Oligopeptidkompetitionsanalys för fosforyleringsställningsbestämning
Summary
Peptidkonkurrensanalyser används ofta i ett flertal molekylära och immunologiska experiment. Detta papper beskriver en detaljerad metod för en in vitro oligopeptidkompetent kinasassay och de associerade valideringsförfarandena, som kan vara användbara för att hitta specifika fosforyleringsställen.
Abstract
Proteinfosforylering vid specifika ställen bestämmer dess konformation och interaktion med andra molekyler. Således påverkar proteinfosforylering biologiska funktioner och egenskaper hos cellen. För närvarande är den vanligaste metoden för att upptäcka fosforyleringsställen genom analys av vätskekromatografi / masspektrometri (LC / MS), en snabb och känslig metod. Relativt labila fosfatdelar frigörs emellertid ofta från fosfopeptider under fragmenteringssteget, vilket ofta ger falskt negativa signaler. I sådana fall skulle en traditionell in vitro- kinasassay med användning av ställningsriktade mutanter vara mer exakt, men denna metod är mödosam och tidskrävande. Därför kan en alternativ metod som använder peptidkonkurrens vara fördelaktig. Konsensusigenkänningsmotivet för 5'-adenosinmonofosfat-aktiverat proteinkinas (AMPK) har etablerats 1 och validerades med användning av ett positions-scanningpeptidbibliotek assAy 2 . Sålunda kan AMPK-fosforyleringsställen för ett nytt substrat förutspås och bekräftas genom peptidkonkurrensanalyserna. I denna rapport beskriver vi de detaljerade stegen och förfarandena för den in vitro oligopeptidkompetanta kinasassayen genom att illustrera AMPK-medierad kärnfaktor-erythroid 2-relaterad faktor 2 (Nrf2) fosforylering. För att autentisera fosforyleringsstället utförde vi en sekventiell in vitro- kinasassay med användning av en platsspecifik mutant. Sammantaget tillhandahåller peptidkonkurrensanalysen en metod för att screena flera potentiella fosforyleringsställen och för att identifiera ställen för validering av fosforyleringsställsmutanterna.
Introduction
Proteinfosforylering vid en specifik rest spelar en signifikant roll i ett brett spektrum av cellulära processer. Sålunda kräver en förståelse av signaleringsnät identifiering av specifika fosforyleringsställen. Dessutom bestämmer fosforyleringsstället effekten på proteinfunktionen eftersom enskilda domäner inom ett protein har olika strukturer och funktioner. Aktiviteten av kärnfaktor erythroid 2-relaterad faktor 2 (Nrf2), en nyckelantioxidant transkriptionsfaktor, regleras dubbelriktad genom fosforylering vid olika ställen. Våra studier har fokuserat på kinaser som katalyserar fosforyleringen av Nrf2. Spänningsresponsen hos Nrf2 mot oxidativ utmaning sker snabbt, huvudsakligen genom fosforylering vid serin 40 och medierad av proteinkinas C (PKC) -δ, vilket aktiverar Nrf2 3 , 4 . Omvänt katalyserar Fyn den inhiberande fosforyleringen av Nrf2 vid tyrosin 568 för snabb kontroll av aktiviteten 5 .
Den vanligaste metoden som används för att upptäcka fosforyleringsställen är analys av vätskekromatografi / masspektrometri (LC / MS). Snabb och mycket känslig fosforyleringsplats kartläggningsdata kan genereras på detta sätt; Det har dock flera tekniska begränsningar som ofta genererar falsk-negativa signaler. Dålig sekvensdäckning förekommer ofta i LC / MS-analys. För att identifiera fosforyleringsställen krävs information om den maximala aminosyrans täckning av ett protein 6 . Proteolys av proteinet av intresse med flera proteaser under digestionssteget kan vara till hjälp för att förbättra sekvensdäckningen. Ett annat hinder för identifieringen av fosforyleringsrester är den enkla förlusten av fosforsyra som ofta observeras för serin- och treonin-fosforylerade peptider 6 , 7 . Labila fosfatdelar är oftaFrisatt från fosfopeptider under fragmenteringsprocessen 7 . Det andra alternativet när man söker efter fosforyleringsställen använder en peptidmikroarray-metod. Det är möjligt att screena för kinasmål-ställena med användning av ett mikroarray-chip innehållande peptidfragment härledda från ett protein av intresse. På grund av utrustningskravet för produktion och detektering av ett mikroarraychip anses emellertid peptidmikroarraymetoden tidskrävande och dyr.
För att övervinna dessa utmaningar kan en in vitro oligopeptidkompetent kinasassay användas för ett proteinkinas med kända igenkänningsmotiv. Om konsensusidentifieringsmotivet för ett kinas är etablerat kan förmodade fosforyleringsställen för ett kandidatsubstrat förutses och äktheten hos sidorna kan valideras. Den mest övertygande metoden för denna procedur är att visa upphävandet av fosforylering i ett mutant protein i vilket prediktenD-återstoden är substituerad med en icke-fosforylerbar aminosyra ( dvs serin eller treonin till alanin, tyrosin till fenylalanin). Produktionen och isoleringen av mutanta proteiner är emellertid tidskrävande. Som ett alternativ vid den inledande fasen av forskningen är den kompetitiva peptidkinasanalysen enkel och bekväm. Här beskriver vi ett protokoll för en in vitro -peptidkonkurrensanalys och för validering av fosforyleringsstället.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som ett enkelt och bekvämt sätt att bedöma äktheten hos de förutspådda fosforyleringsställena medierade av AMPK beskriver vi här en in vitro- kinasanalys som kan användas för att upptäcka en specifik fosforyleringsplats med användning av konkurrerande peptider och för att verifiera den med hjälp av en sitsspecifik mutant . De representativa data som erhölls från den in vitro- kompetitiva AMPK-aktivitetsanalysen matchade resultaten från en analys med användning av ett platsriktat mutan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea bidrag som finansierades av den koreanska regeringen (MSIP) (nr 2015R1A2A1A10052663 och nr 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
