Her beskriver vi opsætningen, software navigation, og dataanalyse for et rumligt og tidsligt nøjagtig metode til måling tonic og fasiske ekstracellulære glutamat ændringer in vivo ved anvendelse af enzymbundne mikroelektrodepositionerne arrays (MEA).
Neurotransmitter forstyrrelser er ofte en vigtig del af sygdomme i centralnervesystemet (CNS), spiller en rolle i patologien bag Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, depression og angst. Traditionelt har mikrodialyse været den mest almindelige (rost) teknik til at undersøge neurotransmitter forandringer, der sker i disse lidelser. Men fordi mikrodialyse har evnen til at måle langsomme 1-20 minut ændringer på tværs af store områder af væv, det har den ulempe er invasiv, potentielt ødelægge iboende forbindelser i hjernen og en langsom prøveudtagning kapacitet. En relativt nyere teknik, mikroelektroden array (MEA), har talrige fordele til måling bestemte neurotransmitter ændringer inden diskrete hjerneområder som de opstår, hvilket giver en rumligt og tidsmæssigt præcise fremgangsmåde. Under anvendelse af MEA er minimalt invasiv, hvilket tillader måling af neurotransmitter ændringer i vivo. I vores laboratorium, vi hahar været specielt interesseret i ændringer i neurotransmitter, glutamat, relateret til Alzheimers sygdom patologi. Som sådan har den her beskrevne fremgangsmåde blevet anvendt til at vurdere potentielle hippocampale forstyrrelser i glutamat i en transgen musemodel for Alzheimers sygdom. Kort fortalt, den anvendte fremgangsmåde involverer at coate en multi-site mikroelektrode med et enzym meget selektiv for neurotransmitteren af interesse og anvendelse selvhenvisende sider for at trække baggrundsstøj og forstyrrende. Efter udpladning og kalibrering kan MEA konstrueres med en mikropipette og sænkes ind i hjernen området af interesse under anvendelse af et stereotaktisk apparat. Her angivne metode involverer bedøve RTG (TauP301L) 4510-mus og under anvendelse af en stereotaktisk anordning til præcist at målrette subregioner (GD, CA1 og CA3) i hippocampus.
Måling neurotransmitter ændringer i hjernen er et vigtigt redskab for neuroscientists studerer sygdomme i centralnervesystemet (CNS), der er ofte kendetegnet ved neurotransmitter dysregulering. Selvom mikrodialyse i kombination med højtryksvæskekromatografi (HPLC / EF) har været den mest udbredte metode til at måle ændringer i ekstracellulære neurotransmitterniveauer 1, 2, 3, 4, den rumlige og tidsmæssige opløsning af mikrodialysesonder måske ikke ideel til neurotransmittere , såsom glutamat, der er tæt reguleret i det ekstracellulære rum 5, 6. På grund af de seneste fremskridt inden for genetik og billeddannelse, er der yderligere metoder, der kan anvendes til at kortlægge glutamat in vivo. Anvendelse genetisk indkodede glutamat fluorescerende reportere (iGluSnFR) end to-foton-billeddannelse, kan forskerne visualisere glutamatfrigørelse ved neuroner og astrocytter både in vitro og in vivo 7, 8, 9. Især dette giver mulighed for optagelse fra en større synsfelt og ikke forstyrrer de iboende forbindelser i hjernen. Mens disse nye optiske teknikker tillader visualisering af glutamat kinetik og måling af sensoriske fremkaldte svar og neuronal aktivitet, mangler de evnen til at kvantificere mængden af glutamat i det ekstracellulære rum i diskrete hjerneområder.
En alternativ fremgangsmåde er enzymbundet mikroelektrode array (MEA), der selektivt kan måle ekstracellulære neurotransmitterniveauer, såsom glutamat, ved anvendelse af en selv-refereret optagelse ordning. Den MEA teknik har været anvendt til at studere ændringer i ekstracellulær glutamat følgende traumatisk hjerneskadeskade 10, 11, 12, ældning 13, 14, stress 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sygdom 19, 20, og injektion af en viral mimic 21 og repræsenterer en forbedring i forhold de rumlige og tidsmæssige begrænsningerne ved mikrodialyse. Ud fra følgende betragtninger mikrodialyse begrænser evnen til at måle nær synapse 22, 23, MMA har en høj rumlig opløsning, der giver mulighed for selektive foranstaltninger af ekstracellulær glutamat afsmittende nær synapser 24, 25. Sekund, den lave tidsmæssige opløsning af mikrodialyse (1 – 20 min) begrænser muligheden for at undersøgehurtige dynamik glutamatfrigivelse og clearance forekommer i millisekund til andet interval 26. Fordi forskelle i frigivelsen eller clearance af glutamat kan ikke altid tydeligt i foranstaltninger af tonic, hvilende glutamatniveauer, kan det være væsentligt at glutamatfrigivelse og clearance måles direkte. MEA'er mulighed for sådanne foranstaltninger på grund af deres høje tidsmæssig opløsning (2 Hz) og lave påvisningsgrænser (<1 um). Tredje, MEA tillader undersøgelse af subregionale variationer i neurotransmittere i en bestemt hjerneregion, såsom en rotte eller mus hippocampus. For eksempel ved anvendelse MEA'er vi kan separat målrette den tandede gyrus (DG), cornu ammonis 3 (CA3) og cornu ammonis 1 (CA1) af hippocampus, som er forbundet via en trisynaptic kredsløb 27, at undersøge subregionale forskelle i ekstracellulær glutamat. På grund af størrelsen af mikrodialysesonder (1 – 4 mm længde) og skader forårsaget af implantation 28 </ sup>, 29, subregionale forskelle er vanskelige at løse. Endvidere er de optiske systemer kun tillade stimulering via eksterne stimuli, såsom en knurhår stimulation eller lys flimmer, som ikke tillader subregionale stimulation 7. En endelig fordel af multilaterale miljøaftaler i forhold til andre metoder er evnen til at studere disse subregioner in vivo uden at forstyrre deres ydre og indre forbindelser.
Her beskriver vi, hvordan et registreringssystem (fx FAST16mkIII) i kombination med MEA'er, der består af en keramisk-baseret multisite mikroelektrode, kan differentielt overtrækkes på optagemediet sider for at muliggøre interfererende midler, der skal detekteres og fjernes fra analytsignalet. Vi også demonstrere disse arrays kan anvendes til amperometri-baserede undersøgelser af in vivo glutamat forskrift i GD, CA3 og CA1 hippocampale delområder bedøvede RTG (TauP301L) 4510-mus, et udbredt mOuse model af Alzheimers sygdom. Derudover giver vi bekræftelse af følsomheden af MEA systemet til de hurtige dynamik glutamatfrigivelse og efter behandling af mus med riluzol, at et lægemiddel vist in vitro falde glutamatfrigivelse og øge glutamatoptagelse 30, 31, 32, 33, og demonstrere disse respektive ændringer i vivo i TauP301L musemodellen.
MEA teknik muliggør måling af hurtige kinetik for neurotransmitterfrigivelse og optagelse in vitro og in vivo. Derfor er teknologi frembringer en lang række data output herunder tonisk neurotransmitterniveauer, fremkaldt neurotransmitterfrigivelse, og neurotransmitter clearance. Men fordi brug af multilaterale miljøaftaler er en forholdsvis kompliceret procedure, der er mange faktorer, der kan have brug for at være optimeret til succesfuld brug. For eksempel under kalibrering, kan man konstatere, …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242.187), WVU Faculty Research Senatet Grant (MNR), og WVU PSCOR Grant (MNR).
FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
Picospritzer III | Parker | ||
Silver wire | AM systems | 782000 | |
Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
Drill | Dremel | Micro | |
Metricide | Metrex | 102800 | |
Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |