Summary

Использование ферментных биосенсоров на основе измерить Тоник и фазовый глутамат в мышиных моделях болезни Альцгеймера

Published: May 03, 2017
doi:

Summary

Здесь мы описываем установку программного обеспечения, навигацию и анализ данных для пространственно и во время точного способа измерения тонизирующих и фазовые внеклеточные изменений глутамата в естественных условиях , используя связанные с ферментом микроэлектрода массивов (MEA).

Abstract

Нейротрансмиттеров нарушения часто является ключевым компонентом заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), играет определенную роль в патологии, лежащей в основе болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, депрессии и тревоги. Традиционно, микродиализ был наиболее распространенным (хвалили) метод для изучения изменений нейротрансмиттеров, которые возникают в этих расстройствах. Но поскольку микродиализ имеет возможность измерять медленные изменения 1-20 минутных через большие участки ткани, имеет тот недостаток, инвазивность, потенциально разрушая внутренние соединения внутри мозга и возможностей медленной выборки. Относительно новый метод, массив микроэлектродов (МЭС), имеет многочисленные преимущества для измерения специфических изменений нейротрансмиттеров внутри дискретных областей головного мозга, как они происходят, что делает для пространственно и во время точного подхода. Кроме того, с помощью МЭС является минимально инвазивной, что позволяет для измерения нейротрансмиттерных изменений в естественных условиях. В нашей лаборатории, мы гаве был специально заинтересованы в изменении нейромедиатора, глутамат, связанный с патологией болезни Альцгеймера. Таким образом, способ, описанный здесь, был использован для оценки потенциальных нарушений гиппокампа в глутамате в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. Вкратце, метод, используемый включает в себя нанесение на несколько площадок микроэлектрода с ферментом очень селективным для нейротрансмиттер интереса и использования автореферентного сайтов для вычитания фонового шума и мешающих а. После того, как покрытие и калибровка, МЭУ может быть построена с помощью микропипетки и опускают в области мозга интереса с использованием стереотаксической устройства. При этом, способе, описанном включает обезболивающий RTG (TauP301L) 4510 мышей и с помощью стереотаксического устройства точно ориентировать подобласти (DG, СА1 и CA3) гиппокампа.

Introduction

Измерение нейромедиаторов изменений в головном мозге является важным инструментом для нейробиологов, изучающих заболевания центральной нервной системы (ЦНС), которые часто характеризуется нейромедиатор дизрегуляция. Хотя микродиализ в сочетании с жидкостной хроматографией высоким давлени (ВЭЖЙ / EC) был наиболее широко используемым методом для измерения изменений внеклеточного уровня нейротрансмиттеров 1, 2, 3, 4, пространственное и временное разрешение микродиализных зондов может не быть идеальным для нейротрансмиттеров , такие как глутамат, которые жестко регулируется во внеклеточном пространстве 5, 6. Из-за последних достижений в области генетики и визуализации, существуют дополнительные методы , которые могут быть использованы для сопоставления глутамата в естественных условиях. Используя генетически кодируемые флуоресцентные репортер глутамата (iGluSnFR)д двухфотонного визуализации, исследователи способны визуализировать высвобождение глутамата нейронов и астроцитов в пробирке и в естественных условиях 7, 8, 9. В частности, это позволяет для записи с большим полем зрения и не нарушать внутренние соединения мозга. Несмотря на то, что эти новые оптические методы позволяют для визуализации кинетики глутамата и измерения сенсорных вызванных реакций и активности нейронов, они не имеют возможности определить количество глутамата в межклеточном пространстве в отдельных областях мозга.

Альтернативный метод представляет собой связанный с ферментом микроэлектрода массива (MEA), который может селективно измерять уровни внеклеточной нейротрансмиттеров, таких как глутамат, за счет использования самостоятельной привязкой схемы записи. Методика MEA была использована для изучения изменений в внеклеточном глутамате следующих травматическим мозгатравмы 10, 11, 12, старение 13, 14, стресс 15, 16, эпилепсия 17, 18, болезнь Альцгеймера 19, 20, а также инъекций вирусной мимической 21 и представляет собой улучшение по сравнению пространственных и временных ограничений , присущих микродиализ. В то время как микродиализ ограничивает возможность измерения вблизи синапса 22, 23, МЭС имеет высокое пространственное разрешение , которая позволяет селективные меры внеклеточного глутамата перелива вблизи синапсам 24, 25. Во-вторых, низкое временное разрешение микродиализом (1 – 20 мин) ограничивает возможность исследоватьбыстрая динамика высвобождения глутамата и зазор , происходящая в миллисекундах до второго диапазона 26. Из-за различий в освобождении или клиренс глутамата не может быть очевидным в мерах тоника, покоящихся уровни глутамата, может иметь важное значение, что высвобождение глутамата и зазор быть непосредственно измерены. МЭС допускает такие меры в связи с их высоким временным разрешением (2 Гц) и низкими пределами обнаружения (<1 мкМ). В-третий, МЭС позволяет на рассмотрение субрегиональных вариаций в нейротрансмиттер в пределах конкретного региона мозга, такие как крысы или мыши гиппокамп. Например, с помощью МЭС мы можем отдельно целевой зубчатой извилине (DG), Cornu ammonis 3 (СА3) и CORNU ammonis 1 (CA1) гиппокампа, которые соединены с помощью trisynaptic схемы 27, чтобы изучить субрегиональные различия в внеклеточного глутамата. Из – за размера микродиализные зондов (1 – длина 4 мм) и ущерб , причиненный имплантации 28 </ SUP>, 29, субрегиональные различия трудно решить. Кроме того, оптические системы только позволяют стимуляции с помощью внешних стимулов, таких как стимуляция усов или легкого мерцания, который не допускает субрегиональной стимуляцию 7. Окончательное преимущество МЭС по сравнению с другими методами является возможность изучения этих подобластей в естественных условиях , не нарушая их внешних и внутренних связей.

Здесь мы опишем , как система записи (например, FAST16mkIII) в сочетании с МЭС, состоящая из керамического на основе мультисайтового микроэлектрода, может быть по- разному покрытие на участках записи , чтобы позволить вмешательство агентов , которые будет обнаружена и удалено из сигнала анализируемого вещества. Мы также демонстрируем эти массивы могут быть использованы для Амперометрии на основе исследований в естественных условиях регулирования глутамата в пределах DG, СА3 и СА1 гиппокампа подобластей наркоза RTG (TauP301L) 4510 мышей, обычно используемый мУзы модель болезни Альцгеймера. Кроме того, мы обеспечиваем подтверждение чувствительности системы MEA к быстрой динамики высвобождения глутамата и очистки путем обработки мышей с рилузолом, препарат показано в пробирке , чтобы уменьшить высвобождение глутамата и увеличить поглощение глютамата 30, 31, 32, 33, и демонстрация этих соответствующих изменений в естественных условиях в модели мыши TauP301L.

Protocol

1. Покрытие микроэлектрода массива с помощью ферментов или матричного слоя Подготовка матричного белка раствор Взвесить 10 мг бычьего сывороточного альбумина (BSA) и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 985 мкл деионизованной воды в микроцентрифуж…

Representative Results

Несмотря на то, что эта технология может быть использована для измерения изменений в глутаматэргических сигнализациях во многих видах животных моделей, такие как черепно-мозговой травма, старение, стресс и эпилепсии, здесь мы покажем, как технология MEA может быть испо…

Discussion

Методика позволяет МЭС для измерения быстрой кинетики высвобождения нейротрансмиттеров и поглощения в пробирке и в естественных условиях. Таким образом, технология производит широкий спектр выходных данных, включая уровни нейромедиаторов тонизирующих, вызывали высвобожд?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (НРД; U54GM104942), NIA (НРД; R15AG045812), Ассоциации Альцгеймера (МНР; NIRG-12-242187), WVU факультет Исследовательского Сенатской Гранта (НРД) и WVU PSCOR Гранта (МНР).

Materials

FAST-16mkIII-8 channel Quanteon 16mkIII
Microelectrode arrays CenMet W4 or 8-TRK
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A-3059 10 g (expires after 1 month)
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G-6257 100 mL (expires after 6 months)
Glutamate Oxidase US Biological or Sigma Aldrich G4001-01 or 100646 50 UI (expires after 6 months)
Hamilton Syringes Hamilton #701 2 syringes
Methanol BDH UN1230 4 L
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) ACROS Organics 1330560250 25 g
Reference Electrodes (RE-5B) BAS MF-2079 3 electrodes
Magnetic stir plate Cole-parmer EW-04804-01 Can purchase from different supplier
Glutamate Sigma-Aldrich G-1626 100 g
Ascorbic Acid TCI 50-81-7 500 g
Dopamine Hydrochloride Alfa Aesar 62-31-7 5 g
Perchloric acid VWR UN2920 500 mL
Postassium chloride VWR 7447-40-7 1 kg
Sodium chloride VWR 7647-40-7 1 kg
Calcium Chloride MP 153502 100 g
Sodium Hydroxide BDH 1310732 500 g
Glass pressure ejection pipettes CenMet
Sticky wax Kerrlab 625 Can purchase from different supplier
Microsyringe World Precision Instruments MF28G-5
Modeling clay WalMart Can purchase from different supplier
Picospritzer III Parker
Silver wire AM systems 782000
Hydrochloric acid BDH 7647010 2.5 L
Platinum wire AM Systems 778000
Solder gun Lowes or Home Depot Can purchase from different supplier
Multimeter WalMart Can purchase from different supplier
PhysioSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
SomnoSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
Stereotaxic device Stoelting Can purchase from different supplier
Digital Lab Standard Stoelting Can purchase from different supplier
Meiji EMZ microscope Meiji EMZ-5
Drill Dremel Micro
Metricide Metrex 102800
Scalpel VWR Can purchase from different supplier
Surgery scissors VWR Can purchase from different supplier
Sterile cotton swabs Puritan 25806 Can purchase from different supplier
Eye ointment Puralube Vet Ointment Obtain from the vet
Iodine swabs VWR S48050 Can purchase from different supplier
Alcohol swabs Local drug store Can purchase from different supplier
Sterile surgery drape Dynarex 4410 Can purchase from different supplier
Sterile saline Teknova S5815 Can make own soltuion using filters
Hydrogen Peroxide (3%) Local drug store Can purchase from different supplier
Heating Pad WalMart Can purchase from different supplier

References

  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

Play Video

Cite This Article
Hunsberger, H. C., Setti, S. E., Heslin, R. T., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer’s Mouse Models. J. Vis. Exp. (123), e55418, doi:10.3791/55418 (2017).

View Video