On décrit ici une approche de dépistage comportementale qui peut être utilisée pour cribler des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de la β-amyloïdose et de la tauopathie. Ces méthodes sont optimisées pour filtrer les composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail.
Ici, nous décrivons une approche de test comportementale mise en scène qui peut être utilisée pour dépister des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie. Le paradigme comprend des tests d'alternance spontanée dans un labyrinthe Y, une nouvelle reconnaissance d'objet et une fermeture des membres. Ces tests ont été sélectionnés parce qu'ils: 1) interroger la fonction des domaines cognitifs ou moteurs et les circuits neuronaux corrélés pertinents pour l'état pathologique humain, 2) avoir des points d'extrémité clairement définis, 3) avoir des contrôles de contrôle de qualité facilement réalisables, 4) peuvent être exécutés dans Un format de débit modéré, et 5) exigent peu d'intervention de l'enquêteur. Ces méthodes sont conçues pour les chercheurs qui cherchent à cribler des composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail, ou des comportements moteurs fonctionnels associés aux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer. Les méthodes décrites ici utilisent des tests comportementaux qui engUn certain nombre de régions du cerveau différentes, y compris l'hippocampe et diverses zones corticales. Les chercheurs qui souhaitent des tests cognitifs qui évaluent spécifiquement la cognition médiée par une seule région du cerveau pourraient utiliser ces techniques pour compléter d'autres tests de comportement.
La maladie d'Alzheimer (AD) est un trouble neurodégénératif progressif entraînant un déclin cognitif débilitant qui touche environ 44 millions de personnes à travers le monde. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements disponibles pour AD qui modifient la maladie, soulignant le besoin urgent de découverte préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie. Un certain nombre de modèles de souris transgéniques différents ont été créés qui récapitulent divers aspects de AD 1 , 2 , y compris les déficits dans les domaines cognitifs perturbés chez les patients 3 . Ces modèles de souris représentent un outil utile pour faciliter le dépistage efficace in vivo .
Lors de l'évaluation d'un composé pour une efficacité in vivo potentielle, une approche progressive doit être prise pour que les écrans d'efficacité dans les domaines cognitifs appropriés et surveille également les comportements qui pourraient influencer les points d'extrémité spécifiques utilisés pourSsess cognition. De nombreux modèles de souris transgéniques d'AD présentent une hyperactivité et d'autres comportements qui peuvent interférer avec un test cognitif particulier et interdire son utilisation dans le dépistage de médicaments 4 . En outre, pour une approche à mettre en œuvre dans un environnement de dépistage de drogue, les tests particuliers utilisés devraient maintenir au moins un débit modéré, avoir des paramètres définis clairement définis et une procédure nécessitant une intervention minimale des enquêteurs. En utilisant ces critères, des écrans comportementaux peuvent être implémentés qui présentent la reproductibilité, la faible variance intra et inter-dosage et les tailles d'effets nécessaires au dépistage des composés. Voici quelques-unes des méthodes que nous avons utilisées pour filtrer les composés efficaces pour atténuer les phénotypes cognitifs et moteurs présents dans les modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie 5 , 6 . Les méthodes décrites sont adaptées à partir des paradigmes comportementaux couramment utilisés signalés dans le lItération 7 , avec des optimisations spécifiques et des contrôles de contrôle de qualité afin qu'ils puissent être utilisés dans des modèles de souris transgéniques pertinents pour AD. Ce protocole peut être utilisé avec une variété de systèmes d'acquisition et d'analyse de données et suppose que l'investigateur possède une connaissance approfondie du logiciel associé.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes
Cette procédure a été conçue pour détecter l'activité in vivo des composés dans des modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie. L'approche par étapes utilisée ici assure la détection de composés efficaces dans des domaines cognitifs pertinents pour AD 3 . En outre, l'approche détaillée ici utilise des tests de comportement qui ont des points d'extrémité clairement définis, des contrôles de contrôle de qualité facilement réalisables, peuvent être exécutés avec un format de débit modéré et nécessitent peu d'intervention de l'enquêteur. Ces caractéristiques aboutissent à des analyses qui présentent une bonne reproductibilité chez les animaux et à travers les cohortes, ce qui entraîne une faible variance intra et inter-dosage et des tailles d'effet (2 ≤ f ≤ 6) suffisamment robustes pour supporter le profil comportemental dans un environnement de découverte de médicaments.
Étapes essentielles au sein du PrOtocol
Beaucoup de modèles de souris utilisés pour la découverte de médicaments AD détectent des comportements compatibles avec une anxiété et une agression accrues. Cela rend l'habitude de manipulation essentielle pour l'exécution de l'un des tests comportementaux décrits ici. Comme ces tests reposent sur des comportements non motivés, la manipulation brutale de l'investigateur en raison d'une souris hyperactive et anxieuse ou agressive peut influencer de manière significative les performances. Une anxiété accrue pourrait entraîner l'échec de l'exécution de la tâche, réduisant ainsi la puissance globale du test. En outre, les niveaux de lumière dans l'arène sont essentiels pour faciliter la locomotion spontanée nécessaire pour chaque test. La lumière lumineuse tend à augmenter l'anxiété et à supprimer la locomotion chez les rongeurs, il faut donc veiller à ajuster les niveaux de lumière ambiante à 30-35 lux dans l'arène.
Un autre aspect critique de la procédure consiste à minimiser les indices environnementaux solides qui entraveraient la capacité d'un animal à effectuer les tâches. Nettoyage de laL'arène et les objets entre les courses sont essentiels car les souris sont attirées par de nouveaux parfums dans l'environnement. Le fait de ne pas nettoyer soigneusement l'arène et les objets pourrait entraîner une inclinaison de l'activité spontanée de la souris et masquer les performances cognitives réelles. Les chercheurs devraient également minimiser l'utilisation de produits d'hygiène personnelle et de colognes / parfums lors de l'exécution de ces procédures. Enfin, les rongeurs présentent de solides changements diurne et circadien dans de nombreux comportements ouverts 20, y compris l'apprentissage et la mémoire 21 . Par conséquent, pour minimiser la variance due aux rythmes diurnes dans les comportements basaux et les performances cognitives, tous les tests devraient être effectués au même moment de la journée à travers les cohortes et les études.
De plus, en particulier en ce qui concerne la reconnaissance de nouveaux objets, l'intervalle de délai entre l'échantillon et la phase de test, et la sélection et le placement d'objets dans l'environnement sont des paramètres critiques. La mémoire existe sous 3 formes distinctes: mémoire à court termeOry (STM), mémoire à terme intermédiaire (ITM) et mémoire à long terme (LTM) 22 , 23 . La modification de l'intervalle entre l'échantillon et les phases de test de minutes (STM) à heures (ITM) ou jours (LTM) changera le type de mémoire testé par la procédure 12 . En outre, avant d'exécuter le nouveau test de reconnaissance d'objet, de nombreux objets devraient être sélectionnés dans une cohorte test de souris pour des biais potentiels dans l'exploration. Un objet excessivement attrayant ou répulsif pour la cohorte d'essai ne peut pas être utilisé lors de l'évaluation de la reconnaissance de nouveaux objets. Idéalement, tous les objets qui seront utilisés dans le test, lorsqu'ils seront placés dans une arène, généreront des temps d'exploration égaux à partir d'une cohorte de souris indigène. Un test et une optimisation inadéquats des objets peuvent réduire considérablement la puissance de la nouvelle reconnaissance d'objets.
Modifications et dépannage
Il existe plusieurs facteurs qui pourraient augmenter leVariabilité apparente dans les tests cognitifs décrits ici. De nombreux modèles de souris de l'AD présentent une locomotion hyperdynamique 3 qui peut masquer ou modifier les comportements mesurés comme critère cognitif. De plus, il existe de plus en plus de preuves que le sexe 24 , 25 , 26 et même le génotype maternel 27 peut influencer le développement et la progression de la neuropathologie et des phénotypes cognitifs dans les modèles de souris AD. La variabilité inattendue ou l'échec de la mise en œuvre d'une tâche comportementale pourrait être dû à l'un de ces facteurs. Lors de la première mise en œuvre d'un test de comportement particulier, les résultats doivent toujours être stratifiés selon le sexe, l'âge et, le cas échéant, le génotype maternel. En outre, les contrôles de qualité décrits dans cette procédure doivent toujours être effectués pour s'assurer que l'hyperactivité ou d'autres comportements stéréotypés n'interfèrent pas avec la quantification des paramètres cognitifs.
EnvL'ironisation peut également influencer le comportement exploratoire spontané des rongeurs. Les parfums ou les sons qui sont indétectables pour les chercheurs pourraient attirer ou repousser les souris, faussant les résultats des tests cognitifs qui reposent sur un comportement spontané. Lorsqu'il établit initialement une reconnaissance de Y-maze ou un nouvel objet, la performance des mesures de contrôle pour s'assurer qu'il n'y a pas de biais de position dans l'exploration d'objets et / ou de l'environnement est essentielle. Si les biais de position sont observés, les enquêteurs doivent surveiller minutieusement l'environnement et éventuellement ajuster l'éclairage, le classement de l'arène, la localisation de la salle d'essai par rapport aux autres pièces de l'installation ( c.-à-d. , Pas près d'une zone de trafic ou d'équipement lourd) et des procédures de nettoyage de l'arène.
L'habituation à l'environnement de test est la clé pour obtenir des performances optimales dans le nouveau test de reconnaissance d'objets. Par exemple, les faibles temps d'exploration total peuvent être attribuables à une habitude insuffisante. Comme alternative au procLes calculs décrits ici pour la manipulation (section 2) et l'arène (section 4.2), l'accoutumance à la manipulation et l'environnement de test peuvent être effectués en 3, 5 minutes par jour pendant 2 jours consécutifs.
Limites de la technique
Comme pour toute procédure, ces tests comportementaux ont des limites. Ces procédures ont été utilisées parce qu'elles testent la fonction de diverses régions corticales et de l'hippocampe. Si le modèle de la souris ne présente pas de déficits fonctionnels dans les régions cérébrales sondées par ces tests, ces techniques ne seront pas utiles. En outre, nous avons choisi des tests cognitifs qui utilisent la mémoire à court terme. Si le mécanisme d'action du composé dans le cadre d'une évaluation préclinique ne devrait pas affecter la mémoire à court terme, ces procédures devraient être modifiées en conséquence ( c.-à-d . Augmenter l'intervalle de phase de test d'échantillon pour tester la mémoire à long terme). Enfin, ces tests utilisent des comportements non motivés. Par conséquent, si un modèle de souris est excesExtrêmement hyperactif ou affiche d'autres comportements stéréotypés qui empêchent l'exploration de l'environnement, alors ces procédures pourraient ne pas être optimales. En alternative, on pourrait utiliser le conditionnement de la peur pour Tg2576 ou d'autres modèles de souris ß-amyloïdose, ou le labyrinthe spatial pour rTg4510 ou d'autres modèles de tauopathies de souris 3 .
Applications futures
Une fois que ces procédures ont été adoptées avec succès dans le laboratoire, plusieurs modifications ou extensions peuvent être faites pour évaluer les mesures moteur cognitives et fonctionnelles supplémentaires. Par exemple, modifier la nouvelle tâche de reconnaissance d'objet pour déterminer si une souris peut reconnaître une modification dans le placement d'un objet 13 . Alternativement, au lieu d'utiliser des objets, on pourrait utiliser d'autres souris et mettre en œuvre un test de reconnaissance sociale. En ce qui concerne le serrage des membres et la fonction du moteur, on pourrait compléter ce test par les tests de résistance au four et / ou à la force de préhension. Les testsDétaillés dans cette méthode forment une base solide pour filtrer les composés qui ont une efficacité in vivo dans les modèles de souris translationnels pour AD et peuvent être adaptés ou modifiés de plusieurs façons pour mieux interroger un modèle de souris particulier ou répondre aux besoins d'un programme unique de découverte de médicaments .
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |