Summary
Конкурентные тесты пептидов широко используются в различных молекулярных и иммунологических экспериментах. В этом документе описывается подробный метод анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ и соответствующие процедуры валидации, которые могут быть полезны для поиска специфических сайтов фосфорилирования.
Abstract
Фосфорилирование белков в определенных местах определяет его конформацию и взаимодействие с другими молекулами. Таким образом, фосфорилирование белка влияет на биологические функции и характеристики клетки. В настоящее время наиболее распространенным методом обнаружения сайтов фосфорилирования является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС), быстрый и чувствительный метод. Однако относительно лабильные фосфатные фрагменты часто высвобождаются из фосфопептидов во время стадии фрагментации, что часто приводит к ложноотрицательным сигналам. В таких случаях традиционный анализ киназы in vitro с использованием сайт-направленных мутантов был бы более точным, но этот метод является трудоемким и трудоемким. Поэтому альтернативный способ с использованием пептидной конкуренции может быть предпочтительным. Установлен мотив консенсусного распознавания 5'-аденозинмонофосфат-активированной протеинкиназы (AMPK) 1 и он был подтвержден с помощью библиотеки позиционного сканирующего пептида assAy 2 . Таким образом, сайты фосфорилирования AMPK для нового субстрата могут быть предсказаны и подтверждены с помощью конкурентного анализа пептидов. В этом отчете мы описываем подробные этапы и процедуры анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ, иллюстрируя AMPK-опосредованное фосфорилирование эритроидного фактора 2 (Nrf2), связанного с эритроидным фактором фактора II. Для аутентификации сайта фосфорилирования мы проводили последовательный анализ киназы in vitro с использованием сайт-специфического мутанта. В целом, конкурентный анализ пептидов дает способ скрининга нескольких потенциальных сайтов фосфорилирования и идентификации сайтов для валидации с помощью мутантов сайта фосфорилирования.
Introduction
Фосфорилирование белка у конкретного остатка играет значительную роль в широком диапазоне клеточных процессов. Таким образом, понимание сигнальных сетей требует идентификации конкретных сайтов фосфорилирования. Кроме того, сайт фосфорилирования определяет влияние на функцию белка, поскольку отдельные домены в пределах белка обладают различными структурами и функциями. Активность фактора фактора 2 эритроидного фактора 2 (Nrf2) ядерного фактора, ключевого антиоксидантного транскрипционного фактора, регулируется двунаправленным образом посредством фосфорилирования в разных местах. Наши исследования были сосредоточены на киназах, которые катализируют фосфорилирование Nrf2. Реакция стресса Nrf2 против окислительного заражения происходит быстро, главным образом за счет фосфорилирования на серине 40 и опосредованного протеинкиназой C (PKC) -δ, которая активирует Nrf2 3,4 . Напротив, Fyn катализирует тормозное фосфорилирование Nrf2 при тирозине 568 для строгого контроля за деятельностью 5 .
Наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения сайтов фосфорилирования, является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС). Быстрые и высокочувствительные данные картирования сайта фосфорилирования могут быть получены таким образом; Однако он имеет несколько технических ограничений, часто генерирующих ложноотрицательные сигналы. Плохое покрытие последовательностей часто происходит при анализе ЖХ / МС. Для идентификации сайтов фосфорилирования требуется информация о максимальном покрытии белками аминокислот 6 . Протеолиз белка, представляющего интерес, с несколькими протеазами во время стадии пищеварения может помочь в улучшении охвата последовательностей. Другим препятствием для идентификации остатков фосфорилирования является легкая потеря фосфорной кислоты, которая часто наблюдается для сериновых и треонинфосфорилированных пептидов 6 , 7 . Лабильные фосфатные группы частоВысвобождается из фосфопептидов в процессе фрагментации 7 . Второй вариант при поиске сайтов фосфорилирования заключается в использовании пептидного микроматричного метода. Возможно проводить скрининг на целевые сайты киназ с использованием чипа микрочипов, содержащего пептидные фрагменты, полученные из представляющего интерес белка. Однако из-за требований к оборудованию для производства и обнаружения микрочипов, метод пептидных микроматриц считается отнимающим много времени и дорогостоящим.
Для преодоления этих трудностей для протеинкиназы с известными мотивами распознавания может быть использован анализ in vitro -конкурирующих киназ in vitro . Если устанавливается мотив консенсусного распознавания киназы, предполагаемые сайты фосфорилирования субстрата-кандидата могут быть предсказаны, и аутентичность сайтов может быть подтверждена. Наиболее убедительным методом для этой процедуры является показать отмену фосфорилирования в мутантном белке, в котором предикатD остаток замещен нефосфорилируемой аминокислотой ( т.е. серин или треонин-аланин, тирозин-фенилаланин). Однако производство и выделение мутантных белков требует много времени. В качестве альтернативы на начальном этапе исследования конкурентный тест пептид-киназы является простым и удобным. Здесь мы опишем протокол для конкурентного анализа пептида in vitro и для проверки сайта фосфорилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Безопасность
ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует [γ- 32 P] -ATP для оценки активности AMPK. Фосфор-32 является радиоактивным изотопом, в значительной степени испускающим бета-излучение. Поскольку размер бета-частицы чрезвычайно мал, он может легко проникать сквозь одежду и кожу. Как внешнее, так и внутреннее воздействие бета-излучения может нанести вред здоровью человека, в том числе вызвать ожоги кожи и повреждение тканей.
- Выполните все шаги, которые требуют использования [γ- 32 P] -ATP, используя надлежащую защиту, такую как акриловое экранирование.
- Убедитесь, что весь персонал оснащен электронными персональными дозиметрами (EPD) для контроля степени воздействия вредного излучения во время всех процедур.
- Обрабатывать излучение с открытым источником только после соответствующей подготовки и одобрения регулирующих органов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь все эксперименты проводились после завершения обучения по использованию излучения с открытым источником в Сеульском национальном университетеИ одобрение правительства Кореи (nssc.go.kr/nssc/en). - Утилизировать радиоактивные отходы согласно местным правилам.
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь были использованы директивы Института охраны окружающей среды и безопасности Сеульского национального университета. Ниже приводится список регулирующих органов в Соединенных Штатах и европейских странах: Соединенные Штаты Америки, Комиссия по ядерному регулированию США (http://www.nrc.gov/); Соединенное Королевство, Исполнительный директор по вопросам здравоохранения и безопасности (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Франция, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); И Германии, Федеральное министерство окружающей среды, охраны природы, строительства и ядерной безопасности (BMU) (http://www.bmu.de).
2. Анализ конкурентных киназ in vitro
- Конструирование конкурирующих пептидов
- Определите консенсусный мотив, фосфорилированный AMPK.
ПРИМЕЧАНИЕ. AMPK распознает мотив консенсуса, & amp;# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. В консенсусной последовательности Φ представляет гидрофобные аминокислоты ( т.е. валин [V], лейцин [L], метионин [M] и изолейцин [I]) и β представляет собой основные аминокислоты ( т.е. лизин [K], аргинин [ R] и гистидин [H]) 1 . - Выбирают остатки серина или треонина из последовательностей-мишеней в соответствии с вышеприведенным консенсусным мотивом. Используйте три предполагаемых участка Nrf2 человека (№ 1, 148-157, содержащий Ser153, №2, 330-339, содержащий Ser335, и №3, 553-562, содержащий Ser558) 8 .
- Коммерчески синтезируют 10-остаточные пептиды, которые имитируют предполагаемые сайты. Получают синтезированный продукт в виде лиофилизированного порошка с чистотой более 98% для каждого пептида.
- Растворяют пептиды, используя киназный буфер, чтобы достичь концентрации 71,667 г / л. Если пептид не растворим в киназном буфере, растворите его в 20% ДМСО. Если он остается нерастворимым, пептид, имитирующий путСайт может быть расширен для повышения растворимости.
- Определите консенсусный мотив, фосфорилированный AMPK.
- Анализ in vitro конкурентной AMPK киназы
- Готовят 5 × киназный буфер следующим образом: 100 мМ HEPES, pH 7,4; 25 мМ MgCl 2 ; 5 мМ EGTA; 5 мМ DTT; 125 мМ β-глицерофосфат (ингибитор серин / треониновая фосфатаза); 5 мМ Na 3 VO 4 (ингибитор тирозинфосфатазы); 0,5% (об. / Об.) Коктейль-набор ингибиторов протеазы III, 1 мМ холодного АТФ; И 500 мкМ АМФ.
ПРИМЕЧАНИЕ. AMP является важным компонентом киназного буфера для тестирования активности AMPK. Буфер можно использовать для измерения активности как серин / треонинкиназ, так и тирозинкиназ. - Оттепель следующие рекомбинантного белка и синтетических пептидов на льду: AMPK; Nrf2; И олигопептиды # 1, # 2 и # 3.
- Готовят реакционный буфер на льду: 0,15 мкг AMPK, 0,4 мкг Nrf2 (~ 4 пмоль), 0,43 мг олигопептида (~ 300 нмоль) и 6 мкл 5 × киназного буфера.Доводят конечный объем до 30 мкл стерильной дистиллированной водой (DW).
ПРИМЕЧАНИЕ. Добавление [γ- 32 P] -ATP после приготовления реакционного буфера может привести к уменьшению радиоактивного сигнала вследствие аутофосфорилирования киназы.
- Готовят 5 × киназный буфер следующим образом: 100 мМ HEPES, pH 7,4; 25 мМ MgCl 2 ; 5 мМ EGTA; 5 мМ DTT; 125 мМ β-глицерофосфат (ингибитор серин / треониновая фосфатаза); 5 мМ Na 3 VO 4 (ингибитор тирозинфосфатазы); 0,5% (об. / Об.) Коктейль-набор ингибиторов протеазы III, 1 мМ холодного АТФ; И 500 мкМ АМФ.
- Запуск реактивов
ПРИМЕЧАНИЕ. Все нижеописанные процессы должны выполняться под защитой с помощью акрилового экрана, стойки или блока, а также соответствующих средств индивидуальной защиты.- Перед началом эксперимента установите нагревательные блоки на 30 ° C.
- Добавить 1 мкл [γ- 32 P] -ATP (1 мкКи) в реакционные пробирки на льду. Смешайте реакционный буфер, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: радиоактивность 32 P имеет короткий период полураспада приблизительно 14 дней 9 . Отрегулируйте объем, рассмотрев период полураспада ( например, через месяц после производства [γ- 32 P] -ATP, добавьте 4 мкл [γ- 32 P]-ATP, чтобы получить 1 мкКи). - Инкубируйте образец в нагревательном блоке при 30 ° С в течение 15-30 мин. Во время этой стадии готовят 7,5% геля для электрофореза в геле додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE). Отрегулируйте процент геля в соответствии с размером целевого белка.
- Остановите реакцию киназы, добавив 3 мкл 10 × SDS образца буфера (10% (об. / Об.) Глицерина, 20% (мас. / Об.) SDS, 15,42% (мас. / Об.) Дитиотреитола, 90% (об. / Об.) 0,5 M трис-HCl (pH 6,8) и 0,02% (мас. / Об.) Бромфенолового синего). Смешайте реакционный буфер, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
- Прогоните образцы в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и непрерывно при 140 В в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Синяя линия бромфенола на конце геля содержит чрезвычайно высокие радиоактивные сигналы. Рекомендуется удалить гель ниже синей линии, прежде чем перейти к следующему этапу для уменьшения фоновых сигналов. - После SDS-PAGE аккуратно удалите гель из литейщика. Поместите гель в стакан tUbe для следующего шага.
- Закрепите гель с помощью фиксирующего буфера в течение 20 мин (50% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты).
- Аккуратно переместите гель на фильтровальную бумагу и накройте его прозрачной оберткой. Обратите внимание, что гель можно легко разорвать на этом этапе. Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 часа.
- Визуализация
- Выставляют гель либо на фосфорном экране, либо на рентгеновской пленке в течение ночи (обычно в течение примерно 16 часов).
ПРИМЕЧАНИЕ. Фосфорный экран можно использовать повторно после воздействия яркого света. Когда используется рентгеновская пленка, разоблачите гель в течение двух дней. Рентгеновские пленки обладают меньшей чувствительностью, чем люминофорные экраны. - Сканируйте люминофор с помощью люминофора. Экспортируйте изображение в формате TIFF или растровом файле с высоким разрешением.
- После визуализации переместите гель в стеклянный или пластиковый контейнер для окраски Кумасси бриллиантово-синим (CBB).
- Промойте гель DW. Отбросьте DW и окрасьтеГ с окрашивающим реагентом в течение 1 часа.
- Отменить реагент и гель с DW в течение 1 часа или на ночь. Поместите гель между прозрачными пластиковыми пленками (или аналогичными) для сканирования с помощью офисного сканера.
- Выставляют гель либо на фосфорном экране, либо на рентгеновской пленке в течение ночи (обычно в течение примерно 16 часов).
3. Анализ in vitro киназы с использованием мутанта, специфичного для участка
- Сайт-направленный мутагенез pGEX-Nrf2
- Мутагенная грунтовка
ПРИМЕЧАНИЕ. Разработка правильных мутагенных праймеров имеет решающее значение для успешного результата мутагенеза. Ниже приведены некоторые соображения для проектирования мутагенных праймеров. Создайте праймер, состоящий из 25-45 оснований, с желаемой мутацией в середине праймера. Праймер должен иметь 40-60% GC содержания и заканчиваться одним или несколькими основаниями G или C. Убедитесь, что T m праймера равен 78 ° C или выше в соответствии с формулой [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / длина оснований) - несоответствие%].
ПРИМЕЧАНИЕ. ОчиститеПотому что его чистота важна для эффективности мутаций. Существует несколько сайтов для проектирования мутагенных праймеров.- Откройте программу проектирования грунтовки для «конструирования праймеров для сайт-направленного мутагенеза» (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Вставьте последовательность ДНК человека Nrf2 (№ доступа NM_006164.4) и нажмите кнопку «загрузить переведенный».
- Выберите остаток серина 558 из переведенной аминокислотной последовательности, который следует заменить на аланин. Используя мутагенный праймер, замените кодон серина от agc до gcc, для аланина.
- Рассмотрим длину праймера, T m и содержание GC.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мутагенный праймер окончательно сконструирован как 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Реакция для синтеза мутантных стренг с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Готовят реакционную смесь ПЦР на льду: 10 × реакционный буфер, 50 нгPGEX-GST-Nrf2, 125 нг прямого праймера, 125 нг обратного праймера, 1 мкл смеси dNTP (10 мМ каждая), 2,5 U ДНК-полимеразы Pfu и стерильная DW до 50 мкл.
- Проведите ПЦР для синтеза pGEX-GST-Nrf2-мутантной цепи со следующей программой циклирования: 1 цикл при 95 ° C в течение 30 секунд; 18 циклов при 95 ° С в течение 30 с, при 55 ° С в течение 1 мин и при 68 ° С в течение 90 с; И 1 цикл при 68 ° С в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от длины плазмиды параметры цикла могут быть изменены. - Поместите его на лед в течение 2 минут, чтобы охладить реагенты для следующего шага. Альтернативно, храните их при 4 ° C в течение ночи.
- Расщепление Dpn I и выбор мутантной плазмиды
- Добавьте 1 мкл рестриктазы Dpn I (10 Ед / мкл) в каждый из реагентов после охлаждения. Тщательно и осторожно перемешать пипеткой и центрифугой в течение 1 мин.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 2 часов, чтобы переварить родительский pGEX-GST-Nrf2,Многоцепочечная ДНК.
- Аккуратно оттаивайте DH5 α суперкомпетентные клетки на льду.
- Добавить 50 мкл реагента в 150 мкл предварительно охлажденных DH5 α суперкомпетентных клеток и инкубировать на льду в течение по меньшей мере 30 мин.
- Перенесите пробирки в нагревательный блок, предварительно нагретый до 42 ° C, и оставьте их на 90 секунд. Поместите их на лед на 2 мин.
- Добавить предварительно разогретый бульон лизогении (LB) в трансформированные клетки DH5α и инкубировать при 37 ° C в течение 1 часа при встряхивании со скоростью 180 об / мин.
- Распространить трансформированные клетки на чашки с агаром LB-ампициллина и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ампициллин используют для селекции, поскольку плазмида GEX-GST-Nrf2 имеет маркер устойчивости к ампициллину. Используйте соответствующие антибиотики, в зависимости от маркера устойчивости мутагенной плазмиды. - Выбирают одну колонию из пластинки, переносят ее в 5 мл LB-ампициллина и инкубируют в течение ночи при 37 ° С при встряхивании со скоростью 180 об / мин.Для проверки мутагенной последовательности оценивайте по крайней мере три колонии.
- Извлечение ДНК с использованием набора Miniprep DNA для анализа последовательности ДНК; Следуйте протоколу изготовителя.
- Проверьте мутагенные последовательности ДНК с использованием автоматического анализатора последовательности ДНК в соответствии с протоколом производителя. Используйте по крайней мере 200 нг ДНК-конструкции для проверки мутантных последовательностей.
- Мутагенная грунтовка
- Очистка рекомбинантного белка GST-Nrf2
- Экспрессия мутагенного слитого белка GST- Nrf2 в Escherichia coli
- Трансформируют мутагенную плазмиду pGEX-GST-Nrf2 в клетки BL21 . Прививают одну колонию в 25 мл бульона LB, содержащего ампициллин (100 мкг / мл), и инкубируют при 37 ° С на ротаторе в течение ночи.
- Прививают культивируемые клетки в 100 мл LB-бульона, содержащего ампициллин (100 мкг / мл), при отношении разведения 1: 100.
- Инкубировать при 37 ° С на вращающемсяИли до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 0,4-0,8 (приблизительно 4 ч).
- Добавить 100 мкл 1 М IPTG в 100 мл культивируемых клеток для получения конечной концентрации 1 мМ IPTG.
- Инкубируйте клетки при 30 ° С на ротаторе в течение 6 ч или в течение ночи для экспрессии белка.
- Центрифуга клеток в 5000 мкг в течение 20 мин и ресуспендирования клеточных гранул с 1 мл бактериального лизиса буфера (25 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT, 0,1% CHAPS, 1 мкг / мл пепстатина, 0,5 мкг / мл лейпептина, И 1 мМ PMSF) на льду.
- Лизят гранулы клеток, используя ультразвуковой гомогенизатор с 2-секундными интервалами в течение 2 мин при 50% максимальной выходной мощности.
- Центрифугируют клетки при 12000 g в течение 15 мин при 4 o C и собирают супернатант.
- Очистка рекомбинантного белка GST-Nrf2
- Подготавливают 200 мкл 50% (об. / Об.) Глутатион-агарозных шариков и промывают 1 мл PBS (pH 7,3, 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 4 и 1,8 мМ KH 2 PO 4 ). Соберите шарики центрифугированием при 500 × g в течение 1 мин. Повторите промывку три раза.
- Клеточный лизат добавляют к подготовленным 200 мкл 50% (об. / Об.) Глутатион-агарозных шариков и инкубируют при 4 ° С на вращающемся концевом ротаторе в течение 2 часов.
- Соберите шарики глутатион-агарозы в сочетании с белком GST-Nrf2 центрифугированием при 500 xg в течение 1 мин. Удалите супернатант, используя 1 мл шприц с иглой 31 G.
- Промывают шарики 1 мл PBS (pH 7,3), как на стадии 1.
- Добавить 500 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис-HCl и 10 мМ восстановленного глутатиона, рН 8,0) в гранулы глутатион-агарозы в сочетании с GST-Nrf2. Инкубируйте при температуре 4 ° C на вращающемся концевом ротаторе в течение 30 мин.
- Центрифуга на 500 xg в течение 1 мин и собирать супернатант.
- Снова добавьте 300 мкл буфера для элюции в шарики и повторите шаги 3.2.2.5-3.2.2.6 два раза.
- Подтверждение очищенного белка GST-Nrf2
- Подготовьте 5 мкл образца для визуализации количества белка с 0,5 мкг стандартного белка BSA.
- Прогоните образцы в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и затем при 140 В в течение 60 мин.
- Окрашивают гель 0,1% CBB-окрашивающим раствором (0,1 г CBB R250, 40 мл 99% метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл перегонки H 2 O) в течение 2 ч и направляют (30 мл метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока полосы не будут четко показаны.
- Поместите десертный гель на фильтровальную бумагу и накройте прозрачной оберткой. Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 часа.
- Определите количество мутантного белка GST-Nrf2 с денситометрией для анализа киназы in vitro AMPK.
- Экспрессия мутагенного слитого белка GST- Nrf2 в Escherichia coli
- Анализ активности АМФК in vitro с использованием мутанта, специфичного для участка
НЕE: Анализ киназы in vitro AMPK осуществляют в соответствии с этапами 2.2-2.4 с использованием 0,4 мкг очищенного GST-Nrf2 дикого типа или мутанта GST-Nrf2-S558A без ингибиторов пептида. Следуйте всем рекомендациям по радиационной безопасности, описанным в шаге 1.- Готовят реакционный буфер на льду с 0,15 мкг AMPK, 0,4 мкг мутантного или дикого типа GST-Nrf2 и 6 мкл 5 киназного буфера. Заполните до 30 мкл стерильной ДГ.
- Добавить 1 мкл [γ- 32 P] -ATP (1 мкКи / мкл) в реакционные пробирки на льду. Смешайте реакционный буфер путем пипетирования вверх и вниз несколько раз и центрифуги.
- Инкубируйте образцы в нагревательном блоке при 30 ° С в течение 30 мин.
- Остановите реакцию киназы, добавив 3 мкл 10 × SDS образца буфера.
- Прогонят в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и затем при 140 В в течение 1 часа.
- Закрепите гель с помощью фиксационного буфера в течение 20 минут, переместите его на фильтровальную бумагу и накройте гелем прозрачнымEnt wrapper.
- Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 ч, а затем подвергают ее воздействию на ночь либо на люминофорном экране, либо на рентгеновской пленке.
- Сканируйте люминофор с помощью люминофора и переместите гель в стеклянную трубку для окрашивания CBB после визуализации в соответствии с шагом 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 и Рисунок 2 демонстрируют результаты повторных экспериментов в ранее опубликованной статье 8 . Три различных олигопептида с 10 остатками, имитирующие предполагаемые сайты-мишени AMPK (№ 1, 148-157, включающие Ser153, №2, 330-339, содержащие Ser335, и №3, 553-562, содержащие Ser558), были синтезированы и использованы в качестве конкурентов в Vitro киназы. Фосфорилирование Nrf2 с помощью AMPK значительно уменьшалось в присутствии олигопептида №3 ( фиг.1 ). Затем проводили анализ сайт-направленного мутагенеза для подтверждения результата пептидомиметического эксперимента. Учитывая тормозящее действие олигопептида 3 на AMPK-опосредованное фосфорилирование Nrf2 ( фиг. 1 ), мы создали мутант S558A-Nrf2. Уровни фосфорилирования сравнивали между диким типом Nrf2 и S558A, используя анализ киназы in vitro AMPK. Единственное замещение аминокислоты Nrf2 (Ser → Ala при 558) предотвратило AMPK от фосфорилирования Nrf2, что указывает на то, что AMPK непосредственно фосфорилирует Nrf2 в Ser558 ( рисунок 2 ).
Рисунок 1: In vitro конкурентный анализ киназы AMPK. Анализы киназы in vitro проводили в присутствии указанных олигопептидов (№ 1, 148-157, включающих Ser153, №2, 330-339, содержащие Ser335, и №3, 553-562, включающие Ser558).
Рисунок 2: Анализ киназы in vitro AMPK с использованием сайт-специфического мутантного белка. Анализы киназы in vitro проводили в присутствии дистиллированной водыYpe GST-Nrf2 или его мутанта S558A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В качестве простого и удобного способа оценки достоверности предсказанных сайтов фосфорилирования, опосредованных AMPK, здесь мы описываем киназный анализ in vitro , который может быть использован для обнаружения конкретного участка фосфорилирования с использованием конкурентных пептидов и для его проверки с использованием сайт-специфического мутанта , Репрезентативные данные, полученные в конкурентном анализе активности AMPK in vitro, соответствовали результатам анализа с использованием сайта-направленного мутантного белка, что указывает на то, что конкурентный анализ пептида является полезным инструментом для определения сайта фосфорилирования. Этот метод также использовался в исследовании, идентифицировавшем специфический сайт, фосфорилированный PKCδ, который фосфорилирует Nrf2 по серину 40 3 . Поскольку пептиды конкурентно связываются с белком, этот принцип может также применяться к анализу выведения GST in vitro для идентификации связывающего мотива 10 , 11 . Более того, этот пептидомимТакже может быть применим для идентификации других посттрансляционных модификаций, таких как ацетилирование в остатках лизина.
Используя этот протокол, может быть трудно растворить некоторые гидрофобные пептиды. Если пептид нерастворим в киназном буфере, то его растворение в 20% ДМСО может оказаться полезным. Чтобы растворить чрезвычайно гидрофобные пептиды, сначала попытайтесь растворить его в 100% ДМСО, а затем разбавьте раствор киназным буфером. Ультразвуковая обработка может также помочь в растворении пептидов. Если он остается нерастворимым, пептид, имитирующий предполагаемый сайт, должен быть расширен для увеличения растворимости.
Протокол, представленный в этой статье, описывает «систему in vitro », в которой реагируют очищенная киназа и субстрат. В системе in vitro небольшие различия в концентрации конкурентных пептидов не будут влиять на результаты, если концентрация ниже, чем субстратный белок. ГПолученная из эксперимента in vitro, включает в себя неотъемлемую возможность стать артефактуальным событием, вызванным искусственной близостью и высокой концентрацией реагентов. Чтобы устранить эту перспективу, интерпретация данных должна сопровождаться результатами клеточных экспериментов. Другая возможность получения ложноположительных результатов с использованием пептидов может быть связана с изменениями конформации субстрата и / или распознавания киназы. Чтобы исключить эту возможность, необходимо провести эксперименты с мутантными белками.
С другой стороны, ложноотрицательные данные также могут быть получены из этой системы. Многие киназы действуют как белковые комплексы в клеточном контексте и требуют кофакторов для полной функциональности. AMPK представляет собой репрезентативный протеинкиназный комплекс, состоящий из субъединиц AMPKα, AMPKβ и AMPKγ, и связывание AMP с субъединицей AMPKγ необходимо для активации киназы. Действительно, AMPKНе фосфорилируют Nrf2 в свободном от AMP киназном буфере (данные не показаны). Таким образом, следует отметить, что AMP должен быть растворен в буфере для киназной реакции для успешного анализа in vitro .
Использование масс-спектрометрии для идентификации участков фосфорилирования, самого популярного метода, имеет несколько технических ограничений, часто генерирующих ложноотрицательные сигналы за счет легкой потери фосфорной кислоты в процессе фрагментации 7 . Метод пептидных микрочипов может быть вторым вариантом для поиска сайтов фосфорилирования. Однако этот способ считается трудоемким и дорогостоящим. В качестве альтернативного метода скрининга предполагаемых сайтов фосфорилирования конкурирующий пептидный метод может быть удобным и недорогим способом получить представление о природе предполагаемого сайта фосфорилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемым правительством Кореи (MSIP) (№ 2015R1A2A1A10052663 и № 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F.
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
