Burada, β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bilişsel ve fonksiyonel motor davranışlarda in vivo etkinlik gösteren bileşiklerin taranması için kullanılabilen aşamalı, davranışsal tarama yaklaşımı anlatılmaktadır. Bu yöntemler, bileşikleri kısa süreli ve hafızadaki işlerde etkinlik açısından taramak için optimize edilmiştir.
Burada β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bilişsel ve fonksiyonel motor davranışlarda in vivo etkinlik gösteren bileşiklerin taranması için kullanılabilecek aşamalı, davranışsal test yaklaşımı anlatılmaktadır. Paradigma, bir Y-labirentindeki spontan değişim, yeni nesne tanıma ve kol uzantısı için testler içerir. Bu testler seçildi: 1) bilişsel veya motor alanların işlevini ve insan hastalık durumu ile ilgili korelasyon sinirsel devresini sorgularlar, 2) belirgin son noktaları vardır, 3) kolayca uygulanabilir kalite kontrol kontrollerine sahiptirler, 4) Ilımlı bir çıktı biçimi ve 5) araştırmacı tarafından küçük müdahale gerektirir. Bu yöntemler, bileşikleri kısa süreli ve çalışma belleği görevlerinde etkinlik açısından taramak isteyen araştırmacılar veya Alzheimer hastalığı fare modelleriyle ilişkili işlevsel motor davranışları için tasarlanmıştır. Burada açıklanan yöntemler, engHipokampus ve çeşitli korteks alanları içeren bir dizi farklı beyin bölgesi yaşı. Tek bir beyin bölgesi tarafından aracılık edilen biliş özel olarak değerlendiren kognitif testleri arayan araştırmacılar, diğer davranış testlerini tamamlamak için bu teknikleri kullanabilir.
Alzheimer hastalığı (AD), dünya çapında yaklaşık 44 milyon kişiyi etkileyen zayıflatıcı bilişsel gerileme ile sonuçlanan progressif nörodejeneratif bir hastalıktır. Şu anda hastalık düzeltici olan bu hastalık için yeni terapötik stratejilerin klinik öncesi keşfi için acil ihtiyaç olduğunu vurgulayan AD için mevcut herhangi bir tedavi mevcut değildir. Bilişsel alanlarda hastalarda bozulma açıkları da dahil olmak üzere, AD 1 , 2'nin çeşitli yönlerini tekrarlayan bir dizi farklı transgenik fare modeli oluşturulmuştur. Bu fare modelleri , in vivo etkin taramayı kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.
Bir bileşiğin potansiyel in vivo etkinlik açısından değerlendirilmesi sırasında, uygun bilişsel alanlarda etkinliklerin tarandığı ve ayrıca, uygun bilişsel alanlarda etkinliklerin gösterildiği aşamalardan oluşan bir yaklaşım uygulanmalıdır;Ssess biliş. Birçok transjenik fare AD modeli hiperaktivite ve belirli bir bilişsel testi etkileyebilecek ve uyuşturucu taramasında kullanımını yasaklayan diğer davranışları sergilemektedir4. Üstelik, bir uyuşturucu tarama ortamında uygulanacak bir yaklaşım için, kullanılan belirli testler, en azından ılımlı bir verim sağlamalı, açıkça tanımlanmış son noktaları olmalıdır ve araştırmacılar tarafından en az müdahale gerektiren bir prosedür olmalıdır. Bu kriterleri kullanarak, tekrarlanabilirlik, düşük intra-ve inter-assay varyansı ve bileşik tarama için gerekli efekt boyutlarını gösteren davranışsal ekranlar uygulanabilir. Ayrıntılı burada, β-amiloidoz ve tauopati 5,6'nın transjenik fare modellerinde mevcut kognitif ve motor fenotipleri azaltmada etkili bileşiklerin taranması için kullandığımız yöntemlerdir. Tanımlanan yöntemler, l'de bildirilen yaygın olarak kullanılan davranışsal paradigmadan uyarlanmaktadır.Iterasyon 7 , AD için alakalı transgenik fare modellerinde kullanılabilmesi için belirli optimizasyonlar ve kalite kontrol kontrolleri ile. Bu protokol, çeşitli veri toplama ve analiz sistemleri ile kullanılabilir ve araştırmacının ilgili yazılımla ilgili bir çalışma bilgisine sahip olduğunu varsayar.
Tekniğin Mevcut Metotlar Üzerindeki Önemi
Bu prosedür, β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bileşiklerin in vivo aktivitesi için tarama yapmak üzere tasarlanmıştır. Burada kullanılan kademeli yaklaşım, AD 3'le alakalı bilişsel alanlardaki etkili bileşiklerin saptanmasını sağlar. Ayrıca, burada ayrıntılı olarak açıklanan yaklaşım, açıkça tanımlanmış bitiş noktalarına, kolayca uygulanabilir kalite kontrol kontrollerine, daha ılımlı bir çıktı formatında yürütülebilecek ve araştırmacının az müdahalesine ihtiyaç duyan davranış testlerini kullanmaktadır. Bu özellikler, bir ilaç keşfi ortamında davranışsal profillemeyi destekleyecek kadar sağlam olan (2 ≤ f ≤6) düşük intra-ve inter-assay varyansı ve etki boyutları ile sonuçlanan, hayvanlarda ve kohortlar arasında iyi tekrarlanabilirlik sergileyen testlerle sonuçlanır.
Pr içinde Kritik Adımlarotocol
AD ilaç keşfi için kullanılan birçok fare modeli, artmış kaygı ve saldırganlıkla tutarlı davranış sergilemektedir. Bu, burada açıklanan davranış testlerinden herhangi birini yerine getirmek için taşıma alışkanlığını zorunlu kılar. Bu testler, hareketsiz davranışlara dayandığından, hiperaktivite ve endişe verici veya saldırgan bir fareden dolayı araştırmacı tarafından kaba bir şekilde kullanılması, performansı önemli ölçüde etkileyebilir. Yüksek endişe, görevin başarısız olmasına ve testin genel gücünün düşmesine neden olabilir. Dahası, arenadaki ışık seviyeleri, her test için gereken spontan hareketliliğin kolaylaştırılması için gereklidir. Parlak ışık kemirgenlerdeki endişeyi artırmaya ve lokomotif hareketleri bastırmaya eğilimli olduğundan, ortam ışığı seviyelerini arena'da 30-35 lux'e ayarlamaya özen gösterilmelidir.
Prosedürün bir diğer kritik yönü de, bir hayvanın görevleri yerine getirebilme yeteneğini etkileyecek güçlü çevresel ipuçlarını en aza indirgemektir. TemizlenmesiArena ve nesneler arasındaki nesneler, fareler çevreye özgü yeni kokulara çekildiğinden dolayı önemlidir. Arenayı ve nesneleri iyice temizlemekteki başarısızlık, farenin kendiliğinden hareket etmesini ve gerçek kognitif performansı maskeleyerek sonuçlanmasına neden olabilir. Araştırmacılar, bu prosedürleri gerçekleştirirken kişisel hijyen ürünlerini ve kolonyaları / parfümleri en aza indirgemelidir. Son olarak, kemiriciler, öğrenme ve hafıza da dahil olmak üzere birçok belirgin davranışlarda, günışığı ve sirkadiyen değişiklikler sergilemektedir21. Bu nedenle, bazal davranışlarda ve bilişsel performansta günlük ritimleri nedeniyle varyansı en aza indirgemek için tüm testler kohortlar ve çalışmalar boyunca günün aynı saatinde yapılmalıdır.
Ayrıca, özellikle yeni nesne tanıma ile ilgili olarak, numune ile test aşaması arasındaki gecikme aralığı ve nesnelerin çevreye yerleştirilmesi ve yerleştirilmesi kritik parametrelerdir. Bellek 3 farklı biçimde bulunur: kısa süreli memOry (STM), ara terim belleği (ITM) ve uzun süreli bellek (LTM) 22 , 23 . Örnek ve test aşamaları arasındaki süreyi dakikalar (STM) ila saat (ITM) veya günler (LTM) arasında değiştirmek, prosedür 12 tarafından test edilen bellek türünü değiştirecektir. Ayrıca, yeni nesne tanıma testini çalıştırmadan önce, birçok nesne, keşifte potansiyel önyargılar için farelerin bir test kohortunda taranmalıdır. Test kohortuna aşırı çekici veya itici olan bir nesne, yeni nesne tanımayı değerlendirirken kullanılamaz. İdeal olarak, testte kullanılacak tüm nesneler, bir arenaya yerleştirildiğinde, naif bir fareden çıkarılma zamanlarını ortaya çıkaracaktır. Nesnelerin yetersiz testi ve optimizasyonu yeni nesne tanıma gücünü önemli ölçüde azaltabilir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Artırabilir çeşitli faktörler vardır.Burada açıklanan bilişsel testlerde görünür değişkenlik. Birçok fare AD modelinde, hiperdinamik lokomotif 3 , bilişsel son nokta olarak ölçülen davranışları maskeleyebilir veya değiştirebilir. Dahası, cinsiyet 24 , 25 , 26 ve hatta maternal genotip 27'nin AD fare modellerinde nöropatoloji ve bilişsel fenotiplerin gelişimini ve ilerlemesini etkileyebileceğine dair artan kanıtlar vardır. Beklenmedik değişkenlik veya davranışsal bir görevi yerine getirmede başarısızlık, bu etkenlerden herhangi birine bağlı olabilir. Belirli bir davranış testini ilk uygularken, sonuçlar daima cinsiyet, yaş ve varsa annenin genotipine göre tabakalandırılmalıdır. Ayrıca, hiperaktivitenin veya diğer kalıplaşmış davranışların bilişsel son noktaların nicelenmesine müdahale etmemesini sağlamak için bu prosedürde belirtilen kalite kontrolleri daima yapılmalıdır.
envDemirbaş ayrıca kemirgenlerin kendiliğinden keşfedici davranışını da etkileyebilir. Araştırmacılar tarafından saptanamayan kokular veya sesler, spontan davranışlara dayanan kognitif testlerin sonuçlarını çarpıtarak fareleri çekebilir veya itebilir. Başlangıçta Y-labirentini veya yeni nesne tanımayı kurarken, nesne ve / veya çevreyi araştırmada herhangi bir konumsal önyargı bulunmadığından emin olmak için kontrol tedbirlerinin uygulanması şarttır. Konumsal önyargılar gözlemlenirse, araştırmacılar çevreyi iyice incelemek ve aydınlatma, arenada yerleştirme, test odasının tesis içindeki diğer odalara ( yani , yüksek trafik alanı veya ağır teçhizata yakın değil) göre arena temizleme prosedürlerini ayarlamaları potansiyel olarak ayarlamalıdır.
Test ortamına alışmak, yeni nesne tanıma testinde en iyi performansa ulaşmanın anahtarıdır. Örneğin, toplam arama sürelerinin düşük olması yetersiz alışkanlığa bağlı olabilir. Proc için bir alternatif olarakTaşıma (Bölüm 2) ve arena (Bölüm 4.2) alışkanlığı, kullanıma alışkanlık ve test ortamı için burada ana hatlarıyla belirtilen etütler, ard arda iki gün boyunca günde 3, 5 dakikalık seanslar halinde yapılabilir.
Teknik Sınırlamalar
Herhangi bir prosedürde olduğu gibi, bu davranış testlerinin de sınırlamaları vardır. Bu işlemler, çeşitli korteks bölgelerinin ve hipokampüsün fonksiyonlarını test ettikleri için uygulanmıştır. Fare modeli bu testlerle araştırılan beyin bölgelerinde işlevsel açıklar göstermezse, bu teknikler kullanışlı olmayacaktır. Dahası, kısa süreli belleği araştıran bilişsel testleri seçtik. Klinik öncesi değerlendirme altındaki bileşiğin etki mekanizmasının kısa süreli hafızayı etkilemesi beklenmiyorsa, bu prosedürler buna göre modifiye edilmelidir ( yani , uzun süreli hafızayı test etmek için numune test aşaması aralığını arttırmak). Son olarak, bu testler motivasyonsuz davranışlar kullanır. Bu nedenle, eğer bir fare modeli atılmışsaAşırı hiperaktif veya çevrenin araştırılmasını engelleyen kalıplaşmış davranışlar sergiliyorsa, bu işlemler en uygun olmayabilir. Alternatif olarak, Tg2576 veya diğer β-amiloidoz fare modelleri için korku koşullandırma, veya rTg4510 için uzaysal su labirenti veya tauopati 3'ün diğer fare modelleri için kullanılabilir.
Gelecekteki Uygulamalar
Bu prosedürler laboratuarda başarıyla benimsedikten sonra, ilave bilişsel ve fonksiyonel motor önlemleri değerlendirmek için çeşitli değişiklikler veya uzatmalar yapılabilir. Örneğin, bir fare nesnenin yerleştirilmesinde bir değişikliği tanıyıp tanımayacağını belirlemek için yeni nesne tanıma görevini değiştirme 13 . Alternatif olarak, nesneler kullanmak yerine, başka fareler kullanabilir ve sosyal tanıma testi uygulayabilir. Ekstremite kavrama ve motor fonksiyonu ile ilgili olarak, bu testi tel asması ve / veya kavrama gücü testleriyle tamamlayabilir. TestlerBu yöntemde ayrıntılı olarak AD için translasyonel fare modellerinde in vivo etkinliğe sahip olan bileşiklerin taranması için sağlam bir baz oluşturur ve belirli bir fare modelini en iyi araştırmak veya benzersiz bir ilaç keşfi programının ihtiyaçlarını karşılamak için pek çok yönde uyarlanabilir veya modifiye edilebilir .
The authors have nothing to disclose.
Yazarların onayları yok.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |