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Immunology and Infection

एक उच्च throughput संगत परख Macrophage passaged के खिलाफ ड्रग प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए doi: 10.3791/55453 Published: March 24, 2017

Introduction

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क्षय रोग (टीबी) पर 40 साल के लिए 1 विरोधी टीबी कीमोथेरेपी परहेजों की उपलब्धता के बावजूद एक गंभीर वैश्विक स्वास्थ्य के लिए खतरा बनी हुई है। यह कई दवा संयोजन का उपयोग कर 6 महीने की लंबी अवधि के लिए इलाज की आवश्यकता है, जो गैर-अनुपालन 2 रोगी की ओर जाता है के कारण भाग में है। हाल के वर्षों में दवा प्रतिरोधी टीबी के उद्भव के आगे एक क्षेत्र में समस्याओं बढ़ गया है, जहां चिकित्सकीय अनुमोदित दवाओं के सफल विकास के लगभग न के बराबर 3 है। दरअसल, संपूर्ण विरोधी टीबी दवा के विकास के बावजूद, केवल एक ही दवा की गई है एफडीए पिछले 40 वर्षों में 4 नैदानिक इस्तेमाल के लिए मंजूरी दे दी। इस प्रकार, विरोधी टीबी दवाओं की नई पीढ़ी तत्काल इस समस्या का समाधान करने की जरूरत है।

टीबी दवाओं की खोज में एक प्रमुख समस्या सफल नैदानिक सेटिंग में प्रभावकारिता के लिए इन विट्रो गतिविधि के साथ यौगिकों से हस्तांतरण की कमी है= "xref"> 5, 6, 7। प्रारंभ में, लक्ष्य आधारित दृष्टिकोण विरोधी एमटीबी दवाओं 5, जो पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं में अनुवाद करने में विफल रहा है के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यहां तक कि जब एमटीबी कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं, यह अक्सर शोरबा उगाया संस्कृतियों, जो सही विवो 8, 9 में दवा प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं है का उपयोग किया जाता है। इन समस्याओं को मान्यता दी गई है और एमटीबी या अव्यक्त एमटीबी युक्त मैक्रोफेज के खिलाफ दवा स्क्रीनिंग assays सफलतापूर्वक 8, 10, 11, 12 की स्थापना की गई है। हालांकि, यहां तक ​​कि इन अधिक उन्नत assays प्रवेश बाधाओं कि दवाओं के गैर-vascularized फेफड़े के घावों में मुठभेड़ करने के लिए पर्याप्त ध्यान देना नहीं है, और संक्रमण के स्थल पर परिगलित foci में। वास्तव में, यहां तक कि पहली पंक्ति टीबी दवा रिफैम्पिसिन के लिए, उप इष्टतम खुराक विवो ऊतक और मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (सीएसएफ) में अपर्याप्त होने के कारण पूछताछ की गई है साथ ही 13 प्रवेश, 14, 15 के रूप में intracellular एमटीबी 8, 9 के खिलाफ प्रभावकारिता की कमी हुई। इस तरह, नए मॉडल और assays है कि खाते में शुरुआती बढ़त के विकास की प्रक्रिया के दौरान इन मापदंडों लेने के लिए निस्संदेह टीबी दवाओं की खोज के प्रयासों में सुधार होता है।

इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हमने हाल ही में एक सस्ता, तेजी से, और बीएसएल -2 संगत विकल्प संक्रमण एमटीबी दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए 16 मॉडल की स्थापना की। इस संक्रमण मॉडल घनी का उत्पादन बड़े बृहतभक्षककोशिका कुल संरचनाओं के भीतर एमटीबी पैक, जो physiologically प्रासंगिक सेलुलर प्रवेश बाधाओं recapitulated और उत्पन्न बृहतभक्षककोशिका passaged एमटीबी जैसी एक बदल शारीरिक स्थिति के साथ एमटीबी। एमटीबी इस संक्रमण मॉडल से प्राप्त resazurin microtiter परख (REMA) के साथ जोड़ दिया गया था दवा प्रभावकारिता, जो उत्पादन अन्य intracellular संक्रमण मॉडल के साथ संगत परिणामों का मूल्यांकन करने और उच्च सांद्रता सीएसएफ सीरम सांद्रता के सापेक्ष प्राप्त करने के लिए आम टीबी दवाओं की सूचना क्षमता के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध 16।

यहाँ हम विस्तार से एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका कुल संरचनाओं की पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए बृहतभक्षककोशिका passaged एमटीबी REMA का उपयोग कर दवा संवेदनशीलता परीक्षण के लिए उपयुक्त वर्णन है। विशेष रूप से, हम बताएंगे कि कैसे इस संक्रमण प्रणाली उम्मीदवार विरोधी टीबी दवाओं के throughput स्क्रीनिंग के साथ संगतता के लिए एक 96 अच्छी तरह प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

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नोट: 2 6206 एक असंक्रामक तनाव 17, 18 है एम तपेदिक एम सी के रूप में, इस प्रोटोकॉल में सभी काम एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा (बीएसएल -2) में किया जा सकता है।

1. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए संस्कृति की स्थिति जताते एम तपेदिक एम सी 2 6206 (एमटीबी -GFP)

नोट: एम तपेदिक H37Rv auxotroph तनाव एम सी 2 6206 व्युत्पन्न (Δ panCD, Δ leuCD) GFP प्लाज्मिड pMN437 व्यक्त इस प्रोटोकॉल 16 भर में इस्तेमाल किया जाता है के साथ बदल दिया। यह गैर GFP जंगली प्रकार के तनाव को व्यक्त करने के लिए शोधकर्ताओं ने तनाव की आसान पहुँच सक्षम करने के साथ एमटीबी -GFP तनाव स्थानापन्न करने के लिए संभव है। हालांकि, GFP अभिव्यक्ति phagocytosis और एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय के गठन के दृश्य पुष्टि सक्षम करने के लिए वांछनीय है। लंदन के लिएजी अवधि के भंडारण, एमटीबी -GFP ° पूरा 7H9 मीडिया (1.1 चरण में वर्णित) 20% ग्लिसरॉल के साथ पूरक में सी -80 पर जमे हुए थे।

  1. 10% Middlebrook OADC, 0.02% tyloxapol, 24 माइक्रोग्राम / एमएल डी-pantothenic एसिड, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एल leucine और 50 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी के साथ 7H9 मध्यम सप्लीमेंट द्वारा पूरा एमटीबी -GFP मीडिया (7H9-सी) तैयार
  2. एमटीबी -GFP में से एक शीशी पिघलना और एक 30 एमएल वर्ग नीचे PETG फ्लास्क में 7H9-सी के 10 एमएल में जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस रोटरी प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर सेते हैं। ऑप्टिकल घनत्व माप (आयुध डिपो 600) हर कुछ दिनों तक आयुध डिपो 600 1.0 (लगभग 5-8 दिन) तक पहुँच जाता है ले लो।
  4. पतला और पारित होने संस्कृति के रूप में एक आयुध डिपो बनाए रखने के लिए 0.2-1.0 के बीच 600 की जरूरत है।
  5. संक्रमण के लिए, लघुगणक विकास के चरण (आयुध डिपो के 600 0.6-1) के भीतर एमटीबी -GFP की स्थापना की एक संस्कृति का उपयोग करें। Clumpy संस्कृतियों से बचने के लिए एक पानी के स्नान में एमटीबी संस्कृति कुप्पी sonicate (130 डब्ल्यू, 3 एक्स 5 एस दालों) ONCई या दो बार एक सप्ताह

2. के लिए संस्कृति की स्थिति THP-1 कोशिकाओं

  1. 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, और 10 मिमी HEPES के साथ RPMI 1640 मध्यम सप्लीमेंट द्वारा पूरा THP-1 सेल मीडिया (RPMI-सी) तैयार करें।
  2. 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टी -75 फ्लास्क में कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना या हर दूसरे दिन प्रवाह cytometry और 0.1 0.6 एमएल प्रति दस लाख के बीच घनत्व पर THP-1 कोशिकाओं को बनाए रखने।

3. संक्रमण प्रोटोकॉल एमटीबी / Macrophage सकल संरचनाएं उत्पन्न करने के लिए

  1. THP-1 सेल तैयारी (प्रति 96 अच्छी तरह से थाली)
    1. अपकेंद्रित्र 7 एक्स 10 6 5 मिनट के लिए 250 XG पर THP-1 कोशिकाओं। 7 एमएल RPMI-सी में Resuspend।
  2. एमटीबी -GFP तैयारी
    1. अपकेंद्रित्र 2.8 x 10 8 एमटीबी -GFP एक झूलते-बाल्टी अपकेंद्रित्र में 3200 5 के लिए XG मिनट में यूआयुध डिपो के 600 1.0 = 3 एक्स 10 8 बैक्टीरिया / एमएल के एक रूपांतरण गाते हैं।
    2. कदम 3.2.1 के रूप में RPMI-सी और सेंट्रीफ्यूज के साथ एक बार धो लें।
    3. 7 एमएल RPMI-सी में Resuspend और 10 एस के लिए भंवर।
  3. संक्रमण
    ध्यान दें: टेम्पलेट के लिए चित्रा 1 देखें।
    1. एक पानी रिम संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण को रोकने के लिए 1 और 12 पंक्तियाँ एक और एच और स्तंभों में बाँझ पानी के 200 μL जोड़कर एक 96 अच्छी तरह से थाली तैयार करें।
    2. 200 μL RPMI-सी पृष्ठभूमि नियंत्रण (रिक्त) के लिए स्तंभ 2 (G2 को बी 2) जोड़ें।
    3. संक्रमित करने के लिए, THP-1 सेल निलंबन (3.1 कदम) के लिए एमटीबी -GFP निलंबन (3.2 कदम) जोड़ने और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। अंतिम THP-1 सेल घनत्व 5 एक्स 10 5 एमएल प्रति है और संक्रमण की इसी बहुलता 40 है।
    4. एक 25 एमएल जलाशय में THP-1 / एमटीबी -GFP निलंबन डालो।
    5. (G11 के माध्यम से बी 3) THP-1 शेष सभी 96 कुओं / एमटीबी -GFP निलंबन के 200 μL usin जोड़ेगा मल्टी चैनल पिपेट।
      नोट: एकाधिक 96 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ काम कर रहे हैं, तो नियमित रूप से शेष THP-1 / एमटीबी निलंबन जलाशय में resuspend सुनिश्चित करने के लिए एक भी मिश्रण अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ा जाता है।
    6. 7-10 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. धीरे-धीरे 100 को हटाने के द्वारा हर 2 दिन मीडिया बदलें μL अच्छी तरह से और धीरे से प्रत्येक के ऊपर से मीडिया में खर्च जोड़ने के 100 μL पूर्व गर्म RPMI-सी एक मल्टी चैनल pipet का उपयोग। कुओं resuspend और कुओं के तल पर एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय को परेशान मत करो।
    8. दिखने में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (4-10X उद्देश्य) दैनिक द्वारा कुओं की जांच, एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय के आकार के नोट लेने। 7-10 दिन तक, एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय पर्याप्त बड़ी होना चाहिए दवा प्रभावकारिता परीक्षण (धारा 4) के लिए आगे बढ़ने के लिए (संदर्भ के लिए 2 चित्रा को देखें)।
    9. अगर वांछित, एक स्वचालित सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर 96 कुओं की छवियों पर कब्जा फिटउज्ज्वल क्षेत्र और GFP फिल्टर के साथ एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका कुल गठन करने के लिए दस्तावेज़ सेट।
      नोट: उन एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली के लिए पहुँच नहीं है, तो प्रतिनिधि कुओं की छवियों GFP और उज्ज्वल क्षेत्र क्षमताओं के साथ किसी भी उचित माइक्रोस्कोप का उपयोग लिया जा सकता है।

4. विकास निषेध परख का आकलन करने के लिए दवा की प्रभावकारिता के खिलाफ एमटीबी एमटीबी / Macrophage समुच्चय से व्युत्पन्न

  1. ड्रग तैयारी (दो दवाओं के लिए तीन प्रतियों की स्थिति)
    ध्यान दें: टेम्पलेट के लिए चित्रा 1 ए देखें।
    1. एक अलग 96 अच्छी तरह से थाली में, G10 के माध्यम से बी 2 के लिए 7H9-सी मीडिया के 125 μL जोड़ें।
    2. कदम 4.2.4 में कमजोर पड़ने के लिए खाते में 7H9-सी के 1 एमएल में डबल उच्चतम वांछित अंतिम एकाग्रता में दो दवाओं को तैयार है।
    3. प्रत्येक दवा के 250 μL तीन प्रतियों उपचार के लिए क्रमश: वेल्स को जोड़े B11-C11-D11 और E11-F11-G11।
    4. एक मल्टी चैनल pipet का प्रयोग, क्रमानुसार Dilसंस्थान परीक्षण दवाओं दो गुना B10-G10 में B11-G11 से 125 μL ले जाकर। हर कदम पर 5 बार pipetting द्वारा मिक्स।
    5. स्तंभ (दाएं से बाएं) थाली भर के लिए स्तंभ 125 μL ले जाते हैं, और स्तंभ 4 के बाद बंद करने के लिए आगे बढ़ें।
    6. स्तंभ 4 मिश्रण के बाद, बर्बादी कंटेनर में 125 μL त्यागें। कॉलम 2 और 3 के एक पृष्ठभूमि (रिक्त) और सकारात्मक वृद्धि नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए किसी भी दवाओं को शामिल नहीं करना चाहिए।
      नोट: वैकल्पिक, परीक्षण दवा पुस्तकालयों के लिए चित्रा 1 बी में टेम्पलेट का पालन करें। प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली एक भी एकाग्रता में 58 दवाओं को समायोजित कर सकते हैं। इस दवा डबल वांछित अंतिम एकाग्रता का उपयोग कर के बाद से यह कदम 4.2.4 में छमाही में पतला हो जाएगा प्लेट तैयार करें।
  2. दवा से इलाज:
    1. निकालते 96 अच्छी तरह से थाली एमटीबी युक्त -infected मैक्रोफेज (एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय)।
    2. ध्यान से एक मल्टी चैनल pipet के साथ सभी प्रासंगिक कुओं (G11 के माध्यम से बी 2) छानना।एक दो कदम तरीके से इस प्रदर्शन: पहला प्लेट झुकने के बिना 150 μL निकालें, और फिर प्लेट झुकने और अच्छी तरह से नीचे किनारे करने के लिए विंदुक टिप डालने से शेष मीडिया (~ 50 μL) को हटा दें। एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय अच्छी तरह से नीचे के अनुयायी हैं, कोई सामग्री खो दिया जाना चाहिए।
    3. धीरे एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय युक्त थाली के सभी प्रासंगिक कुओं (G11 के माध्यम से बी 2) को 7H9-सी मीडिया के 100 μL जोड़ें।
    4. एक मल्टी चैनल pipet का प्रयोग, संक्रमण थाली की इसी कुओं के लिए 96 अच्छी तरह से थाली (4.1 कदम) युक्त दवा से 100 μL हस्तांतरण।
    5. सील बैग में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए सेते हैं।

5. दवा प्रभावकारिता की मात्रा Resazurin Microtiter परख का उपयोग

  1. 0.8 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता में शेयर समाधान resazurin तैयार / एमएल एच 2 ओ में 0.22 माइक्रोन ताकना नसबंदी के लिए आकार PVDF झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर।
  2. 1: 1 के अनुपात में एक 2 में resazurin शेयर समाधान, एच 2 ओ और बीच-80 में (एच 2 ओ 20% समाधान) के मिश्रण से समाधान काम कर resazurin तैयार करें। अंतिम सांद्रता 0.4 मिलीग्राम / एमएल resazurin और 5% बीच 80 हैं।
  3. एक प्लेट रीडर, सेटअप 530 एनएम उत्तेजना और 590 एनएम उत्सर्जन 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए हर 30 मिनट पर प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए एक कार्यक्रम का उपयोग करना। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म प्लेट रीडर।
  4. दवा इलाज थाली (कदम 4.11) एक मल्टी चैनल pipet का उपयोग कर के सभी प्रासंगिक कुओं (बी 2 G11 के माध्यम से) के लिए काम कर रहा resazurin समाधान के 20 μL जोड़ें।
  5. प्लेट रीडर पर थाली प्लेस और कार्यक्रम 5.3 चरण में स्थापित करने के लिए शुरू करते हैं।
    नोट: परख प्लेटों की उच्च मात्रा के प्रसंस्करण की सुविधा के लिए, यह एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में परख विकसित करने और एकल प्रतिदीप्ति हर 24 घंटे पढ़ता प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है। यह भी उपयोगकर्ताओं को, जो गतिज और ऊष्मायन क्षमताओं के साथ एक प्लेट पाठक के लिए उपयोग नहीं करने के लिए लागू है।

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Representative Results

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96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप को यह संक्रमण मॉडल अनुकूल ढालने की मजबूती इस बात की पुष्टि करने के लिए, हम यहाँ एमटीबी की दवा संवेदनशीलता हमारे 96 अच्छी तरह से निकाली गई रिफैम्पिसिन के लिए संक्रमण मॉडल (राइफल्स) और moxifloxacin (Moxi) अनुकूलित जांच चित्रा में दिए गए खाके के अनुसार 1 ए। हम जानते हैं कि एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका कुल इस परख के लिए महत्वपूर्ण संरचनाओं की पीढ़ी मज़बूती से, एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप (चित्रा 2) में उत्पादन किया जा सकता है, जिससे throughput अनुकूलता (चित्रा 1 बी) के अनुरुप बनाने प्रदर्शित करता है। Macrophage passaged एमटीबी इस तरीके से उत्पादित सीधे अच्छी तरह से विशेषता resazurin microtiter परख (चित्रा 3) का उपयोग दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Resazurin परख पाचन सक्रिय एमटीबी द्वारा उत्पादित ऑक्सीडेटिव प्रजातियों पर निर्भर करता है के रूप में स्त्राव के लिए नीले resazurin परिवर्तित करने के लिएगुलाबी resorufin escent, रंग और रोशनी में परिवर्तन बैक्टीरिया विकास की राशि का निर्धारण करने के लिए एक किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 3 में, हम बताते हैं resazurin परख के भीतर पर्याप्त संवेदनशीलता मज़बूती से व्यवहार्य एमटीबी बैक्टीरिया ऊष्मायन के केवल 3 दिनों के बाद दवाओं के अभाव में नकल करने में सक्षम पता लगाने के लिए नहीं है। जबकि समापन बिंदु रंग बदलने के दृश्य पुष्टि केवल विकास की एक अनुमानित मूल्यांकन है, हम सही kinetically एक प्लेट पाठक (चित्रा 3 बी) का उपयोग resorufin इसके फ्लोरोसेंट मेटाबोलाइट को resazurin के रूपांतरण को मापने के द्वारा इस मात्रा ठहराना कर सकते हैं। इन आंकड़ों का प्रयोग, सकारात्मक विकास नियंत्रण (दवाओं के अभाव) के लिए सामान्य संवेदनशीलता की हत्या घटता की गणना बृहतभक्षककोशिका passaged एमटीबी के खिलाफ दवा प्रभावकारिता कल्पना करने के लिए (चित्रा 4) के लिए अनुमति देता है।

इधर, आंकड़े में प्रतिनिधि परिणाम 3 4 चलता है कि कम से कम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी), एंटीबायोटिक, जिस पर 90% की वृद्धि निषेध मनाया जाता है की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है, दोनों रिफैम्पिसिन और moxifloxacin एमटीबी के खिलाफ हमारे संक्रमण मॉडल से प्राप्त करने के लिए अधिक से अधिक से अधिक 2 माइक्रोग्राम / एमएल है। यह दर्शाता है कि हमारे संक्रमण मॉडल विरोधी एमटीबी दवाओं है कि intracellular एमटीबी 8 के खिलाफ निर्धारित किया एमआईसी मूल्यों के साथ लाइन में और अधिक कर रहे हैं की प्रभावकारिता भविष्यवाणी की है, और इस तरह प्रसार बाधा गुण है कि शोरबा उगाया बैक्टीरियल कोशिकाओं का उपयोग सबसे एमटीबी दवा संवेदनशीलता assays में उपेक्षित रहे हैं दर्शाता है।

महत्वपूर्ण बात है, डेटा 96 अच्छी तरह प्रारूप में वर्णित परख का उपयोग कर प्राप्त उन हम पहले से रिफैम्पिसिन और बृहतभक्षककोशिका passaged एमटीबी 16 के खिलाफ moxifloxacin के लिए चुना गया था करने के लिए अत्यधिक तुलनीय परिणाम दिखाया।


चित्रा 1: ड्रग थाली लेआउट। (ए) दवा चुनौती प्लेट चरण 4 में इस्तेमाल के उदाहरण टेम्पलेट इस समानांतर 8 परिभाषित सांद्रता में तीन प्रतियों कुओं में दो दवाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देता है। एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, हम रिफैम्पिसिन (राइफल्स) और moxifloxacin (Moxi) का इस्तेमाल किया 2 माइक्रोन और 2.5 सुक्ष्ममापी पर शुरू, क्रमशः। (बी) throughput प्रदर्शन के लिए एक वैकल्पिक टेम्पलेट भी एक भी एकाग्रता में 58 यौगिकों के परीक्षण की संभावना को दिखाने के लिए प्रदान की जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एमटीबी की पीढ़ी / बृहतभक्षककोशिका कुल संरचनाओं 96 अच्छी तरह से थाली मेंप्रारूप। (ए) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और GFP दिन 9 के बाद संक्रमण पर एमटीबी -macrophage समुच्चय की छवियों विलय कर दिया। छवियाँ एक स्वचालित सेल इमेजिंग प्रोग्राम है कि 3 को व्यक्तिगत रूप से कब्जा कर लिया छवियों से 3 की एक असेंबल सिलाई द्वारा पूरे अच्छी तरह से दस्तावेजों का उपयोग कर एक 4X उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया। (बी) (ए) में दिखाया गया दृश्य क्षेत्र से एक व्यक्ति को गैर-सिले छवि। (सी) एक प्रतिनिधि एक एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका कुल संरचना एक 10x उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया उज्ज्वल क्षेत्र और GFP की छवि विलय कर दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एमटीबी व्यवहार्यता को मापने के लिए resazurin microtiter परख का उपयोग करना। (ए) viabl की उपस्थितिई एमटीबी कोशिकाओं बस अपने गुलाबी, कम फार्म के लिए नीले रंग की डाई resazurin के रूपांतरण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम यहाँ दिखाए जाते हैं रिफैम्पिसिन (राइफल्स) और moxifloxacin (Moxi) चित्रा 1 ए में टेम्पलेट के अनुसार इस्तेमाल करते हैं। कदम के रूप में वर्णित (बी) के मात्रात्मक, resazurin के रूपांतरण को मापने के लिए अलग-अलग कुओं की प्रतिदीप्ति (3 चित्रा के लिए इसी) 24 घंटे के लिए kinetically नजर रखी थी 5. प्रतिनिधि मिनी रेखांकन समय बनाम रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (शाफ़्ट) दिखाने (x -एक्सिस)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: दवा संवेदनशीलता REMA डेटा से घटता की हत्या का निर्धारण। अधिक से अधिक resaz के समय में रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों(A) रिफैम्पिसिन और (चित्रा 3 बी से) (बी) moxifloxacin इलाज किया कुओं urin संकेत 100% अस्तित्व के रूप में कोई दवा नियंत्रण (अधिक से अधिक एमटीबी विकास) के लिए सामान्यीकृत थे। पृष्ठभूमि नियंत्रण (रिक्त) संकेतों हर नमूना से अच्छी तरह से घटाया गया था। प्रतिशत अस्तित्व नशीली दवाओं के उपचार के प्रत्येक व्यक्ति एकाग्रता एक की हत्या की अवस्था उत्पन्न करने के लिए साजिश रची गई थी। इस आंकड़े में डेटा ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ, हम विस्तार से वर्णन किया है एक वैकल्पिक एमटीबी संक्रमण दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए उपयुक्त मॉडल। यह मॉडल खाते के दो महत्वपूर्ण कारक है कि जल्दी टीबी दवा के विकास की प्रक्रिया के दौरान अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए में ले जाता है: दवा पैठ और संक्रमण के दौरान एमटीबी के चयापचय में परिवर्तन करने के लिए physiologically प्रासंगिक बाधाओं की उपस्थिति। हम पहले हमारे संक्रमण मॉडल का लाभ दिखाया और throughput अनुकूलता 16 के लिए संक्रमण को स्केलिंग की संभावना का प्रस्ताव किया है, वहीं यहां हम दिखाना है कि यह वास्तव में प्रणाली 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में सीधे आदत डाल द्वारा प्राप्त है। के रूप में यह पिपेट करने के लिए आवश्यकता को निकालता है और अलग-अलग कुओं में एक बड़ा संस्कृति फ्लास्क, जो स्वाभाविक रूप से मुश्किल है समुच्चय के आकार के आकार तक पहुँच सकते हैं से समुच्चय वितरित एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका उत्पन्न करने की क्षमता 96 अच्छी तरह प्लेटों में सीधे समुच्चय फायदेमंद है> 500 माइक्रोन। संक्रमित मैक्रोफेज समुच्चय के बड़े आकार P200 मल्टी चैनल pipettes कि throughput assays के लिए जरूरी हैं या तो यह सुझाव दिए रोकना होगा या व्यापक pipetting समुच्चय तोड़ने के अलावा होगा के रूप में के उपयोग को रोका जा सके। 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए इस संक्रमण प्रणाली के संशोधन की जरूरत हेरफेर कदम की राशि कम कर देता है और एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय की समान मात्रा के साथ एक समान कुओं उत्पन्न करता है। जैसे, इस परख प्रणाली विशेष रूप से महत्वपूर्ण है न केवल जल्दी विकास की प्रक्रिया विवो में नेतृत्व उम्मीदवार यौगिकों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने में है, लेकिन दवा पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग में।

वर्णित संक्रमण मॉडल की एक प्रमुख लाभ एक बीएसएल -2 संगत एमटीबी तनाव का उपयोग होता है। बीएसएल -2 की शर्तों के तहत काम करने की क्षमता, उच्च लागत प्रभावी है प्रोटोकॉल के हेरफेर accelerates, और सबसे महत्वपूर्ण बात प्रयोगशालाओं कि प्रदर्शन करने के लिए एक बीएसएल 3 की सुविधा के लिए पहुँच नहीं है सक्षम बनाता हैएसई दवा स्क्रीनिंग assays उन्नत। उपयोग किया auxotrophic एमटीबी एम सी 2 6206 तनाव H37Rv 17, 18 के व्युत्पन्न है कि सभी लेकिन 4 जीन, panCD और leuCD, जो दवा प्रतिरोध या सहिष्णुता 16 को प्रभावित नहीं करते बरकरार रखे हुए है। ऐसे एम बोविस बीसीजी और एम smegmatis, एमटीबी एम सी 2 6206 सबसे निकट एमटीबी H37Rv, रोगजनन अध्ययन के लिए संदर्भ तनाव विषमय से संबंधित है के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल एमटीबी surrogates की तुलना में। महत्वपूर्ण बात है, यह आरडी 1 ठिकाना है, जो बीसीजी से अनुपस्थित है और एमटीबी डाह और ग्रेन्युलोमा गठन के 19 में एक प्रमुख भूमिका निभाता बनाए रखता है। तुलनात्मक रूप से, एमटीबी एम सी 2 6206 भी एम smegmatis है, जो एक तेजी से बढ़ रही प्रजाति है कि एमटीबी से genomically अलग है और अलग अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफाइल की तुलना में टीबी दवा के विकास assays के लिए और अधिक प्रासंगिक है।

परख यहाँ वर्णित लचीलेपन के अपने उच्च स्तर के कारण भी मूल्यवान है। 96 अच्छी तरह एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका समुच्चय युक्त प्लेटें न केवल triplicates में नशीली दवाओं के उपचार के अनुमापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में हम (चित्रा 3), बल्कि पूरे दवा पुस्तकालयों (चित्रा 1 बी) की स्क्रीनिंग के लिए दिखाया गया है। एक भी एकाग्रता में, प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली 58 यौगिकों स्क्रीन कर सकते हैं। यदि संक्रमण प्रणाली एक 384 अच्छी तरह से थाली है, जो के आधार पर पूरी तरह से संभव है के लिए अनुकूल है यह संख्या काफी> 300 को यौगिकों में वृद्धि होगी तथ्य यह है कि हम केवल बैक्टीरिया 3 दिन के लिए दोहराने की अनुमति के बाद मजबूत resazurin संकेतों को प्राप्त करता है। वास्तव में, यह अपेक्षाकृत 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप करने के लिए इस प्रणाली के अनुकूल करने के लिए आसान हो जाएगा, अन्य के रूप में की तुलना में नीचे स्केलिंग छोटे प्रारूप में अच्छी तरह से सूट करने के लिए मात्रा में आनुपातिक, प्रोटोकॉल के बहुमत अपरिवर्तित रहेगा। resazurin परख के लिए पर्याप्त संकेत सक्षम करने के लिए, यह हो सकता है4.2.5 से 7 दिन में कदम ऊष्मायन का विस्तार करने के लिए पर्याप्त बैक्टीरियल प्रतिकृति के लिए अनुमति देने के लिए जरूरी है।

जबकि एमटीबी व्यवहार्यता के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में resazurin परख करने के लिए इस संक्रमण मॉडल युग्मन कई लाभ है, अर्थात् अपनी लागत प्रभावशीलता और त्वरित परख प्रोटोकॉल जबकि ऐसी BACTEC 460 20 के रूप में अन्य सोने के मानक प्रणालियों के लिए तुलनीय परिणाम प्राप्त है, यह फिर भी कुछ सीमाएं हैं । resazurin परख बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक दवाओं के बीच भेदभाव नहीं कर सकते हैं क्योंकि यह केवल चयापचय गतिविधि के उपाय। यह एक महत्वपूर्ण बाधा, मन में रखने के रूप में चयापचय गतिविधि अव्यक्त एमटीबी में स्वाभाविक कम है। हालांकि, इस परख के प्रमुख घटक संक्रमण मॉडल है, जो एमटीबी दवा resazurin परख के अलावा अन्य संवेदनशीलता के लिए पढ़ने के बहिष्कार के साथ संगत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नशीली दवाओं के उपचार के बाद, कुओं सीधे बाहर कॉलोनी इकाई गठन (CFU) गिनती के लिए चढ़ाया जा सकता है, सोने स्टेनदर्द यौगिकों की जीवाणुनाशक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए (हालांकि इस स्क्रीनिंग के साथ संगत नहीं है)। वैकल्पिक रूप से, इस प्रणाली को व्यक्त एमटीबी, जो CFU गिनती 21 को बारीकी से सहसंबंधी दिखाया गया है luciferase करने के लिए मिलकर किया जा सकता है। दवा संवेदनशीलता को मापने के लिए एक luciferase प्रणाली का उपयोग करने के लिए, केवल दो प्रोटोकॉल में परिवर्तन की आवश्यकता होगी: i) एमटीबी -luciferase और ii) चरण 5 में resazurin के स्थान पर ब्राइट-Glo luciferin अभिकर्मक के उपयोग के साथ एमटीबी -GFP के प्रतिस्थापन। luciferase के उपयोग व्यक्त एमटीबी 30 मिनट के लिए परख के विकास को छोटा होता है, जबकि काफी का स्तर है कि 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप के साथ आसानी से संगत होगा करने के लिए परख संवेदनशीलता बढ़ रही है।

सारांश में, हम सफलतापूर्वक एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप अपेक्षाकृत कुछ हेरफेर कदम, उच्च reproducibility है कि में इस संक्रमण मॉडल, और शुरू की अंतहीन मात्रा में उत्पादन करने की क्षमता transitioned हैसामग्री, throughput अनुकूलता में सभी प्रमुख कारक हैं। यह परख भी आसानी से कई विभिन्न स्वरूपों और पढ़ने के बहिष्कार के लिए अनुकूल है, यह जल्दी एमटीबी दवाओं की खोज की प्रक्रिया के लिए एक मूल्यवान संपत्ति कर रही है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

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References

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एक उच्च throughput संगत परख Macrophage passaged के खिलाफ ड्रग प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em
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Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).More

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

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