Summary
펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.
Abstract
특정 부위의 단백질 인산화가 다른 분자와의 형태 및 상호 작용을 결정합니다. 따라서 단백질 인산화는 세포의 생물학적 기능과 특성에 영향을 미친다. 현재, 인산화 부위를 발견하는 가장 일반적인 방법은 신속하고 민감한 방법 인 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 그러나, 상대적으로 불안정한 인산염 잔기는 단편화 단계에서 종종 포스 포 펩타이드로부터 방출되며, 이는 종종 거짓 음성 신호를 생성한다. 그러한 경우, 부위 특이 적 돌연변이 체를 이용한 전통적인 in vitro 키나아제 분석이 더 정확할 수 있지만,이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 따라서, 펩티드 경쟁을 이용하는 대안적인 방법이 유리할 수있다. 5 '아데노신 모노 포스페이트 - 활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 컨센서스 인식 모티프가 확립되었고, 위치 스캐닝 펩타이드 라이브러리 엉덩이를 사용하여 확인되었다ay 2 . 따라서, 새로운 기질에 대한 AMPK 인산화 부위는 펩티드 경쟁 분석에 의해 예측되고 확인 될 수있다. 이 보고서에서 우리는 AMPK 매개 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2) 인산화를 설명함으로써 시험 관내 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석을위한 상세한 단계 및 절차를 기술한다. 인산화 부위를 인증하기 위해, 우리는 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여 순차적 인 in vitro 키나아제 분석을 수행했다. 전반적으로, 펩티드 경쟁 분석은 다수의 잠재적 인 인산화 부위를 스크리닝하고 인산화 부위 돌연변이 체에 의한 확인을위한 부위를 확인하는 방법을 제공한다.
Introduction
특정 잔기에서의 단백질 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서, 신호 전달 네트워크의 이해는 특정 인산화 부위의 확인을 필요로한다. 또한, 인산화 부위는 단백질 내의 개별 도메인이 상이한 구조 및 기능을 보유하기 때문에 단백질 기능에 대한 효과를 결정한다. 주요 항산화 인자 인 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)의 활성은 다른 부위의 인산화를 통해 양방향으로 조절된다. 우리의 연구는 Nrf2의 인산화를 촉매하는 키나아제에 초점을 맞추었다. 산화 적 공격에 대한 Nrf2의 스트레스 반응은 주로 세린 40에서의 인산화와 Nrf2를 활성화시키는 protein kinase C (PKC) -δ를 통해 빠르게 일어난다. 반대로, Fyn은 티로신 5에서 Nrf2의 억제 성 인산화를 촉매한다활동의 긴밀한 통제를 위해 68.
인산화 부위를 발견하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 신속하고 매우 민감한 인산화 부위 맵핑 데이터는 이러한 방식으로 생성 될 수있다. 그러나 몇 가지 기술적 인 한계가 있으며 가끔 잘못된 신호를 생성합니다. 열악한 서열 범위는 종종 LC / MS 분석에서 발생합니다. 인산화 부위를 확인하기 위해서는 단백질의 최대 아미노산 범위에 대한 정보가 필요합니다 6 . 소화 단계에서 여러 단백질 분해 효소로 단백질을 단백질 분해하면 서열 범위를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화 잔기의 확인에 대한 또 다른 장애는 세린 및 트레오닌 인산화 된 펩타이드 6 , 7에서 자주 관찰되는 인산의 손 상 손실입니다. 불안정한 인산염 잔기는 종종단편화 과정에서 인산 펩타이드로부터 방출된다. 인산화 부위를 검색 할 때 두 번째 옵션은 펩타이드 마이크로 어레이 방법을 사용하는 것입니다. 목적 단백질로부터 유래 된 펩티드 단편을 함유하는 마이크로 어레이 칩을 사용하여 키나아제 표적 부위를 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러나, 마이크로 어레이 칩의 생산 및 검출을위한 장비 요건으로 인해, 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 시간 소모적이고 고비용으로 고려된다.
