Summary
Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde för kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapser mellan primära humant T-celler och antigen-presenterande celler. Metoden är baserad på imaging flödescytometri, som tillåter förvärv och utvärdering av flera tusen cell bilder inom en relativt kort tidsperiod.
Abstract
Immun synapsen är området för kommunikation mellan T-celler och antigen-presenterande celler (APC). T-celler polarisera yta receptorer och proteiner mot immun synapsen till försäkrar en stabil bindning och signalera exchange. Klassiskt confocal, Frida eller super-resolution mikroskopi har använts för att studera immun synapsen. Eftersom dessa metoder kräver manuell bild förvärv och tidskrävande kvantifiering, är bildtagning av sällsynta händelser utmanande. Här beskriver vi ett arbetsflöde som möjliggör morfologiska analyser av tiotusentals celler. Immun synapser induceras mellan primära humant T-celler i pan-leukocyt preparat och Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-loaded Raji celler som trupptransportfordon. Bild Förvärvandet utförs med imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi, som kombinerar funktionerna i en flödescytometer och fluorescens Mikroskop. En komplett Usenets strategi för att identifiera T cell/APC par och analysera immun synapserna tillhandahålls. Som det här arbetsflödet tillåter analys av immun synapser i orenat pan-leukocyt preparat och därmed kräver endast en liten mängd blod (dvs., 1 mL), det kan tillämpas på prover från patienter. Allt kan flera prover vara beredd, mäts och analyseras parallellt.
Introduction
T-celler är större regulatorer av det adaptiva immunsystemet och aktiveras genom antigena peptider som presenteras i samband med större histocompatibility komplex (MHC). Fullständig aktivering av T-celler kräver två signaler, kompetens signalen via den antigen-specifika T-cells receptorn (TCR) / CD3 komplex och costimulatory signalen via tillbehör receptorer. Båda signaler genereras genom direkt samverkan mellan T-celler med antigen-presenterande celler (APC). Mogen trupptransportfordon tillhandahåller kompetens signal för T-cells aktivering via MHC-peptid komplex, och de costimulatory ligander (t.ex., CD80 eller CD86) att säkerställa utvecklingen av T-cells aktivering1. En viktig funktion för costimulation är omordningen av aktin cytoskelettet2,3,4. Den kortikala F-aktin är relativt statisk i vila T-celler. T-cell stimulering genom antigen-bärande trupptransportfordon leder till en djupgående ombildning av aktin cytoskelettet. Aktin dynamics (dvs., snabb aktin polymerisation/depolymerization cirklar) aktivera T-cellerna att skapa krafter som används för transport av proteiner eller organeller, t.ex. Aktin cytoskelettet är dessutom viktig för att utveckla en särskild kontakt zon mellan T-celler och trupptransportfordon, kallas immun synapsen. På grund av vikten av aktin cytoskelettet till immun synapsen, har det blivit nödvändigt att utveckla metoder för att kvantifiera förändringar i aktin cytoskelettet av T celler5,6,7,8 , 9.
Med hjälp av aktin cytoskeletal stöd, är yta receptorer och signalering proteiner åtskilda i supramolekylär aktiveringen kluster (SMACs) inom immun synapsen. Stabiliteten i immun synapsen säkerställs genom bindning av receptorer till F-aktin buntar som ökar elasticiteten i aktin cytoskelettet. Immun synaps bildandet har visat sig vara avgörande för generering av adaptiva immunsvaret. De skadliga effekterna av ett defekt immunförsvar synaps bildas i vivo realiserades först hos patienter som lider från Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sjukdom som aktin polymerisation och, samtidigt, immun synaps bildas störs10 . VAR patienter kan drabbas av eksem, återkommande infektioner, autoimmuna sjukdomar och melanom. Trots detta fynd, är det för närvarande inte känt huruvida immuna synaps bildas skiljer sig i de T-cellerna av friska individer och patienter lider av immundefekter eller autoimmuna sjukdomar.
Fluorescensmikroskopi, inklusive confocal, Frida och super-resolution mikroskopi, användes för att avslöja arkitekturen av immun synaps11,12,13,14. Den höga upplösningen av dessa system och möjlighet att utföra live-cell imaging möjliggör insamling av exakt plats och tid information om aktin cytoskelettet och ytan eller intracellulära proteiner i immun synapsen. Många resultat, dock är baserade på analys av bara några tiotals T-celler. Dessutom måste T-celler renas för dessa typer av fluorescensmikroskopi. Men för många forskningsfrågor är användning av orenat celler i stället för högsta möjliga upplösning av yttersta vikt. Detta är relevant om T-celler från patienter analyseras, sedan av donerat blod är begränsad och det kan vara behovet av att bearbeta många prover parallellt.
Vi etablerade mikroskopiska metoder som möjliggör analys av aktin cytoskelettet i immun synapsen i mänskliga systemet15,16,17. Dessa metoder bygger på imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellan Multispektrala flöde flödescytometri och fluorescence mikroskopi, imaging flödescytometri har sina styrkor i analysera morfologiska parametrar och protein lokalisering i heterogena cellpopulationer, såsom pan-leukocyter från den perifert blod. Vi införde en metod som gör det möjligt för oss att kvantifiera F-aktin i T-cell/APC konjugat av humant T-celler från helblod prover, utan behov av tidskrävande och kostsamma rening steg17. Tekniken presenteras här omfattar hela arbetsflödet, från att få blodprovet att kvantifiering av F-aktin i immun synapsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Pan-leukocyter
- Dra 1 mL av perifert blod från en frisk givare (eller patienten) i hepariniserad spruta. Se till att ha godkännande av ansvariga etikkommittén för blodgivningen.
- Blanda 1 mL humant perifert blod med 30 mL ACK lyseringsbuffert (150 mM NH4Cl och 1 mM KHCO30,1 mM EDTA, pH 7,0) i en 50 mL tub och inkubera i 8 min i rumstemperatur.
- Fyll rören med PBS och centrifugera vid 300 x g för 6 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 30 mL ACK lyseringsbuffert.
- Upprepa steg 1.2 och 1.3 tills supernatanten är klart. Slutligen, tvätta cellerna i PBS, Centrifugera vid 300 x g under 6 minuter i rumstemperatur, och resuspendera cellpelleten i 2 mL odlingsmedium (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubera cellerna vid 37 ° C i 60 min.
2. lastning av Raji celler med SEB
- Förbered två 15 mL Falcon rör med 1,5 x 106 Raji celler per rör. Snurra ner cellerna (300 x g under 6 minuter vid rumstemperatur) och Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i resterande medium (ca 50-100 µL), tillsätt 1.9 µL (1,9 µG) SEB, och inkubera i rumstemperatur i 15 min. Lägg 5 mL odlingsmedium, snurra ner cellerna (300 x g under 6 minuter vid rumstemperatur) och återsuspendera pelleten i odlingsmedium (RPMI 1640 + 10% FCS) med en täthet på 1 x 106 celler/mL.
3. induktion av immun synapser och färgning protokoll
- Pipettera 500 µL av beredning av SEB-loaded Raji celler till en FACS rör och 500 µL för utarbetandet av lossas Raji celler i en annan FACS röret. Tillsätt 650 µL av pan-leukocyter i varje rör och spinn ner cellerna (300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur). Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 150 µL av odlingsmedium (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubera vid 37 ° C (typiskt för 45 min).
- Försiktigt vortex cellerna (10 s vid 1000 rpm) och tillsätt 1,5 mL PARAFORMALDEHYD (1,5%) under vortex fixar cellerna. Stoppa fixeringen genom tillsats av 1 mL PBS + 1% BSA. Pellet cellerna (300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur och resuspension cellpelleten i 1 mL PBS + 1% BSA efter inkubation vid rumstemperatur i 10 min.
- Pellet (300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur) och resuspendera cellerna i 100 µL av PBS + 1% BSA + 0,1% saponin för 15 min i rumstemperatur för att permeabilize celler (96 brunnar tavla, U-formad).
- Tvätta cellerna i PBS + 1% BSA + 0,1% saponin med centrifugering (300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur) och återsuspendera cellpelleten i 50 µL av PBS + 1% BSA + 0,1% saponin innehållande fluorophore-märkt antikroppar eller föreningar (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) och DAPI (1:3, 000)).
- Inkubera cellerna vid rumstemperatur i mörkret för 30 min. Tvätta cellerna 3 gånger genom att tillsätta 1 mL PBS + 1% BSA + 0,1% saponin. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Re-resuspendera cellerna i 60 µL av PBS för imaging flödescytometri.
4. bild förvärv med en flödescytometer
Obs: Följande bild förvärv förfarande och data analys baseras på imaging flödescytometri med hjälp av programvara såsom imagestream (IS100), INSPIRE och idéer. Dock kan andra flöde cytometers och analys programvara också användas.
- Öppna programvaran analys på datorn ansluten till den imaging flödescytometer och klicka på initiera flödesteknik i menyn Instrument. Tillämpa pärlorna på rätt port när du uppmanas att göra så.
- Ladda standardmallen från Arkiv-menyn och klicka på Kör/Setup. Välj pärlor från menyn Visa.
- Justera ljus-fältet Upplysaren genom att klicka på Ange intensitet om det visade värdet understiger 200.
- Kör kalibreringen och testa rutin i Assist fliken genom att klicka på starta alla.
- Klicka på Flush/lås/belastning och tillämpa proverna i vänstra porten när du uppmanas att göra så. Efter lastning cellerna i flödescytometer, öppna Cell klassificeraren och justera värdena enligt följande: peak intensitet övre gränsen på 1 022 för varje kanal, maximal intensitet nedre gränsen på 50 för kanal 2 (DAPI) och kanal 5 (CD3-Pe-TxR), området nedre gränsen på 50 för kanal 1 (side scatter) och övre gräns på 1.500.
- Ändra magnetiseringen laser kraften till 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), och 647 nm (90 mW) i den inställningsfliken.
- Växla Visa dropdown-menyn mellan celler och pärlor för att utvärdera de cell klassificerare och laser power justeringarna.
Obs: Kontrollera att alla celler och cell par finns vyn Cell och att cell klumpar, skräp och bilder med mättade pixlar finns i vyn skräp genom att ändra cellen klassificerare och/eller excitation laser befogenheter. - Definiera namnet urval och mängden bilder att förvärva (15 000 – 25 000 för prover) och 500 för ersättning kontroller i fliken Inställningar Klicka på Kör/installationsprogrammet att starta förvärvet.
5. dataanalys
- Överföra raw-bildfilerna (.rif) till data analys datorn och öppna programvaran analys.
- Producera en kompensationsmatris följa anvisningarna i listmenyn ersättning. Spara kompensationsmatrisen som comp_Date.ctm.
- Öppna en exempelfil raw-bild (.rif) och tillämpa comp_Date.ctm i fönstret som visas att producera kompenserad bildfiler (.cif) och filen standard data analys (.daf).
- Öppna bildfilen kompenserad. Konvertera bilder till färgläge och justera uppslagstabeller för att erhålla optimal synliga färger i verktygsfältet bild galleri egenskaper. Skaffa en RGB-samman bild med sammansatta fliken i verktygsfältet bild galleri egenskaper.
-
Öppna hanteraren för Mask från listan för analys. Skapa masker för att definiera de T-cellerna och immun synapsen, enligt följande:
- Välj T-cell masken: ”(Fill (Threshold_Ch05, 60)”. Välj dalen masken: ”Valley(Ch02,3)”. Välj T-cell synaps masken: ”T-cell mask AND Valley (M02, Ch02, 3)”.
-
Öppna hanteraren för funktionen från listan för analys. Beräkna följande funktioner:
- För det totala CD3 uttrycket i T-celler, Välj ”Intensity_T-cells_Ch5”. För den totala mängden F-aktin i T-cellerna, Välj ”Intensity_T-cells_Ch6”. För CD3 uttryck i immun synapsen, Välj ”Intensity_T-cell synapse_Ch5”. För den F-aktin i immun synapsen, Välj ”Intensity_T-cell synapse_Ch6”.
- För att beräkna området T-cellen, Välj ”Area_T-celler”. För att beräkna T-cell immun synaps området, Välj ”Area_T-cell synaps”.
- Fastställa F-aktin och CD3 anrikning i immun synapsen med hjälp av ekvation i funktionen Manager:
-
Tillämpa följande Usenets strategi med hjälp av histogram och dot tomter från analysområde (för ytterligare detaljer, se referenser 17 och 19):
- Kassera out-of-fokus celler genom att rita den ”Gradient RMS_M2_Ch2” i ett histogram; Ange tröskelvärdet på 15.
- Rita SSC kontra CD3 intensitet i en dot tomt. Ange en grind på CD3-positiva händelser.
- Rita ”Aspect ratio” av M02 (DAPI fläcken) kontra området av M02 (Dapi fläcken). Grind på T-cell undertröjor och cell par med detta. Korrigera för sann cell par med hjälp av området av synaps masken, som tidigare beskrivits17,19.
