Beskriven här är ett stegvis beteende-screening-tillvägagångssätt som kan användas för att screena för föreningar som uppvisar in vivo- effektivitet på kognitiva och funktionella motoriska beteenden i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Dessa metoder optimeras för att skärma föreningar för aktivitet i kort- och arbetsminnesuppgifter.
Här beskriver vi ett iscensatt beteendestest som kan användas för att skärpa för föreningar som uppvisar in vivo- effekt på kognitiva och funktionella motoriska beteenden i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Paradigmet innefattar test för spontan växling i en Y-labyrint, ett nytt objektigenkänning, och extremitetskontroll. Dessa tester valdes eftersom de: 1) fråger funktionen av kognitiva eller motoriska domäner och den korrelerade neurala kretsen som är relevant för det mänskliga sjukdomsstaten, 2) har klart definierade ändpunkter, 3) har lätt implementerbara kontroller för kvalitetskontroll, 4) kan köras i Ett måttligt genomströmningsformat, och 5) kräver liten intervention av utredaren. Dessa metoder är utformade för utredare som söker skärmföreningar för aktivitet i kortvariga och arbetsminnesuppgifter eller funktionella motorbeteenden i samband med Alzheimers sjukdomsmusmodeller. De metoder som beskrivs här använder beteendestest som engÅldras ett antal olika hjärnregioner, inklusive hippocampus och olika kortikala områden. Undersökare som önskar kognitiva test som specifikt bedömer kognition som medieras av en enda hjärnregion kan använda dessa tekniker för att komplettera andra beteendestest.
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som leder till försvagande kognitiv minskning som påverkar cirka 44 miljoner människor världen över. För närvarande finns det inga tillgängliga behandlingar för AD som är sjukdomsmodifierande och betonar det akuta behovet av preklinisk upptäckt av nya terapeutiska strategier för denna sjukdom. Ett antal olika transgena musmodeller har skapats som rekapitulerar olika aspekter av AD 1 , 2 , inklusive underskott i kognitiva domäner störda hos patienter 3 . Dessa musmodeller representerar ett användbart verktyg för att underlätta effektiv screening in vivo .
Vid bedömning av en förening för potentiell in vivo- effektivitet måste ett stegvis tillvägagångssätt vidtas som skärmar för effektivitet i lämpliga kognitiva domäner och övervakar också beteenden som kan påverka de specifika slutpunkter som används för attSsess kognition. Många transgena musmodeller av AD uppvisar hyperaktivitet och andra beteenden som kan störa ett visst kognitivt test och förbjuda dess användning vid läkemedelsscreening 4 . För att ett tillvägagångssätt ska kunna genomföras i en läkemedelsscreeningsmiljö, bör de specifika test som används ha åtminstone en måttlig genomströmning, tydligt definierade ändpunkter och ett förfarande som kräver en minimal inblandning av utredarna. Genom att använda dessa kriterier kan beteendesskärmar implementeras som uppvisar reproducerbarhet, låg intra- och interanalysvariant och effektstorlekar som behövs för sammansatt screening. Detaljerad här är de metoder som vi har använt för att skärma för föreningar som är effektiva för att mildra de kognitiva och motoriska fenotyperna som finns närvarande i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati 5 , 6 . De beskrivna metoderna är anpassade från allmänt använda beteendeparadigma rapporterade i lIteratur 7 , med specifika optimeringar och kontroller av kvalitetskontroll så att de kan användas i transgena musmodeller som är relevanta för AD. Detta protokoll kan användas med en mängd olika datainsamlings- och analyssystem och förutsätter att utredaren har en fungerande kunskap om den tillhörande mjukvaran.
Teknikens betydelse med hänsyn till befintliga metoder
Denna procedur har utformats för att screena för in vivo- aktivitet av föreningar i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Det iscensatta sättet som används här säkerställer detektering av effektiva föreningar i kognitiva domäner som är relevanta för AD 3 . Vidare använder tillvägagångssättet som beskrivs här beteendetest som har tydliga definierade slutpunkter, lätt genomförbara kvalitetskontrollskontroller, kan köras i ett måttligt genomströmningsformat och kräver lite intervention från utredaren. Dessa egenskaper resulterar i analyser som uppvisar god reproducerbarhet hos djur och över kohorter, vilket resulterar i låga inter- och interanalysvarianter och effektstorlekar (2 < f <6) som är robusta nog för att stödja beteendemässig profilering i en läkemedelsforskningsmiljö.
Kritiska steg inom Protocol
Många musmodeller som används för AD-läkemedelsupptäckt uppvisar beteenden som överensstämmer med ökad ångest och aggression. Detta gör hanteringsvanan nödvändig för att utföra någon av de beteendestest som beskrivs här. Eftersom dessa test är beroende av omotiverade beteenden kan grovhantering av utredaren på grund av en hyperaktiv och ängslig eller aggressiv mus väsentligt påverka prestanda. Ökad ångest kan resultera i misslyckande att utföra uppgiften, vilket reducerar testets totala effekt. Dessutom är ljusnivåer i arenan nödvändiga för att underlätta den spontana rörelsen som behövs för varje test. Ljust ljus tenderar att öka ångest och undertrycka lokomotion hos gnagare, därför bör man ta hand om att justera omgivande ljusnivåer till 30-35 lux i arenan.
En annan viktig aspekt av förfarandet är att minimera starka miljöanpassningar som skulle störa ett djurs förmåga att utföra uppgifterna. Rengöring avArenor och föremål i mellan körningar är avgörande eftersom möss lockas till nya dofter i miljön. Underlåtenhet att noggrant rengöra arenan och föremål kan resultera i muskels spontana aktivitet och maskerande sant kognitiv prestanda. Undersökare bör också minimera användningen av personliga hygienprodukter och colognes / parfymer vid utförandet av dessa förfaranden. Slutligen uppvisar gnagare robusta dagliga och cirkadiska förändringar i många öppna uppträdanden 20 inklusive lärande och minne 21 . För att minimera variationen på grund av dagliga rytmer i basalt beteende och kognitiv prestanda, bör alla tester göras samtidigt vid hela kohorter och studier.
Vidare, specifikt med avseende på nya objektigenkänning, är fördröjningsintervallet mellan prov och testfas och val och placering av objekt i miljön kritiska parametrar. Minne finns i tre olika former: kort sikt memOry (STM), mellantidsminne (ITM) och långsiktigt minne (LTM) 22 , 23 . Ändring av intervallet mellan prov och testfaser från minuter (STM) till timmar (ITM) eller dagar (LTM) kommer att ändra den typ av minne som testas med proceduren 12 . Vidare, före körning av det nya objektigenkänningstestet, måste många föremål screenas i en testkohort av möss för potentiella biaser vid prospektering. Ett objekt som är överdrivet attraktivt eller repulsivt mot testkohorten kan inte användas vid bedömning av nytt objektigenkänning. Ideellt kommer alla objekt som kommer att användas i testet, när de placeras i en arena, framkalla lika undersökningstider från en naiv kohort av möss. Otillräcklig testning och optimering av objekt kan avsevärt minska kraften hos det nya objektigenkännet.
Ändringar och felsökning
Det finns flera faktorer som kan ökaUppenbar variation i de kognitiva testen som beskrivs här. Många musmodeller av AD uppvisar hyperdynamisk rörelse 3 som kan maskera eller ändra beteenden mätt som den kognitiva ändpunkten. Dessutom finns det växande bevis på att kön 24 , 25 , 26 och till och med moderns genotyp 27 kan påverka utvecklingen och utvecklingen av neuropatologi och kognitiva fenotyper i AD-musmodeller. Oväntad variabilitet eller underlåtenhet att genomföra en beteendomsuppgift kan bero på någon av dessa faktorer. Vid första genomförandet av ett visst beteendestest ska resultaten alltid stratifieras efter kön, ålder och i förekommande fall moderns genotyp. Vidare bör de kvalitetskontroller som beskrivs i denna procedur alltid utföras för att säkerställa att hyperaktivitet eller andra stereotypa beteenden inte stör kvantifiering av kognitiva ändpunkter.
envIronment kan också påverka gnagarnas spontana utforskande beteende. Dofter eller ljud som är odetekterbara för forskare kan locka eller avvisa möss, skevresultat från kognitiva tester som är beroende av spontan beteende. När man i början fastställer Y-labyrint eller ett nytt objektigenkänning är det viktigt att kontrollåtgärderna genomförs för att säkerställa att det inte finns några positionära förskjutningar vid utforskning av föremål och / eller miljö. Om positionella förspänningar observeras måste utredarna noggrant granska miljön och eventuellt justera belysning, arenaplacering, plats för provrummet i förhållande till andra rum i anläggningen ( dvs. inte nära ett högtrafikområde eller tung utrustning) och arena-rengöringsprocedurer.
Habituation till testmiljön är nyckeln till att uppnå optimal prestanda i det nya objektigenkänningstestet. Till exempel kan låga totala prospekteringstider bero på otillräcklig uppställning. Som ett alternativ till procUtgåvor som beskrivs här för hantering (avsnitt 2) och arenan (avsnitt 4.2), förflyttning till hantering och testmiljön kan utföras som 3, 5 min sessioner per dag i 2 på varandra följande dagar.
Begränsningar av tekniken
Precis som vid något förfarande har dessa beteendestest begränsningar. Dessa förfaranden har använts eftersom de testar funktionen hos olika kortikala regioner och hippocampus. Om musmodellen inte uppvisar funktionella underskott i hjärnregioner probed av dessa test, kommer dessa tekniker inte att vara användbara. Dessutom har vi valt kognitiva tester som sondar på kortsiktigt minne. Om föreningens verkningsmekanism under preklinisk bedömning inte förväntas påverka korttidsminnet, bör dessa procedurer modifieras i enlighet därmed ( dvs. ökning av provtestfasintervallet för att testa långsiktigt minne). Slutligen använder dessa test omotiverade beteenden. Därför, om en musmodell är excesSively hyperaktiv eller visar andra stereotypa beteenden som förhindrar prospektering av miljön, då dessa förfaranden kanske inte är optimala. Som ett alternativ kan man använda räddningskonditionering för Tg2576 eller andra p-amyloidosemusmodeller, eller den rumsliga vattendyran för rTg4510 eller andra musmodeller av tauopati 3 .
Framtida applikationer
När dessa förfaranden väl har antagits i laboratoriet kan flera ändringar eller förlängningar göras för att bedöma ytterligare kognitiva och funktionella motoråtgärder. Till exempel ändrar den nya objektigenkänningsuppgiften att bestämma om en mus kan känna igen en förändring i placeringen av ett objekt 13 . Alternativt kan man istället för att använda objekt använda andra möss och genomföra ett test av socialt erkännande. Med avseende på extremitetskontroll och motorfunktion kan man komplettera det testet med trådhänget och / eller gripstyrktesterna. TesternaDetaljerad i denna metod bildar en fast bas för att screena för föreningar som har in vivo- effektivitet i translationella musmodeller för AD och kan anpassas eller modifieras på många sätt för att bäst ifråga en viss musmodell eller tillgodose behoven hos ett unikt läkemedelsupptäcktsprogram .
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga bekräftelser.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |