크 영역을 사용 하 여 수정 합니다.
- F-말라 singlets T-세포와 T 세포 T-셀/APC 커플의 금액과 면역 시 냅 스에 F 걸의 %를 확인 합니다.
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Representative Results
여기서 설명 하는 방법의 주요 목표는 단백질 농축의 정량화 (예:, F-말라) 사이 면역 시 냅 스에서 대리 Apc (셀 들의 삶 문의)와 낮은 볼륨 (1 mL) 인간의 혈액 샘플에서 가져온 unpurified 팬 백혈구에 T 세포. 그림 1 의 스크린샷은이 방법의 중요 한 제어 전략에 대 한 개요를 제공합니다. 그것은 왼쪽 및 오른쪽 (그림 1)의 분석 영역에 이미지 갤러리를 보여줍니다. 이미지 갤러리 "에 초점" 게이트를 보여줍니다. 묘사 된 이미지는 주로 granulocytes 그리고 두 T-셀/APC 커플. F-말라와 CD3 셀 몇 수 30272 농축 됩니다. 셀 커플 같은 농축의 양을 계량 제어 전략 분석 영역에 표시 됩니다 및 프로토콜에서 설명 하는 (단계 5.8 참조) 또는 다른17,19. 분석 영역에서 마지막 점 플롯 표시 (퍼센트 단백질) CD3 (x 축) 및 면역 시 냅 스에서 F-말라 (y 축). 단백질의 30% 이상이 면역 시 냅 스 마스크 내에 있는 경우에, 그것은 면역 시 냅 스20에 단백질 농축으로 고려 되었다. 도트 플롯 포함 농축 데이터는 전형적인 최종 결과 (그림 2A) 생성 하는 데 사용 했다. 왼쪽에 이미지 오른쪽에, T-셀/APC 어원이 같은 말 CD3과 F 걸의 강한 농축으로 묘사 하는 반면 T-셀/APC 어원이 같은 말, 낮은 양의 CD3과 F 걸 면역 시 냅 스에서의 샘플 이미지를 보여 줍니다. 면역 시 냅 스 (% 단백질)에서 CD3 금액 x 축에 표시 하 고 F-말라 면역 시 냅 스에서 양의 y 축에 그려집니다. 게이트에 백분율은 superantigen 존재 면역 시 냅 스에서 CD3과 F 걸의 농축 된 T 셀을 나타냅니다. Superantigen의 부재, T 세포의 15 %CD3 F-말라의 면역 시 냅 스에는 농축을 보여주었다. Superantigen 존재 29%로 증가 하는 세포의 양입니다. CD3 농축 (그림 2B) 또는 F 걸 농축 (그림 2C)의 단일 정량화는 존재와 부재의 superantigen에 표시 됩니다. 이 결과, 부재 superantigen에의 존재, 그리고 superantigen, 18.3 ± 3.5%, 34.3 ± 4.0% 셀에서 F 걸 총계의 면역 시 냅 스에서 축적 했다 보여준다. 흥미롭게도, 이미 크게 superantigen (CD3 총계의 24.6 ± 3.0%)의 추가 의해 증가 되었다 superantigen (16.6 ± 2.1 %CD3 총계의)의 부재에서 CD3 축적이 했다. 이 메서드는 얼마나 많은 단백질은 T 세포 및 APCs 사이 면역 시 냅 스에서 축적 된의 정량화를 수 있습니다.
그림 1: 팬 백혈구 준비에 면역 시 냅 스의 확인에 대 한 전략을 게이팅. 그림은 소프트웨어의 스크린샷을 보여 줍니다 고 셉 존재 APCs에 활용 된 T 세포의 면역 시 냅 스에서 CD3과 F 걸 농축의 평가 대 한 완벽 한 분석 워크플로 포함 합니다. 이미지 왼쪽에 이미지 갤러리에 표시 됩니다 (Ch2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; 병합 = Ch2, Ch5와 Ch6 포함 하는 결합 된 이미지). 소프트웨어는 룩 업 테이블, 마스크 디스플레이, 컬러/회색조 모드 조정 하는 이미지 표시 도구 모음을 제공 합니다. 화면 오른쪽에 분석 영역과 분석 도구 모음 표시 됩니다. 분석 영역 포함 히스토그램 고 점 다음과 같습니다: 1) 히스토그램 DAPI 얼룩의 그라데이션 RMS 기능에 따라 초점에서 셀을 찾을 수. 2) 게이팅 CD3의 표현에 따라 T 세포에 (Intensity_MC_Ch05, x 축)과 측면 분산형 프로 파일 (Intensity_MC_Ch01, y 축). 3) Gating DAPI 얼룩 (가로 세로 ratio_M02, y 축)와 측면 분산형 프로 파일 (Intensity_MC_Ch01, x 축)의 가로 세로 비율에 따라 잠재적인 T-셀/APC 커플에. 4) 게이팅 진정한 T-셀/APC 커플 지역 냅 마스크 (x 축)와 CD3 얼룩 (y 축)의 지역에. 5) 게이팅 농축에 의해 정의 된 성숙 면역 시 냅 스에 (> 30% 단백질 콘텐츠 인터페이스에서) CD3의 (x 축) 및 면역 시 냅 스에서 F-말라 (y 축). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 면역 시 냅 스에서 CD3과 F 걸 농축에 교류 cytometry 데이터 이미징. 센터에서 (A)는 점 플롯 CD3의 비율을 표시 (x 축) 및 면역 시 냅 스에서 F-말라 (y 축). T-셀/APC 부재 (상단 부분)에서 성숙 면역 시 냅 스와 변화 또는 셉의 존재 (아래 부분)이 표시 됩니다. 왼쪽 이미지 오른쪽에 이미지 표시 CD3과 F 걸 농축 (성숙 면역 시 냅 스)의 높은 학위를 가진 T-셀/APC 몇 반면 T-셀/APC CD3과 F 걸 농축의 낮은 정도 가진 커플. 눈금 막대 = 10 µ m (왼쪽 아래). 결과 3 개의 독립적인 실험의 대표 이다입니다. (B-C) CD3 (B) 또는 셉의 유무에서 면역 시 냅 스에 F-말라 (C) 농축 % 단백질으로 표시 됩니다 의미 (n = 3; SE)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 워크플로 (ex vivo) 인간 T 세포와 APCs 사이 면역 시 냅 스의 정량화를 수 있습니다. 특히, 팬-백혈구 적혈구 lysed 불가결 T 세포 정화 단계를 만드는 T-셀 원본으로 사용 되었다. B-세포 림프 종 세포 라인 들의 삶 문의 대리 APCs 역임 했습니다. 면역 시 냅 스의 T-세포의 혈액 기증자 사이 비교 수 있기 때문이 맺는 중요 한 이점이 다. 또한, 헌 Dc 거의 주변 인간의 혈액에서 직접 사용할 수 있습니다. Monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDCs)의 생산 도전 임상 연구에 응용 프로그램을 만드는 몇 일 걸립니다. 그러나, 다른 Apc (예:, transdifferentiated neutrophils)20이미징 cytometry와 여기에 제시 된 분석 전략을 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 CD4 T 세포 사이 ex vivo Dc9 또는 B 세포21 면역 시 냅 스 이미징 cytometry 사용 하 여 마우스에 대 한 평가 될 수 있다 시연 했다. 따라서,이 메서드 면역 시 냅 스의 T-셀 측면 뿐만 아니라 APC 기능을 평가 하기 위해 확대 될 수 있습니다.
이 방법론의 가장 중요 한 단계는 작은 볼륨에서 팬 백혈구 및 APCs를 혼합, 진정한 면역 시 냅 스의 손실을 최소화 하는 동시에 긍정 이벤트를 제외 하려면 올바른 제어 전략을 수행. CD3과 F 걸 축적의 측정, 설명 하는 동안이이 단백질을 제한 하지 않습니다 메서드와 LFA-117,19같은 다른 표면 수용 체에 확장 될 수 있다. 또한, T-셀 하위 그룹 (예:, CD4, CD8, CD45RA, 또는 chemokine 수용 체)를 식별 하기 위해 항 체 fluorophore 분류의 추가 특정 면역 냅 표현 형을 표시 하는 T 세포의 자연의 탐험에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 같은 분석에 필요한 혈액의 양을 낮습니다 (최대: 1 mL). 영상 교류 cytometers의 1 세대 (IS100), 여기에 사용 되는 동안 약 100 세포/s의 이미지 수집 속도 흐름 cytometers (IsXMKII) 이미징의 제 3 세대 수 (최고 2, 000 셀/s 훨씬 높은 이미지 수집 속도 사용 하 여 40 x 목표). 따라서, 데이터 분석, 혈액을 그리기에서 실제 워크플로 필요 상당히 짧은 기간 (예:, 1 일). 특히, 제시 이미지 분석 이미징 cytometry를 바탕으로, 하는 동안 셀 준비 및 면역 시 냅 스 (즉, 워크플로의 첫 번째 부분)의 유도 다른 이미징 기법22에 적용할 수 있습니다.
Cytometry, 달리 이미징 흐름 cytometry 얻은 점 플롯 단백질 식 데이터와 함께 단백질 지 방화에 대 한 정보가 있습니다. Cytometry 이미징의 한 강도 셀 (또는 셀 커플) 어떤 선택한 게이트의 눈;으로 평가할 수 있다 게이트 경계 점 들을 클릭 하 고 해당 이미지를 검사 하면이 따라 조정할 수 있습니다. 우리의 실험에서 우리는 30% 단백질 농축 농축 하는 관심사의 단백질을 가진 것으로 각 셀 쌍을 고려해 야 할 신뢰할 수 있는 값은 다는 것을 발견. 문 마지막으로 설정 하 고, 일단 기능 및 제어 전략 별도 파일 (.ast)에 저장 되 고 공평한 평가 보장 하기 위해 각 다음 예제에 적용할 수 있습니다.
Cytometry 이미징의 약점은 해상도 (40 x 목표를 사용 하 여 0.5 µ m)와 사실에 한계는 하나의 초점 비행기를 분석할 수 있습니다. 따라서,이 메서드는 면역 시 냅 스의 미세 구조 및 microclusters14의 발생 분석에 적합 하지. 면역 시 냅 스의 이러한 아키텍처 관련 측면을 분석, 대체 기술와 같은 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경이 필요. 이미징 cytometry의 강도 (최대 25000) 샘플 당 취득 될 수 있는 이미지의 금액입니다. 특히, 각 이미지는 세그먼트, 배경, 절 의미 그리고 일반적으로 하나의 독방 셀 또는 셀 몇 이미지 당. 이미징 cytometry의 이러한 특성을 단일 세포 수준에서 자동된 분석을 위한 기초 형성. 또한, 샘플 당 분석 되는 셀의 높은 금액 드문 이벤트 (즉, 모집단 또는 1% 아래 주파수 셀 커플)의 신뢰할 수 있는 식별 수 있습니다. 양측 검정 면역 관련 된 질병으로 고통 받아 환자에서 ex vivo 팬 백혈구에 T-세포에 면역 시 냅 스 대형의 연구에 여기에 제시 된 워크플로 적용 하는 중요 한 것은, (예:, 1 차 면역 결핍 장애).
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
작품 번호 보조금 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 투자 되었다 SFB-938-M 고 SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