- Bestämma mängden F-aktin i T-cell linnen och T-celler av T-cell/APC par och procenten av F-aktin i immun synapsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett viktigt mål för den metod som beskrivs här är kvantifiering av protein anrikning (t.ex., F-aktin) i immun synapsen mellan surrogat trupptransportfordon (Raji celler) och T-celler i orenat pan-leukocyter tas från låg volym (1 mL) humant blodprover. Skärmdumpen i figur 1 ger en översikt över den kritiska Usenets strategin av denna metod. Det visar Bildgalleri till vänster och analysområde till höger (figur 1). Bildgalleriet visar stadsporten ”i fokus”. Avbildade bilderna är främst granulocyter och två T-cell/APC par. F-aktin och CD3 är berikad med par cellantal 30272. Usenets strategin att kvantifiera mängden cell par med sådan anrikning visas i området analys och beskrivs i protokollet (se steg 5,8) eller någon annanstans17,19. Senaste dot tomten i området analys visar mängden (procent protein) CD3 (x-axeln) och F-aktin (y-axeln) i immun synapsen. Om mer än 30% av proteinet var ligger inom immun synaps masken, var det ansett som protein anrikning i immun synaps20. Dot tomter innehållande anrikning data användes för att producera en typisk slutresultatet (figur 2A). Bilderna till vänster visar provet bilder av T-cell/APC konjugat, med låga mängder CD3 och F-aktin i immun synapsen, medan höger T-cell/APC konjugat skildras med en stark anrikning av CD3 och F-aktin. Mängden CD3 på immun synapsen (procent protein) ritas på x-axeln, och mängden F-aktin på immun synapsen ritas på y-axeln. Procentandelen i porten motsvarar mängden T-celler som har en anrikning av CD3 och F-aktin på immun synapsen i närvaro av ett superantigen. I avsaknad av superantigen visade 15% procent av T-cellerna en anrikning på immun synapsen både CD3 och F-aktin. Mängden celler ökade till 29% i närvaro av superantigen. En enda kvantifiering av CD3 anrikning (figur 2B) eller F-aktin anrikning (figur 2 c) visas i närvaro och frånvaro av superantigen. Dessa resultat visar att, i avsaknad av superantigen, 18,3 ± 3,5% och, i närvaro av superantigen, 34,3 ± 4,0% av den totala F-aktin i cellerna var samlat på immun synapsen. Intressant nog fanns det redan CD3 ackumulering i avsaknad av superantigen (16,6 ±-2,1% av de totala CD3), som ökades avsevärt genom tillsats av superantigen (24,6 ± 3,0% av det totala CD3). Denna metod tillåter kvantifiering av hur mycket protein är ackumulerad vid immun synapsen mellan T-celler och trupptransportfordon.
Figur 1: Gating strategi för identifiering av immun synapser i pan-leukocyt preparat. Figuren visar en skärmdump av programvaran och innehåller en komplett analys arbetsflöde för utvärdering av CD3 och F-aktin anrikning i immun synapsen av T-celler konjugerat till trupptransportfordon i närvaro av SEB. Bilderna visas i bildgalleriet till vänster (Ch2 = DAPI; CH5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; och sammanfoga = kombinerad bild som innehåller Ch2, Ch5 och Ch6). Programvaran innehåller en verktygsfältet bild display justera för uppslagstabeller och mask display färg/gråskala-läge. Den högra delen av skärmbilden visar analysområde och verktygsfältet analys. Analysområde innehåller histogram och dot tomter enligt följande: 1) histogrammet att hitta celler i fokus enligt funktionen lutning RMS av DAPI färgningen. (2) gating på T-celler enligt uttrycket av CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-axeln) och den side scatter profilen (Intensity_MC_Ch01, y-axeln). (3) Gating på potentiella T-cell/APC par enligt proportionerna av DAPI fläcken (aspekt ratio_M02, y-axeln) och den side scatter profilen (Intensity_MC_Ch01, x-axeln). (4) gating på sanna T-cell/APC par enligt område synaps masken (x-axeln) och området av CD3 fläcken (y-axeln). (5) gating på mogen immun synapser som definieras av anrikning (> 30% proteinhalt i gränssnittet) av CD3 (x-axeln) och F-aktin (y-axeln) i immun synapsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging flödescytometri flödesdata på CD3 och F-aktin anrikning i immun synapsen. (A), dot tomter i mitten Visa procentandelen av CD3 (x-axeln) och F-aktin (y-axeln) i immun synapsen. T-cell/APC konjugat med en mogen immun synaps i avsaknad (övre delen) eller närvaro (nedre delen) av SEB skildras. Bilderna på den vänster visar T-cell/APC par med en låg grad av anrikning av CD3 och F-aktin, medan bilderna till höger visar T-cell/APC par med en hög grad av CD3 och F-aktin anrikning (mogen immun synaps). Skalstapeln = 10 µm (nedre vänstra). Resultatet är representativt av tre oberoende experiment. (B-C) Menar CD3 (B) eller F-aktin (C) anrikning i immun synapsen i närvaro eller frånvaro av SEB visas som procent protein (n = 3; SE). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbetsflödet presenteras här möjliggör kvantifiering av immun synapser mellan mänskliga T-celler (ex vivo) och trupptransportfordon. Bland annat användes erytrocyt-lyserat pan-leukocyter som T-cell källor, att göra T-cell reningssteg dispensable. B-cells lymfom cellinje Raji tjänstgjorde som surrogat trupptransportfordon. Detta bär betydande fördelar, eftersom det tillåter jämförelser mellan blodgivare av T-cell sida av immun synapsen. Vidare, autolog DCs finns knappast direkt från perifert blod. Produktionen av monocyt-derived dendritiska celler (moDCs) tar flera dagar att göra ansökan till kliniska studier utmanande. Dock kan imaging flödescytometri och strategin för analys som presenteras här tillämpas på andra trupptransportfordon (t.ex., transdifferentiated neutrofiler)20. Dessutom var det visat att immun synapsen mellan CD4 T-celler och ex vivo DCs9 eller B celler21 kan bedömas för möss använder imaging flödescytometri. Således kan denna metod utvidgas till att bedöma APC funktion utöver den T-cell sidan av immun synapsen.
De viktigaste stegen i denna metod är blandning av pan-leukocyter och trupptransportfordon i en liten volym och utföra rätt Usenets strategi för att utesluta falskt positiva händelser samtidigt som de minimerar förlusten av true immun synapser. Medan vi beskriva mätning av CD3 och F-aktin ackumulering, denna metod är inte begränsad till dessa proteiner och kan utökas till andra yta receptorer som LFA-117,19. Tillägg av fluorophore-märkt antikroppar att identifiera T-cell undergrupper (t.ex., CD4, CD8, CD45RA eller chemokine receptorer) skulle dessutom möjliggöra utforskandet av arten av T-celler som visar en viss immun synaps fenotyp. Ännu viktigare, mängden blod som behövs för en sådan analys är låg (maximal: 1 mL). Medan den första generationen av imaging flöde cytometers, som används här (IS100), har tillåter en bild förvärv hastighet av ca 100 celler/s, den tredje generationen av imaging flöde cytometers (IsXMKII) mycket högre bild förvärv priser (upp till 2 000 celler/s med ett 40 x-objektiv). Således, faktiska arbetsflödet, från ritning blodet till dataanalys, kräver en betydligt kort tidsperiod (dvs., en dag). Särskilt, medan den presenterade bildanalys är baserad på imaging flödescytometri, kan cell förberedelse och induktion av immun synapser (dvs, den första delen av arbetsflödet) tillämpas på andra imaging tekniker22.
I motsats till flödescytometri innehåller imaging flöde flödescytometri-erhållande dot tomter information om protein lokalisering förutom protein uttryck data. En styrka av imaging flödescytometri är att celler (eller cell par) av alla valda gate kan utvärderas av ögat; gate gränserna kan justeras, helt enkelt genom att klicka på prickarna och inspektera den motsvarande bilden. I vårt experiment fann vi att 30% protein anrikning är ett tillförlitligt värde överväga respektive cell paret ha proteinet av intresse berikad. När grindarna ställs slutligen, den portande strategin och funktioner sparas i en separat fil (.ast) och kan tillämpas på varje följande prov att säkerställa en opartisk utvärdering.
Svagheterna i imaging flödescytometri är begränsningen i upplösning (0,5 µm med hjälp av ett 40 x-objektiv) och faktumen att endast en fokus planet kan analyseras. Därför, denna metod är inte lämplig att analysera i fina struktur av immun synapsen och förekomst av microclusters14. För att analysera sådana arkitektur-relaterade aspekter av immun synapsen, alternativa tekniker, såsom confocal, Frida, eller super-resolution mikroskopi, behövs. Styrkan i imaging flödescytometri är mängden bilder som kan förvärvas per prov (upp till 25,000). Framför allt, varje bild är segmenterad, vilket innebär att bakgrunden är utslagen, och det finns oftast bara en ensam cell eller cell par per bild. Dessa kännetecken för imaging flödescytometri grunden för automatiserad analys på enskild cell nivå. Dessutom kan den höga mängden celler som analyseras per prov för tillförlitlig identifiering av sällsynta händelser (dvs subpopulationer eller cell par med en frekvens lägre än 1%). Ännu viktigare, det arbetsflöde som presenteras här kan tillämpas på studiet av immun synaps bildas i ex vivo T-celler i pan-leukocyter från patienter som lider av immunrelaterade sjukdomar (t.ex., primär immunbrist sjukdom).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet finansierades av de Tyskt forskningrådet (DFG) med bidrag nr. SFB-938-M och SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
