Summary
Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.
Abstract
Die Proteinphosphorylierung an bestimmten Stellen bestimmt ihre Konformation und Interaktion mit anderen Molekülen. So beeinflusst die Proteinphosphorylierung biologische Funktionen und Eigenschaften der Zelle. Derzeit ist die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse, ein schnelles und empfindliches Verfahren. Allerdings werden relativ labilile Phosphatreste oft aus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsschrittes freigesetzt, was oft falsch-negative Signale ergibt. In solchen Fällen wäre ein herkömmlicher in vitro -Kinase-Assay unter Verwendung von ortsgerichteten Mutanten genauer, aber diese Methode ist mühsam und zeitaufwändig. Daher kann ein alternatives Verfahren unter Verwendung von Peptidwettbewerb vorteilhaft sein. Das Konsensuserkennungsmotiv der 5'-Adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) wurde 1 etabliert und wurde unter Verwendung eines Positions-Scanning-Peptid-Bibliotheks-Asss validiertAy 2 Somit könnten AMPK-Phosphorylierungsstellen für ein neuartiges Substrat vorhergesagt und durch die Peptidwettbewerbsassays bestätigt werden. In diesem Bericht beschreiben wir die detaillierten Schritte und Verfahren für den in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay durch die Veranschaulichung der AMPK-vermittelten Kernfaktor-Erythroid-2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) -Phosphorylierung. Um die Phosphorylierungsstelle zu authentifizieren, führten wir einen sequentiellen In-vitro -Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante durch. Insgesamt liefert der Peptid-Konkurrenz-Assay ein Verfahren zum Screening mehrerer potentieller Phosphorylierungsstellen und zur Identifizierung von Stellen für die Validierung durch die Phosphorylierungsstellen-Mutanten.
Introduction
Die Proteinphosphorylierung an einem spezifischen Rückstand spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum zellulärer Prozesse. Somit erfordert ein Verständnis von Signalisierungsnetzwerken die Identifizierung spezifischer Phosphorylierungsstellen. Darüber hinaus bestimmt die Phosphorylierungsstelle die Wirkung auf die Proteinfunktion, da einzelne Domänen innerhalb eines Proteins unterschiedliche Strukturen und Funktionen besitzen. Die Aktivität des Kernfaktor-Erythroid-2-Faktors 2 (Nrf2), ein wichtiger Antioxidans-Transkriptionsfaktor, wird durch Phosphorylierung an verschiedenen Stellen bidirektional reguliert. Unsere Studien konzentrierten sich auf die Kinasen, die die Phosphorylierung von Nrf2 katalysieren. Die Stressreaktion von Nrf2 gegen oxidative Herausforderung erfolgt rasch, vor allem durch Phosphorylierung am Serin 40 und vermittelt durch die Proteinkinase C (PKC) -δ, die Nrf2 3 , 4 aktiviert. Umgekehrt katalysiert Fyn die hemmende Phosphorylierung von Nrf2 bei Tyrosin 568 zur engen Kontrolle der Aktivität 5 .
Die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen ist die Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse. Auf diese Weise können schnelle und hochempfindliche Phosphorylierungsstellen-Mapping-Daten erzeugt werden. Allerdings hat es mehrere technische Einschränkungen, die oft falsch-negative Signale erzeugen. Schlechte Sequenzabdeckung tritt häufig in der LC / MS-Analyse auf. Um Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, sind Informationen über die maximale Aminosäureabdeckung eines Proteins erforderlich 6 . Die Proteolyse des Proteins von Interesse mit mehreren Proteasen während des Verdauungsschrittes kann bei der Verbesserung der Sequenzabdeckung hilfreich sein. Ein weiteres Hindernis für die Identifizierung von Phosphorylierungsrückständen ist der leichte Verlust an Phosphorsäure, der häufig für Serin- und Threonin-phosphorylierte Peptide 6 , 7 beobachtet wird . Labile Phosphatreste sind oftAus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsprozesses freigesetzt 7 . Die zweite Option bei der Suche nach Phosphorylierungsstellen ist die Verwendung eines Peptid-Mikroarray-Verfahrens. Es ist möglich, die Kinase-Zielstellen unter Verwendung eines Mikroarray-Chips, der Peptidfragmente enthält, die von einem Protein von Interesse abgeleitet sind, zu screenen. Aufgrund des Ausrüstungsbedarfs für die Herstellung und Detektion eines Mikroarray-Chips wird das Peptid-Mikroarray-Verfahren jedoch als zeitaufwändig und teuer angesehen.
Um diese Herausforderungen zu überwinden, kann ein in vitro- Oligopeptid-konkurrierender Kinase-Assay für eine Proteinkinase mit bekannten Erkennungsmotiven verwendet werden. Wenn das Konsensuserkennungsmotiv einer Kinase festgestellt wird, können mutmaßliche Phosphorylierungsstellen eines Kandidatensubstrats vorhergesagt und die Echtheit der Stellen validiert werden. Die überzeugendste Methode für dieses Verfahren ist, die Aufhebung der Phosphorylierung in einem mutierten Protein zu zeigen, in dem die PrädikatD-Rest wird mit einer nicht phosphorylierbaren Aminosäure ( dh Serin oder Threonin zu Alanin, Tyrosin zu Phenylalanin) substituiert. Allerdings ist die Herstellung und Isolierung von mutierten Proteinen zeitaufwändig. Als Alternative im Anfangsstadium der Forschung ist der kompetitive Peptid-Kinase-Assay einfach und bequem. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen In-vitro- Peptid-Konkurrenz-Assay und für die Validierung der Phosphorylierungsstelle.
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Protocol
1. Sicherheit
ACHTUNG: Dieses Protokoll verwendet [γ- 32 P] -ATP, um die Aktivität von AMPK zu beurteilen. Phosphor-32 ist ein radioaktives Isotop, das weitgehend eine Beta-Strahlung emittiert. Da die Größe eines Beta-Partikels extrem klein ist, kann es leicht Kleidung und Haut durchdringen. Sowohl externe als auch interne Exposition gegenüber Beta-Strahlung können schädlich für die menschliche Gesundheit, einschließlich durch Verursachen von Hautverbrennungen und Gewebeschäden.
- Führen Sie alle Schritte durch, die die Verwendung von [γ- 32 P] -ATP mit einem geeigneten Schutz erfordern, wie z. B. Acryl-Abschirmung.
- Stellen Sie sicher, dass alle Mitarbeiter mit elektronischen persönlichen Dosimetern (EPD) ausgestattet sind, um das Ausmaß der Exposition gegenüber schädlichen Strahlung während aller Verfahren zu überwachen.
- Behandeln Sie Open-Source-Strahlung nur nach entsprechender Schulung und Zulassung.
HINWEIS: Hier wurden alle Experimente nach Abschluss der Ausbildung zum Open-Source-Strahlungseinsatz bei der Seoul National UnivUnd die Zustimmung der koreanischen Regierung (nssc.go.kr/nssc/de). - Entsorgen Sie radioaktive Abfälle nach den örtlichen Vorschriften.
HINWEIS: Hier wurden Richtlinien vom Institut für Umweltschutz & Sicherheit der Seoul National University gefolgt. Die folgenden sind eine Liste der Regulierungsbehörden in den Vereinigten Staaten und in den europäischen Ländern: Die Vereinigten Staaten von Amerika, United States Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Vereinigtes Königreich, Health and Safety Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Frankreich, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Und Deutschland, Bundesministerium für Umwelt, Naturschutz, Bauen und Nukleare Sicherheit (BMU) (http://www.bmu.de).
2. In vitro Competitive Kinase Assay
- Aufbau von wettbewerbsfähigen Peptiden
- Bestimmen Sie das von AMPK phosphorylierte Konsensmotiv.
ANMERKUNG: AMPK erkennt das Konsensmotiv &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. In der Konsensussequenz repräsentiert Φ hydrophobe Aminosäuren ( dh Valin [V], Leucin [L], Methionin [M] und Isoleucin [I]) und β stellt basische Aminosäuren dar ( dh Lysin [K], Arginin [ R] und Histidin [H]) 1 . - Selektieren Sie Serin- oder Threoninreste aus Zielsequenzen nach dem obigen Konsensusmotiv. Verwenden Sie drei putative Stellen von menschlichem Nrf2 (Nr. 1, 148-157 mit Ser153; # 2, 330-339 mit Ser335 und # 3, 553-562 mit Ser558) 8 .
- Kommerziell synthetisieren 10-Reste-Peptide, die die vermeintlichen Stellen nachahmen. Erhalten Sie das synthetisierte Produkt als lyophilisiertes Pulver mit einer Reinheit von mehr als 98% für jedes Peptid.
- Löse die Peptide unter Verwendung eines Kinasepuffers, um eine Konzentration von 71,667 g / l zu erreichen. Wenn ein Peptid in einem Kinasepuffer nicht löslich ist, löst es es in 20% DMSO auf. Wenn es unlösbar bleibt, ein Peptid, das den Put nachahmtUm die Löslichkeit zu erhöhen.
- Bestimmen Sie das von AMPK phosphorylierte Konsensmotiv.
- In vitro- kompetitiver AMPK-Kinase-Assay
- 5 × Kinasepuffer wie folgt vorbereiten: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl & sub2 ;; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-Glycerophosphat (Serin / Threonin-Phosphataseinhibitor); 5 mM Na & sub3; VO & sub4; (Tyrosinphosphataseinhibitor); 0,5% (v / v) Protease-Inhibitor-Cocktail-Set III, 1 mM kaltes ATP; Und 500 & mgr; M AMP.
HINWEIS: AMP ist eine wesentliche Komponente des Kinase-Puffers, um die AMPK-Aktivität zu testen. Der Puffer kann verwendet werden, um die Aktivität von Serin / Threonin-Kinasen und Tyrosinkinasen zu messen. - Tauen Sie das folgende rekombinante Protein und synthetische Peptide auf Eis: AMPK; Nrf2; Und Oligopeptide # 1, # 2 und # 3.
- Bereiten Sie einen Reaktionspuffer auf Eis vor: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg Oligopeptid (~ 300 nmol) und 6 μl 5 × Kinasepuffer. EINDas Endvolumen auf 30 μl mit sterilem destilliertem Wasser (DW) einstellen.
HINWEIS: Die Zugabe von [γ- 32 P] -ATP nach der Herstellung des Reaktionspuffers kann das radioaktive Signal aufgrund der Kinase-Autophosphorylierung reduzieren.
- 5 × Kinasepuffer wie folgt vorbereiten: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl & sub2 ;; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-Glycerophosphat (Serin / Threonin-Phosphataseinhibitor); 5 mM Na & sub3; VO & sub4; (Tyrosinphosphataseinhibitor); 0,5% (v / v) Protease-Inhibitor-Cocktail-Set III, 1 mM kaltes ATP; Und 500 & mgr; M AMP.
- Die Reaktanten laufen lassen
HINWEIS: Alle nachfolgenden Prozesse müssen unter Schutz mit Acrylschild, Rack oder Block sowie passenden persönlichen Schutzausrüstungen durchgeführt werden.- Vor Beginn des Experiments Heizblöcke auf 30 ° C stellen.
- Füge 1 μl [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) zu den Reaktionsröhrchen auf Eis hinzu. Mischen Sie den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Pipettieren.
HINWEIS: Die Radioaktivität von 32 P hat eine kurze Halbwertszeit von ca. 14 Tagen 9 . Stellen Sie die Lautstärke unter Berücksichtigung der Halbwertszeit ein ( z. B. nach einem Monat nach der Produktion von [γ- 32 P] -ATP, fügen Sie 4 μl [γ- 32 P]-ATP, um 1 μCi zu machen). - Inkubieren Sie die Probe im Heizblock bei 30 ° C für 15-30 min. Während dieses Schrittes werden 7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gele hergestellt. Passen Sie den Prozentsatz des Gels entsprechend der Größe des Zielproteins an.
- Stoppen Sie die Kinase-Reaktion durch Zugabe von 3 μl 10 × SDS-Probenpuffer (10% (v / v) Glycerin, 20% (w / v) SDS, 15,42% (w / v) Dithiothreitol, 90% (v / v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) und 0,02% (w / v) Bromphenolblau). Mischen Sie den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Pipettieren.
- Führen Sie die Proben in einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und kontinuierlich bei 140 V für 1 h.
HINWEIS: Die Bromphenol-blaue Linie am Ende des Gels enthält extrem hohe radioaktive Signale. Es wird empfohlen, das Gel unterhalb der blauen Linie zu entfernen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um Hintergrundsignale zu reduzieren. - Nach SDS-PAGE entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Zaubernden. Legen Sie das Gel in ein Glas tUbe für den nächsten Schritt.
- Das Gel mit Fixierungspuffer für 20 min (50% Methanol und 10% Eisessig) fixieren.
- Ziehen Sie das Gel vorsichtig auf das Filterpapier und bedecken Sie es mit einer transparenten Umhüllung. Beachten Sie, dass das Gel bei diesem Schritt leicht zerrissen werden kann. Das Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen.
- Visualisierung
- Setzen Sie das Gel entweder über einen Leuchtstoffschirm oder einen Röntgenfilm über Nacht (meist ca. 16 h) aus.
HINWEIS: Ein Phosphorschirm kann nach der Exposition gegenüber dem extra hellen Licht wiederverwendet werden. Wenn ein Röntgenfilm verwendet wird, setzen Sie das Gel über zwei Tage frei. Röntgenfilme haben niedrigere Empfindlichkeiten als Phosphorsiebe. - Scannen Sie den Leuchtstoffschirm mit einem Phosphor-Imager. Exportiere das Bild als hochauflösende TIFF- oder Bitmap-Datei.
- Nach der Visualisierung, bewegen Sie das Gel in einen Glas- oder Kunststoffbehälter für Coomassie-Brillantblau (CBB) -Färbung.
- Waschen Sie das Gel mit DW. Verwerfe den DW und Fleck thE Gel mit dem Färbereagenz für 1 h.
- Das Reagenz verwerfen und das Gel mit DW für 1 h oder über Nacht entfärben. Legen Sie das Gel zwischen transparente Plastikfolien (oder das Äquivalent), um mit einem Büro-Scanner zu scannen.
- Setzen Sie das Gel entweder über einen Leuchtstoffschirm oder einen Röntgenfilm über Nacht (meist ca. 16 h) aus.
3. In-Vitro- Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante
- Site-Directed Mutagenese von pGEX-Nrf2
- Mutagenes Primer Design
HINWEIS: Das Entwerfen geeigneter mutagener Primer ist entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis der Mutagenese. Im Folgenden sind einige Überlegungen zur Gestaltung mutagener Primer gegeben. Erstellen Sie eine Grundierung bestehend aus 25 bis 45 Basen, mit der gewünschten Mutation in der Mitte des Primers. Der Primer sollte 40-60% GC-Gehalt haben und mit einer oder mehreren G- oder C-Basen enden. Stellen Sie sicher, dass das T m des Primers gleich 78 ° C oder größer ist, gemäß der Formel [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / Länge der Basen) -% Mismatch].
HINWEIS: Reinigen Sie diePrimer, weil seine Reinheit für die Mutationseffizienz wichtig ist. Es gibt mehrere Websites für die Gestaltung mutagener Primer.- Öffnen Sie das Primer-Design-Programm für "Design von Primern für ortsspezifische Mutagenese" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Paste menschliche Nrf2 DNA Sequenz (Zugang Nr. NM_006164.4) und wähle die Schaltfläche "Upload übersetzt".
- Wählen Sie den Serin-558-Rest aus der übersetzten Aminosäuresequenz, um in Alanin umzuwandeln. Mit dem mutagenen Primer, ersetzen Sie das Codon für Serin von Agc zu Gcc, für Alanin.
- Betrachten Sie die Primerlänge, T m und den GC-Gehalt.
ANMERKUNG: Der mutagene Primer wird schließlich als 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 'entworfen.
- Reaktion für die Mutantenstrass-Synthese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Das PCR-Reaktionsgemisch auf Eis vorbereiten: 10 × Reaktionspuffer, 50 ngPGEX-GST-Nrf2, 125 ng Vorwärtsprimer, 125 ng Rückwärtsprimer, 1 μl dNTP-Mischung (je 10 mM), 2,5 U Pfu- DNA-Polymerase und sterile DW bis 50 μl.
- Führen Sie die PCR für die PGEX-GST-Nrf2-Mutanten-Strangsynthese mit folgendem Zyklus: 1 Zyklus bei 95 ° C für 30 s; 18 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, bei 55 ° C für 1 min und bei 68 ° C für 90 s; Und 1 Zyklus bei 68 ° C für 5 min.
HINWEIS: Abhängig von der Plasmidlänge können die Zyklusparameter geändert werden. - Legen Sie es auf Eis für 2 min, um die Reaktanten für den nächsten Schritt zu kühlen. Alternativ können sie bei 4 ° C über Nacht aufbewahren.
- Dpn I Verdauung und die Auswahl eines Mutantenplasmids
- 1 & mgr; l Dpn I- Restriktionsenzym (10 U / & mgr; l) zu jedem der Reaktanten nach dem Abkühlen zugeben Gründlich und vorsichtig durch Pipettieren und zentrifugieren für 1 min.
- Inkubieren bei 37 ° C für 2 h, um parenterale pGEX-GST-Nrf2 zu verdauen,Gestrandete DNA.
- DH5 & agr; superkompetente Zellen vorsichtig auf Eis auftauen.
- Füge 50 μl des Edukts zu 150 μl vorgekühlten DH5 α superkompetenten Zellen hinzu und inkubiere auf Eis für mindestens 30 min.
- Die Röhrchen auf einen auf 42 ° C vorgeheizten Heizblock überführen und 90 s ablassen. Lege sie für 2 min auf Eis.
- Füge vorgewärmte Lysogenbrühe (LB) zu den transformierten DH5-α- Zellen hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 1 h unter Schütteln bei 180 U / min.
- Die transformierten Zellen auf LB-Ampicillin-Agar-Platten verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
HINWEIS: Ampicillin wird zur Selektion verwendet, da das Plasmid GEX-GST-Nrf2 den Ampicillin-Resistenzmarker hat. Verwenden Sie geeignete Antibiotika, abhängig vom Resistenzmarker des mutagenisierten Plasmids. - Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Platte, überführen sie auf 5 ml LB-Ampicillin und inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 180 U / min.Zur Verifikation der mutagenen Sequenz werden mindestens drei Kolonien ausgewertet.
- Extrahieren von DNA unter Verwendung eines DNA-Miniprep-Kits für die DNA-Sequenzanalyse; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Überprüfen Sie die mutagenen DNA-Sequenzen mit einem automatischen DNA-Sequenz-Analysator gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie mindestens 200 ng des DNA-Konstrukts für die Verifizierung von Mutantensequenzen.
- Mutagenes Primer Design
- Reinigung des rekombinanten GST-Nrf2 Proteins
- Expression mutagener GST-Nrf2- Fusionsproteine in Escherichia coli
- Verwandeln Sie das mutagene pGEX-GST-Nrf2-Plasmid in BL21- Zellen. Inokulieren einer einzelnen Kolonie in 25 ml LB-Brühe, die Ampicillin (100 & mgr; g / ml) enthält, und bei 37 ° C auf einem Rotator über Nacht inkubieren.
- Inokulieren der kultivierten Zellen in 100 ml LB-Brühe, die Ampicillin (100 & mgr; g / ml) bei einem 1: 100-Verdünnungsverhältnis enthält.
- Inkubieren bei 37 ° C auf einer RotationOder bis die Extinktion bei 600 nm etwa 0,4-0,8 (ca. 4 h) erreicht.
- Füge 100 μl 1 M IPTG zu 100 ml kultivierten Zellen hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mM IPTG herzustellen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ° C auf einem Rotator für 6 h oder über Nacht für die Proteinexpression.
- Die Zellen wurden bei 5000 xg für 20 min zentrifugiert und die Zellpellets mit 1 ml bakteriellem Lysepuffer (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg / ml Pepstatin, 0,5 μg / ml Leupeptin, Und 1 mM PMSF) auf Eis.
- Lyse die Zellpellets unter Verwendung eines Ultraschall-Homogenisators mit 2-s-Intervallen für 2 min bei 50% der maximalen Leistungsabgabe.
- Die Zellen bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand sammeln.
- Reinigung des rekombinanten GST-Nrf2 Proteins
- 200 μl 50% (v / v) Glutathion-Agarose-Kügelchen zubereiten und mit 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 ) waschen 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 500 × g für 1 min. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
- Fügen Sie das Zelllysat den vorbereiteten 200 & mgr; l 50% (v / v) Glutathion-Agarose-Kügelchen hinzu und inkubieren Sie bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Rotator für 2 h.
- Sammeln Sie die Glutathion-Agarose-Perlen in Kombination mit GST-Nrf2-Protein durch Zentrifugation bei 500 xg für 1 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Spritze mit einer 31 G-Nadel.
- Waschen Sie die Perlen mit 1 ml PBS (pH 7,3), wie in Schritt 1.
- Fügen Sie 500 μl Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl und 10 mM reduziertes Glutathion, pH 8,0) zu den Glutathion-Agarose-Perlen in Kombination mit GST-Nrf2 hinzu. Inkubieren bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Rotator für 30 min.
- Bei 500 xg für 1 min zentrifugieren und den Überstand sammeln.
- Wiederholen Sie 300 μl Elutionspuffer zu den Perlen und wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.5-3.2.2.6 zweimal.
- Bestätigung des gereinigten GST-Nrf2 Proteins
- 5 μl der Probe zur Visualisierung der Proteinmenge mit 0,5 μg Standardprotein BSA vorbereiten.
- Führen Sie die Proben in einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und dann bei 140 V für 60 min.
- Färben Sie das Gel mit 0,1% CBB-Färbelösung (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% Methanol, 10 ml Eisessig und 50 ml destilliertes H 2 O) für 2 h und destain (30 ml Methanol, 10 ml Eisessig und 60 ml destilliertem H & sub2 ; O), bis die Banden deutlich gezeigt sind.
- Legen Sie das entfärbte Gel auf das Filterpapier und legen Sie es mit einer transparenten Umhüllung ab. Das Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen.
- Bestimmen Sie die Menge des mutierten GST-Nrf2-Proteins mit Densitometrie für den in vitro- AMPK-Kinase-Assay.
- Expression mutagener GST-Nrf2- Fusionsproteine in Escherichia coli
- In-vitro- AMPK-Aktivitäts-Assay mit einer ortsspezifischen Mutante
NICHTE: Der in vitro AMPK-Kinase-Assay wird gemäß den Schritten 2.2-2.4 unter Verwendung von 0,4 μg gereinigtem Wildtyp GST-Nrf2 oder der GST-Nrf2-S558A-Mutante ohne Peptidinhibitoren durchgeführt. Befolgen Sie alle in Schritt 1 beschriebenen Strahlenschutzrichtlinien.- Einen Reaktionspuffer auf Eis mit 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Mutanten- oder Wildtyp-GST-Nrf2 und 6 μl 5-Kinase-Puffer vorbereiten. Füllen Sie bis zu 30 μl mit sterilem DW.
- Füge 1 μl [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) zu den Reaktionsröhrchen auf Eis hinzu. Den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpumpen mischen und zentrifugieren.
- Inkubieren Sie die Proben in einem Heizblock bei 30 ° C für 30 min.
- Stoppen Sie die Kinase-Reaktion durch Zugabe von 3 μl 10 × SDS-Probenpuffer.
- In einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und dann bei 140 V für 1 h laufen gelassen.
- Fixieren Sie das Gel mit dem Fixierungspuffer für 20 min, bewegen Sie es auf das Filterpapier und bedecken Sie das Gel mit einem transparEnt wrapper
- Das Gel mit dem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen und dann über Nacht entweder einem Leuchtstoffschirm oder einem Röntgenfilm aussetzen.
- Den Phosphorschirm mit einem Phosphor-Imager abtasten und das Gel auf eine Glasröhre zur CBB-Färbung nach der Visualisierung gemäß Schritt 2.4 bewegen.
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Representative Results
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Ergebnisse aus wiederholten Experimenten in dem zuvor gemeldeten Papier 8 . Drei verschiedene 10-Rest-Oligopeptide, die die mutmaßlichen AMPK-Zielstellen nachahmen (# 1, 148-157 mit Ser153; # 2, 330-339, umfassend Ser335 und # 3, 553-562, umfassend Ser558), wurden synthetisiert und als Konkurrenten in der in verwendet Vitro -Kinase-Assay Die Phosphorylierung von Nrf2 durch AMPK wurde in Gegenwart von Oligopeptid Nr. 3 stark reduziert (Abbildung 1 ). Als nächstes wurde ein ortsgerichteter Mutageneseassay durchgeführt, um das Ergebnis des peptidomimetischen Experiments zu validieren. Angesichts der inhibitorischen Wirkung von Oligopeptid Nr. 3 auf die AMPK-vermittelte Phosphorylierung von Nrf2 (Abbildung 1 ) erzeugten wir eine S558A-Nrf2-Mutante. Die Phosphorylierungsniveaus wurden zwischen dem Wildtyp Nrf2 und dem S verglichen558A-Mutante unter Verwendung des in vitro- AMPK-Kinase-Assays. Die einzelne Aminosäure-Substitution von Nrf2 (Ser → Ala bei 558) hinderte AMPK daran, Nrf2 zu phosphorylieren, was darauf hinweist, dass AMPK direkt bei Ser558 ( 2 ) Phosphorylierung von Nrf2 enthält (Abbildung 2 ).
Abbildung 1: In vitro- kompetitiver AMPK-Kinase-Assay In-vitro -Kinase-Assays wurden in Gegenwart der angegebenen Oligopeptide durchgeführt (# 1, 148-157, umfassend Ser153; # 2, 330-339, umfassend Ser335 und # 3, 553-562, umfassend Ser558).
Abbildung 2: In-vitro- AMPK-Kinase-Assay unter Verwendung eines ortsspezifischen mutierten Proteins. In-vitro -Kinase-Assays wurden in Gegenwart von Wildt durchgeführtYpe GST-Nrf2 oder seine S558A-Mutante.
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Discussion
Als einfacher und bequemer Weg, um die Echtheit der von AMPK vermittelten vorhergesagten Phosphorylierungsstellen zu beurteilen, beschreiben wir hier einen in vitro -Kinase-Assay, der verwendet werden kann, um eine spezifische Phosphorylierungsstelle unter Verwendung von kompetitiven Peptiden zu entdecken und sie mit einer ortsspezifischen Mutante zu verifizieren . Die repräsentativen Daten, die aus dem in vitro- kompetitiven AMPK - Aktivitäts-Assay erhalten wurden, stimmen mit den Ergebnissen eines Assays unter Verwendung eines ortsgerichteten mutierten Proteins überein, was anzeigt, dass der Peptid-Konkurrenz-Assay ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung einer Phosphorylierungsstelle ist. Diese Methode wurde auch in der Studie verwendet, die die spezifische Stelle identifiziert, die durch PKC & sub1; & sub0; phosphoryliert wurde, die Nrf2 an Serin 40 3 phosphoryliert. Da die Peptide konkurrenzfähig an ein Protein binden, kann das Prinzip auch auf einen in vitro GST-Pull-Down-Assay angewendet werden, um ein Bindungsmotiv 10 , 11 zu identifizieren. Darüber hinaus ist diese PeptidomimeTic-Verfahren kann auch auf die Identifizierung anderer posttranslationaler Modifikationen, wie Acetylierung an Lysinresten, anwendbar sein.
Unter Verwendung dieses Protokolls kann es schwierig sein, einige hydrophobe Peptide aufzulösen. Wenn ein Peptid in einem Kinasepuffer unlöslich ist, kann das Auflösen in 20% DMSO hilfreich sein. Um extrem hydrophobe Peptide aufzulösen, wird zunächst versucht, es in 100% DMSO aufzulösen und dann die Lösung mit einem Kinasepuffer zu verdünnen. Sonikation kann auch bei der Auflösung der Peptide hilfreich sein. Wenn es unlöslich bleibt, sollte ein Peptid, das die vermeintliche Stelle nachahmt, erweitert werden, um die Löslichkeit zu erhöhen.
Das in diesem Papier eingeführte Protokoll beschreibt ein " in vitro System", in dem eine gereinigte Kinase und ein Substrat umgesetzt werden. Im In- vitro- System werden kleine Unterschiede in der Konzentration von kompetitiven Peptiden die Ergebnisse nicht beeinflussen, wenn die Konzentration nicht niedriger als das Substratprotein ist. Die rEsat, das aus einem in vitro- Experiment erhalten wird, schließt die inhärente Möglichkeit ein, ein artefaktisches Ereignis zu sein, das durch künstliche Nähe und die hohe Konzentration an Reaktanten erzeugt wird. Um diese Perspektive zu beseitigen, sollte die Interpretation der Daten von den Ergebnissen aus zellbasierten Experimenten begleitet werden. Eine weitere Möglichkeit, falsch-positive Ergebnisse unter Verwendung von Peptiden zu erhalten, kann auf Veränderungen in der Substratkonformation und / oder der Kinaseerkennung zurückzuführen sein. Um diese Möglichkeit auszuschließen, ist es notwendig, Bestätigungsversuche mit mutierten Proteinen durchzuführen.
Auf der anderen Seite können auch falsch-negative Daten aus diesem System erzeugt werden. Viele Kinasen wirken als Proteinkomplexe im zellulären Kontext und erfordern Co-Faktoren für die volle Funktionalität. AMPK ist ein repräsentativer Proteinkinase-Komplex aus AMPKα-, AMPKβ- und AMPKγ-Untereinheiten, und die Bindung von AMP an die AMPKγ-Untereinheit ist für die Aktivierung der Kinase notwendig. In der Tat, AMPKPhosphorylierung von Nrf2 in einem AMP-freien Kinase-Puffer (Daten nicht gezeigt). Somit ist anzumerken, dass AMP in dem Kinase-Reaktionspuffer für einen erfolgreichen in vitro- Assay gelöst werden muss.
Die Verwendung von Massenspektrometrie zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen, die beliebteste Methode, hat mehrere technische Einschränkungen, die oftmals durch den leichten Verlust von Phosphorsäure während des Fragmentierungsprozesses falsch-negative Signale erzeugen. Eine Peptid-Mikroarray-Methode kann die zweite Möglichkeit sein, nach Phosphorylierungsstellen zu suchen. Diese Methode gilt jedoch als zeitaufwändig und teuer. Als ein alternatives Verfahren zum Screening von putativen Phosphorylierungsstellen kann die kompetitive Peptidmethode eine bequeme und kostengünstige Möglichkeit sein, Einblick in die Natur einer vermuteten Phosphorylierungsstelle zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der von der koreanischen Regierung finanzierten National Research Foundation of Korea (MSIP) (Nr. 2015R1A2A1A10052663 und Nr. 2014M1A3A3A02034698) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
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- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
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- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
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- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
