Здесь описан поэтапный подход к поведенческому скринингу, который может быть использован для скрининга соединений, которые проявляют in vivo эффективность когнитивного и функционального моторного поведения в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Эти методы оптимизированы для скрининга соединений для работы в краткосрочных и рабочих задачах памяти.
Здесь мы описываем поэтапный подход к поведенческому тестированию, который можно использовать для скрининга соединений, которые демонстрируют эффективность in vivo в отношении когнитивных и функциональных моторных поведений в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Парадигма включает тесты для спонтанного чередования в Y-лабиринте, распознавании новых объектов и скреплении конечностей. Эти тесты были выбраны потому, что они: 1) опрашивают функцию когнитивных или моторных доменов и коррелируют нейронные цепи, относящиеся к состоянию заболевания человека, 2) имеют четко определенные конечные точки; 3) имеют легко осуществимые проверки контроля качества; 4) могут быть запущены в Умеренный формат пропускной способности и 5) требуют небольшого вмешательства со стороны исследователя. Эти методы предназначены для исследователей, ищущих экранирование соединений для работы в краткосрочных и рабочих задачах памяти, или функциональных моторных поведениях, связанных с моделями мышей болезни Альцгеймера. Методы, описанные здесь, используют поведенческие тесты, которыеВозраст ряда различных областей мозга, включая гиппокамп и различные области коры. Исследователи, которые хотят когнитивных тестов, которые конкретно оценивают познание, опосредованное одним участком мозга, могут использовать эти методы для дополнения других поведенческих тестов.
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, приводящим к ослаблению когнитивного расстройства, которое затрагивает примерно 44 миллиона человек во всем мире. В настоящее время нет доступных методов лечения АД, которые являются модификаторами болезни, подчеркивая настоятельную необходимость доклинического открытия новых терапевтических стратегий для этого заболевания. Было создано несколько различных моделей трансгенных мышей, которые повторяют различные аспекты AD 1 , 2 , включая дефициты когнитивных доменов, нарушенных у пациентов 3 . Эти мышиные модели представляют собой полезный инструмент для эффективного скрининга in vivo .
При оценке соединения для потенциальной эффективности in vivo следует использовать поэтапный подход, который обеспечивает эффективность в соответствующих когнитивных областях, а также контролирует поведение, которое может влиять на конкретные конечные точки, используемые дляПознания. Многие модели трансгенных мышей AD проявляют гиперактивность и другие формы поведения, которые могут влиять на определенный когнитивный тест, и запрещают его использование при скрининге лекарств 4 . Более того, для подхода, который должен быть реализован в среде скрининга лекарств, конкретные используемые тесты должны поддерживать по меньшей мере умеренную пропускную способность, иметь четко определенные конечные точки и процедуру, которая требует минимального вмешательства со стороны исследователей. Используя эти критерии, могут быть реализованы поведенческие экраны, которые демонстрируют воспроизводимость, низкие внутри- и межаналитические отклонения и размеры эффекта, необходимые для скрининга соединений. Подробно описаны методы, которые мы использовали для скрининга соединений, эффективных для смягчения когнитивных и моторных фенотипов, присутствующих в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии 5,6 . Описанные методы адаптированы из общепринятых поведенческих парадигм, описанных в lIterature 7 со специфическими оптимизациями и проверками контроля качества, чтобы они могли использоваться в моделях трансгенных мышей, относящихся к AD. Этот протокол может использоваться с различными системами сбора и анализа данных и предполагает, что исследователь имеет опыт работы с соответствующим программным обеспечением.
Значение техники в отношении существующих методов
Эта процедура была разработана для скрининга in vivo активности соединений в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Поэтапный подход, используемый здесь, обеспечивает обнаружение эффективных соединений в когнитивных доменах, имеющих отношение к AD 3 . Более того, подход, описанный здесь, использует тесты поведения, которые имеют четко определенные конечные точки, легко реализуемые проверки контроля качества, могут выполняться в умеренном формате пропускной способности и не требуют вмешательства со стороны исследователя. Эти характеристики приводят к исследованиям, которые демонстрируют хорошую воспроизводимость у животных и в когортах, что приводит к низкой дисперсии и размерам внутри- и межпроцедурного анализа (2 ≤ f ≤ 6 ), которые достаточно устойчивы, чтобы поддерживать поведенческое профилирование в среде обнаружения лекарств.
Критические шаги в Protocol
Многие мышиные модели, используемые для открытия лекарств AD, демонстрируют поведение, соответствующее повышенной тревожности и агрессии. Это делает использование привыкания необходимым для выполнения любого из описанных здесь тестов поведения. Поскольку эти тесты основаны на немотивированном поведении, грубое обращение исследователя из-за гиперактивной и тревожной или агрессивной мыши может существенно повлиять на производительность. Повышенная тревожность может привести к неспособности выполнить задачу, уменьшая общую силу теста. Кроме того, уровни освещенности на арене необходимы для того, чтобы облегчить спонтанную локомоцию, необходимую для каждого теста. Яркий свет, как правило, усиливает беспокойство и подавляет двигательную активность у грызунов, поэтому следует принять меры для регулировки уровня освещенности до 30-35 люкс на арене.
Другим критическим аспектом процедуры является минимизация сильных экологических сигналов, которые могли бы помешать способности животного выполнять задачи. ОчисткаАрене и объектах в промежутках между прогонами очень важно, поскольку мышей привлекают новые ароматы в окружающей среде. Невозможность тщательно очистить арену и объекты может привести к искажению спонтанной активности мыши и маскировке истинной познавательной способности. Следователи также должны минимизировать использование продуктов личной гигиены и одеколонов / парфюмерии при выполнении этих процедур. Наконец, грызуны демонстрируют сильные суточные и суточные изменения во многих открытых проявлениях 20, включая обучение и память 21 . Поэтому, чтобы минимизировать дисперсию из-за суточных ритмов в базальном поведении и когнитивной деятельности, все тесты должны проводиться в одно и то же время суток в когортах и исследованиях.
Кроме того, в частности, в отношении нового распознавания объектов, критическим параметром является интервал задержки между выборкой и тестовой фазой, а также выбор и размещение объектов в среде. Память существует в 3 различных формах: краткосрочная memOry (STM), промежуточной памяти (ITM) и долговременной памяти (LTM) 22 , 23 . Изменение интервала между выборкой и фазами тестирования от минут (STM) до часов (ITM) или дней (LTM) изменит тип памяти, проверенной процедурой 12 . Более того, перед запуском нового теста распознавания объектов многие объекты должны быть проверены в тестовой когорте мышей для потенциальных уклонов в исследовании. Объект, который является чрезмерно привлекательным или отталкивающим для испытуемой когорты, не может использоваться при оценке нового распознавания объектов. В идеале все объекты, которые будут использоваться в тесте, когда они помещены на арену, будут вызывать равное время исследования у наивной когорты мышей. Неадекватное тестирование и оптимизация объектов могут значительно снизить возможности распознавания новых объектов.
Модификации и устранение неполадок
Существует несколько факторов, которые могут увеличитьКажущуюся вариабельность описанных здесь когнитивных тестов. Многие мышиные модели AD демонстрируют гипердинамическую локомоцию 3, которая может маскировать или изменять поведение, измеряемое как когнитивная конечная точка. Более того, все больше доказательств того, что секс 24 , 25 , 26 и даже материнский генотип 27 могут влиять на развитие и прогрессирование невропатологии и когнитивных фенотипов в моделях мышей AD. Неожиданная изменчивость или невозможность реализации поведенческой задачи может быть вызвана любым из этих факторов. При первом внедрении определенного поведенческого теста результаты всегда должны быть стратифицированы по полу, возрасту и, если применимо, материнскому генотипу. Кроме того, проверки качества, изложенные в этой процедуре, всегда должны выполняться для обеспечения того, чтобы гиперактивность или другие стереотипные поведения не мешали количественной оценке когнитивных конечных точек.
EnvГлажение может также влиять на спонтанное исследовательское поведение грызунов. Запахи или звуки, которые не поддаются обнаружению у исследователей, могут притягивать или отталкивать мышей, искажая результаты когнитивных тестов, которые полагаются на спонтанное поведение. При первоначальном установлении Y-лабиринта или распознавании нового объекта важно выполнение контрольных мер для обеспечения отсутствия позиционных смещений при исследовании объектов и / или окружающей среды. Если наблюдаются позиционные отклонения, следователи должны тщательно исследовать окружающую среду и, возможно, отрегулировать освещение, размещение арены, расположение испытательной комнаты относительно других помещений на объекте ( т.е. не вблизи зоны интенсивного трафика или тяжелого оборудования) и процедур уборки арены.
Привыкание к среде тестирования является ключом к достижению оптимальной производительности в новом тесте распознавания объектов. Например, низкие общие сроки исследования могут быть вызваны неадекватным привыканием. В качестве альтернативы процессуМетоды, описанные здесь для обработки (раздел 2) и арена (раздел 4.2), привыкание к обработке и окружающая среда могут быть выполнены в виде 3, 5-минутных сеансов в день в течение двух последовательных дней.
Ограничения техники
Как и в любой процедуре, эти поведенческие тесты имеют ограничения. Эти процедуры были применены, потому что они проверяют функцию различных областей коры и гиппокампа. Если модель мыши не обнаруживает функционального дефицита в областях мозга, исследованных этими тестами, то эти методы не будут полезными. Более того, мы выбрали когнитивные тесты, которые исследуют кратковременную память. Если предполагается, что механизм действия соединения при доклинической оценке не влияет на кратковременную память, то эти процедуры должны быть соответствующим образом модифицированы ( т . Е. Увеличивать интервал фазы тестирования образца для проверки долговременной памяти). Наконец, эти тесты используют немотивированное поведение. Поэтому, если модель мышиГиперактивны или отображают другие стереотипные поведения, препятствующие исследованию окружающей среды, тогда эти процедуры могут быть не оптимальными. В качестве альтернативы можно использовать кондиционирование страха для Tg2576 или других моделей мышей β-амилоидоза или пространственного водного лабиринта для rTg4510 или других моделей мышей таупатии 3 .
Будущие приложения
После того, как эти процедуры были успешно приняты в лаборатории, могут быть сделаны несколько модификаций или расширений для оценки дополнительных когнитивных и функциональных двигательных мер. Например, изменение новой задачи распознавания объектов, чтобы определить, может ли мышь распознать изменение в размещении объекта 13 . В качестве альтернативы вместо использования объектов можно использовать других мышей и внедрить тест социального признания. Что касается сгибания конечностей и двигательной функции, можно было бы дополнить этот тест с помощью тестов на провисновение и / или сжатие проводов. ТестыПодробно описанные в этом методе, образуют прочную основу для скрининга соединений, которые обладают in vivo эффективностью в моделях трансляционной мыши для AD, и могут быть адаптированы или модифицированы многими способами, чтобы наилучшим образом опрашивать конкретную модель мыши или отвечать потребностям уникальной программы обнаружения лекарств ,
The authors have nothing to disclose.
У авторов нет подтверждений.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |