厚脑切片使用高尔基考克斯方法中成像神经元
Summary
我们提出了一个协议，用于使用所述高尔基体考克斯染色法在厚的脑切片中，为了可视化与包含单个组织样品中的树突状长树木神经元。此协议的两种变型还提出涉及甲酚紫复染，和未加工的大脑进行长期存储的冻结。
Abstract
神经细胞染色的高尔基 – 考克斯方法已使用超过两百年的脑组织样本中推进我们的神经元形态的理解。虽然它是从实用的观点考虑，优选以制备在最大厚度可能脑切片中，为了提高识别被完全包含单个区段内染色的神经元的概率，该方法是从由高工作距离技术的角度有限-magnification显微镜物镜。我们在这里报告的协议使用在小鼠脑切片的高尔基体考克斯方法，其是在500米微米厚的切割染色的神经元，并使用配有高分辨率30X 1.05 NA硅氧烷直立显微镜遍及这些区段的深度可视化的神经元油浸物镜，其具有800μm的工作距离。我们还报告这个协议可用于复染的表面的两个有用的变体安装的脑切片用甲酚紫染色尼斯尔，或以切片和最后的处理之前，冻结长期储存整个大脑。的主要协议和它的两个变体产生染色的厚的脑切片，在整个这充分神经元的树突树和枝晶棘可以可靠地可视化和量化。
Introduction
单个神经元的组织样本中的可视化允许的神经元形态特征的原位分析，已显著提高了我们的大脑的理解，以及如何可以通过内源性疾病或外生环境因素的影响。高尔基-考克斯染色方法是在大脑中的神经元染色的随机样本的具有成本效益的，相对简单的装置。首先通过高尔基1在19世纪开发并由考克斯2改性，研究人员已经进一步改进这种技术多年来，以产生清晰，染色的神经元可被用于可视化和量化两者树突树形态和棘密度3,4 5，6，7，8，9。
对于染色的神经元的脑切片中的可视化的一个主要技术考虑是最大的切片厚度，这是由可用高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离的限制。在60共同油浸物镜 – 100X范围上提供优异的分辨率，但他们的工作距离是通常不超过200微米的更大的限制。在200微米范围内切脑切片可能是足够的可视化可以被包含在此切片厚度内的某些神经元类型，在大脑皮质10，11，12，在的CA1区锥体细胞的浅层示例锥体神经元海马13，14，和颗粒细胞在海马15的齿状脑回。相对较长的神经元树突树，如大脑皮层的深层内锥体神经元，对于鼠标可以从细胞体16延伸大于800μm，提供了更大的挑战，因为大脑将需要在一个完美的角度被分段以包含整个树突树在200倍微米的切片。这甚至可能不是可行的，如果枝晶或任何其分支在延髓或尾方向延伸。虽然可以通过跟踪在多个相邻的脑切片中的神经元，以解决此限制，这种方法引入了在准确对准部分用于跟踪17显著的技术挑战。一个更实际的方法是可视化包含被以更大的厚度切脑切片内整个神经元。
我们在这里报告的技术染色400元以内 – 使用高尔基 – 考克斯方法小鼠的500微米厚的脑切片，并以可视化的MOrphology使用具有800微米的工作距离的高分辨率硅油浸物镜。我们描述了高尔基体考克斯浸渍和处理协议从最引用的现代协议之一在文献6改性。我们的与厚的脑切片方法提供了增加的标识被完全包含在节中的任何类型的神经元的概率的优点。除了主协议中，我们还提供独特的优点本两个变化：（1）高尔基体考克斯染色具有安装部分的表面上的甲酚紫染液中，为了限定脑区的边界，并确定的层大脑皮层，和（2）高尔基体考克斯染色与之前切片和最后的处理浸渍整个大脑的长期存储的中间冷冻步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里介绍一个高尔基考克斯染色协议了两个有用的变种沿着厚的脑切片中神经元的可视化。正如代表结果所示，使用具有长800μm的工作距离的高分辨率目标的允许整个神经元在整个500μm的切割脑切片的深度可靠可视化。比较厚的脑切片的这项研究增加了任何类型的神经元染色完全包含切片，这是长而复杂的顶端树突树锥体神经元是特别重要内的概率。例如，在啮齿动物的脑中的冠状切片，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由一个发现格兰特CDCB从自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会，加拿大创新基金会（CFI项目编号30381），约翰·R·埃文斯领导基金研究基础设施补助金CDCB，并支持发现格兰特NJM从NSERC。 ELL是由安大略研究生奖学金和安大略兽医学院的奖学金OVC圭尔夫大学的支持。 CDS是由NSERC本科生助研支持。 ALM是由NSERC亚历山大·格雷厄姆·贝尔奖学金和安大略兽医学院在圭尔夫大学的奖学金OVC支持。
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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