이러한 과제를 극복하기 위해, 시험 관내 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석은 공지 된 인식 모티프를 갖는 단백질 키나아제에 사용될 수있다. 키나아제의 공통 인식 모티프가 확립되면, 후보 기질의 추정 인산화 부위가 예측 될 수 있고, 그 부위의 진위가 확인 될 수있다. 이 과정에서 가장 설득력있는 방법은 돌연변이 단백질에서 인산화의 폐지를 보여주는 것이다.d 잔기는 비 - 인산화 가능한 아미노산 ( 즉, 세린 또는 트레오닌 내지 알라닌; 티로신 내지 페닐알라닌)으로 치환된다. 그러나, 돌연변이 단백질의 생산 및 분리는 시간 소모적이다. 연구 초기 단계의 대안으로 경쟁 펩타이드 키나아제 분석은 간단하고 편리합니다. 여기, 우리 는 체외 펩티드 경쟁 분석 및 인산화 사이트의 검증을위한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 안전
주의 :이 프로토콜은 [γ- 32 P] -ATP를 사용하여 AMPK의 활성을 평가합니다. Phosphorus-32는 방사성 동위 원소로 주로 베타 방사선을 방출합니다. 베타 입자의 크기가 매우 작기 때문에 쉽게 의류와 피부에 침투 할 수 있습니다. 베타 방사선에 대한 외부 및 내부 노출은 피부 화상과 조직 손상을 유발하는 것을 포함하여 인체 건강에 해로울 수 있습니다.
- 아크릴 차폐와 같은 적절한 보호 장치를 사용하여 [γ- 32 P] -ATP를 사용해야하는 모든 단계를 수행하십시오.
- 모든 작업자가 모든 절차에서 유해한 방사선에 노출되는 정도를 모니터링하기 위해 전자 개인 선량계 (EPD)를 갖추고 있는지 확인하십시오.
- 적절한 교육 및 규제 승인을받은 후에 만 오픈 소스 방사선을 다루십시오.
참고 : 여기에서 모든 실험은 서울 대학교에서 오픈 소스 방사선 사용 교육을 마친 후에 수행되었습니다.한국 정부의 승인 및 승인 (nssc.go.kr/nssc/en). - 지역 규정에 따라 방사성 폐기물을 폐기하십시오.
참고 : 여기서는 서울 대학교 환경 안전 안전 연구소의 지침을 따랐습니다. 다음은 미국 및 유럽 국가의 규제 기관 목록입니다 : 미국, 미국 원자력 규제위원회 (http://www.nrc.gov/); 영국, 건강 및 안전 집행부 (HSE) (http://www.hse.gov.uk); 프랑스, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); 독일, 연방 환경부, 자연 보전, 건물 및 핵 안전국 (BMU) (http://www.bmu.de).
2. 생체 외 경쟁적 키니 아제 분석법
- 경쟁 펩타이드의 구축
- AMPK에 의해 인산화 된 컨센서스 모티프를 결정합니다.
참고 : AMPK는 컨센서스 모티프,- [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ이다. 컨센서스 순서에서 Φ는 소수성 아미노산 (valine [V], leucine [L], methionine [M], isoleucine [I])을 나타내며 β는 염기성 아미노산 ( 즉 라이신 [K], 아르기닌 [ R] 및 히스티딘 [H]) 1 . - 상기 컨센서스 모티프에 따라 표적 서열로부터 세린 또는 트레오닌 잔기를 선택한다. 인간 Nrf2 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330-339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553-562)의 3 개의 추정 사이트를 사용한다.
- 추정 사이트를 모방 한 10 잔기의 펩타이드를 상업적으로 합성합니다. 합성 된 생성물을 각 펩티드에 대해 98 % 이상의 순도를 갖는 동결 건조 된 분말로서 수득한다.
- 키나제 완충액을 사용하여 펩타이드를 용해시켜 71.667 g / L의 농도를 얻습니다. 펩타이드가 키나아제 완충액에 용해되지 않으면 20 % DMSO에 용해시킵니다. 그것이 불용성으로 남아 있다면, 펩티드를 모방 한 펩티드활성 부위가 용해도를 증가시키기 위해 확장 될 수있다.
- AMPK에 의해 인산화 된 컨센서스 모티프를 결정합니다.
- 생체 외 경쟁 AMPK 키나아제 분석법
- 다음과 같이 5 × 키나아제 버퍼를 준비 : 100 MM HEPES, 산도 7.4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β- 글리세로 포스페이트 (세린 / 트레오닌 포스파타제 억제제); 5 mM Na3 VO4 (티로신 포스 파타 아제 억제제); 0.5 % (v / v) 프로테아제 저해제 칵테일 세트 III, 1 mM 차가운 ATP; 및 500 μM AMP.
참고 : AMP는 AMPK 활동을 시험하기 위해 키나제 완충제의 필수 구성 요소입니다. 상기 완충액은 세린 / 트레오닌 키나아제 및 티로신 키나아제의 활성을 측정하는데 사용될 수있다. - 얼음에서 다음의 재조합 단백질과 합성 펩타이드를 녹입니다 : AMPK; Nrf2; 올리고 펩타이드 # 1, # 2 및 # 3을 포함한다.
- 얼음에 반응 완충액을 준비하십시오 : AMPK 0.15 μg, Nrf2 (~ 4 pmol) 0.4 μg, 올리고 펩티드 (~ 300 nmol) 0.43 mg, 5 x 키나아제 완충액 6 μL. 에이멸균 증류수 (DW)로 최종 부피를 30 μL로 맞 춥니 다.
참고 : 반응 완충액을 준비한 후 [γ- 32 P] -ATP를 첨가하면 키나제자가 인산화로 인한 방사성 신호가 감소 될 수 있습니다.
- 다음과 같이 5 × 키나아제 버퍼를 준비 : 100 MM HEPES, 산도 7.4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β- 글리세로 포스페이트 (세린 / 트레오닌 포스파타제 억제제); 5 mM Na3 VO4 (티로신 포스 파타 아제 억제제); 0.5 % (v / v) 프로테아제 저해제 칵테일 세트 III, 1 mM 차가운 ATP; 및 500 μM AMP.
- 반응물 실행하기
참고 : 아래의 모든 공정은 아크릴 보호막, 랙 또는 블록뿐만 아니라 적절한 개인 보호 장비로 보호해야합니다.- 실험을 시작하기 전에 가열 블록을 30 ° C로 설정하십시오.
- 얼음 상에 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다.
참고 : 32 P의 방사능은 약 14 일의 짧은 반감기를 갖는다. 반감기를 고려하여 부피를 조절하십시오 ( 예 : [γ- 32 P] -ATP의 생산으로부터 한 달 후 [γ- 32 P] -ATP 4 μL 첨가)-ATP로 1 μCi). - 샘플을 가열 블록에서 30 ° C로 15-30 분 동안 품어 낸다. 이 단계에서 7.5 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔을 준비하십시오. 표적 단백질의 크기에 따라 겔의 비율을 조정하십시오.
- 10 % SDS 샘플 버퍼 (10 % (V / V) 글리세롤, 20 % (W / V) SDS, 15.42 % (W / V) 디티 오 트레이 톨, 90 % (V / V) 0.5 M 트리스 -HCl (pH 6.8), 및 0.02 % (w / v) 브로 모 페놀 블루). 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다.
- 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간, 140V에서 1 시간 동안 연속적으로 시험한다.
참고 : 겔의 끝에있는 브로 모 페놀 블루 라인은 매우 높은 방사성 신호를 포함합니다. 배경 신호를 줄이기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 파란색 선 아래 젤을 제거하는 것이 좋습니다. - SDS-PAGE 후 캐스터에서 젤을 부드럽게 제거하십시오. 젤을 유리에 넣으십시오.다음 단계를 위해 ube.
- 고정 버퍼와 20 분 (50 % 메탄올과 10 % 빙하 아세트산)에 대한 젤을 고정.
- 부드럽게 젤을 여과지 위로 옮기고 투명한 포장지로 덮으십시오. 이 단계에서 젤이 쉽게 찢어 질 수 있습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다.
- 심상
- 형광체 화면이나 X- 선 필름에 밤새 젤을 노출 시키십시오 (대개 약 16 시간 동안).
참고 : 형광체 화면은 매우 밝은 빛에 노출 된 후 다시 사용할 수 있습니다. X- 레이 필름을 사용하는 경우 젤을 2 일 동안 노출 시키십시오. X 선 필름은 형광체 스크린보다 낮은 감도를 가지고 있습니다. - 형광체 이미 저로 형광체 화면을 스캔하십시오. 이미지를 고해상도 TIFF 또는 비트 맵 파일로 내 보냅니다.
- 시각화 후 젤을 유리 또는 플라스틱 용기에 옮겨 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 염색을하십시오.
- DW로 젤을 씻으십시오. DW를 버리고 th를 그어라.e 겔을 염색 시약과 1 시간 동안 섞는다.
- 시약을 버리고 DW로 1 시간 또는 밤새 겔을 처치하십시오. 사무실 스캐너로 스캔하려면 투명 플라스틱 필름 (또는 동등한 것) 사이에 젤을 놓습니다.
- 형광체 화면이나 X- 선 필름에 밤새 젤을 노출 시키십시오 (대개 약 16 시간 동안).
3. 사이트 특정 돌연변이를 사용 하여 체외 키나아제 분석
- pGEX-Nrf2의 부위 유도 돌연변이 유발
- 돌연변이 유발 프라이머 디자인
참고 : 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 설계하는 것은 돌연변이 유발의 성공적인 결과에 중요합니다. 다음은 돌연변이 유발 프라이머를 설계하기위한 몇 가지 고려 사항입니다. 프라이머 중간에 원하는 돌연변이와 25 ~ 45 염기로 구성된 프라이머를 만듭니다. 프라이머는 40-60 % GC 함량을 가져야하며 하나 이상의 G 또는 C 염기로 종결되어야합니다. 프라이머의 Tm이 [Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / 염기 길이) - % 불일치]에 따라 78 ° C 이상인지 확인하십시오.
참고 :프라이머는 그 순도가 돌연변이 효율에 중요하기 때문이다. 돌연변이 유발 프라이머를 디자인하기위한 몇 가지 웹 사이트가 있습니다.- "사이트 지정 돌연변이 유발을위한 프라이머 디자인"(http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)을위한 프라이머 디자인 프로그램을 엽니 다.
- 인간 Nrf2 DNA 서열 (Access No. NM_006164.4)을 붙이고 "번역 된 번역 업로드"버튼을 선택하십시오.
- 알라닌으로 변환 될 번역 된 아미노산 서열로부터의 세린 558 잔기를 선택한다. 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 알라닌에 대해 agc에서 gcc까지의 세린을 코돈으로 대체하십시오.
- 프라이머 길이, Tm 및 GC 함량을 고려하십시오.
참고 : 돌연변이 유발 프라이머는 최종적으로 5'-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3 '로 설계됩니다.
- 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 돌 연변이 합성 반응
- 얼음에 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오 : 10X 반응 완충액, 50ngpGEX-GST-Nrf2, 정방향 프라이머 125 ng, 리버스 프라이머 125 ng, dNTP 믹스 (각각 10 mM) 1 μL, Pfu DNA 폴리머 라 아제 2.5 U 및 멸균 DW를 50 μL로 첨가 하였다.
- 다음 순환 프로그램으로 pGEX-GST-Nrf2 돌연변이 가닥 합성을위한 PCR을 실행하십시오 : 95 ℃에서 30 초 동안 1 사이클; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 및 68 ℃에서 90 초의 18 사이클; 68 ℃에서 5 분 동안 1 사이클.
참고 : 플라스미드 길이에 따라 순환 매개 변수가 변경 될 수 있습니다. - 다음 단계를 위해 반응물을 식히기 위해 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다. 또는 4 ° C에서 밤새 보관하십시오.
- Dpn I 소화 및 변이 형 플라스미드의 선택
- Dpn I 제한 효소 (10 U / μL) 1 μL를 냉각 후 반응물 각각에 첨가한다. 피펫 팅하고 1 분간 원심 분리하여 철저히 섞는다.
- 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하여 부모를 소화시킨다 pGEX-GST-Nrf2 double-가닥 DNA.
- DH5 α supercompetent 세포를 얼음 위에서 부드럽게 녹입니다.
- 미리 냉각 DH5 α supercompetent 세포 150 μL에 반응물 50 μL를 추가하고 적어도 30 분 동안 얼음에 품어.
- 42 ° C로 예열 된 가열 블록에 튜브를 옮기고 90 초 동안 그대로 두십시오. 그들을 얼음에 2 분 동안 놓습니다.
- 형질 전환 된 DH5α 세포에 예열 된 용 영돈 배양액 (LB)을 첨가하고 180 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
- LB - 암피실린 한천 플레이트에 변형 세포를 퍼 뜨리고 37 ° C에서 밤새 품어.
참고 : 플라스미드 GEX-GST-Nrf2는 암피실린 내성 마커를 가지고 있기 때문에 암피실린은 선택에 사용됩니다. mutagenized 플라스미드의 저항 마커에 따라 적절한 항생제를 사용하십시오. - 접시에서 단일 식민지를 선택, 5 ML의 LB - 암피실린에 전송하고, 180 rpm으로 떨고와 함께 37에서 하룻밤 그것을 품어.돌연변이 유발 서열의 확인을 위해 적어도 세 개의 콜로니를 평가하십시오.
- DNA 서열 분석을 위해 DNA miniprep kit를 사용하여 DNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 제조자의 프로토콜에 따라 자동 DNA 서열 분석기를 사용하여 돌연변이 유발 DNA 서열을 확인한다. 돌연변이 체 시퀀스의 확인을 위해 최소한 200 ng의 DNA 구조체를 사용하십시오.
- 돌연변이 유발 프라이머 디자인
- 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제
- 대장균에서 돌연변이 유발 GST-Nrf2 융합 단백질의 발현
- mutagenic pGEX-GST-Nrf2 플라스미드를 BL21 세포로 형질 전환시킨다. 암피실린 (100 μg / ML)가 들어있는 LB 배지 25 mL에 단일 식민지를 접종하고 밤새 37 ℃에서 배양하십시오.
- 배양 된 세포를 1 : 100 희석 비율로 암피실린 (100 μg / mL)을 함유 한 LB 브로 쓰 100 mL에 접종한다.
- 37 ℃에서 배양하십시오.또는 600 nm에서 흡광도가 0.4-0.8 (약 4 시간)에 도달 할 때까지.
- 1 MM IPTG의 최종 농도를 준비하기 위해 100 ML의 배양 세포에 1 M IPTG 100 μL를 추가합니다.
- 단백질을 발현시키기 위해 6 시간 동안 또는 밤새 로테 리터에서 30 ° C로 세포를 인큐하십시오.
- 20 분 동안 5,000 xg에서 세포를 원심 분리하고 세균 용해 버퍼 (25 MM HEPES, 5 MM EDTA, 2 MM DTT, 0.1 % CHAPS, 1 μg / ML pepstatin, 0.5 μg / ML leupeptin의 1 ML로 세포 알약을 resuspend, 및 1 mM PMSF)를 첨가 하였다.
- 최대 전력 출력의 50 %에서 2 분 간격으로 초음파 호 모지 나이저를 사용하여 세포 펠릿을 녹입니다.
- 4 분 15 분 12,000 × g에서 세포를 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다.
- 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제
- 50 % (V / V) 글루타티온 - 아가로 오스 비즈 200 μL를 준비하고 1 ML PBS (산도 7.3; 140 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 10 MM Na 2 4 및 1.8 mM KH 2 PO 4 ). 500 × g에서 1 분간 원심 분리하여 비드를 수집합니다. 세 번 씻으십시오.
- 50 % (브이 / 브이) 글루타티온 - 아가로 오스 구슬의 준비 200 μL에 세포 lysate를 추가하고 4에서 품어 ° C 2 H를위한 끝 오버 회전 장치.
- 500 xg에서 1 분간 원심 분리하여 GST-Nrf2 단백질과 결합 된 glutathione-agarose beads를 수집합니다. 31G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하여 뜨는을 제거합니다.
- 1 단계에서와 같이 구슬을 PBS (산도 7.3) 1 ML로 씻으십시오.
- GST - Nrf2와 결합 glutathione - 아가로 오스 구슬에 용리 버퍼 (50 MM 트리스 - HCl 및 10 MM 감소 글루타티온, 산도 8.0) 500 μL를 추가합니다. 30 분 동안 끝 오버 로테이터에서 4 ° C로 품어 낸다.
- 1 분 500 XG에서 원심 분리기 및 뜨는를 수집합니다.
- 다시 구슬에 용리 버퍼 300 μL를 추가하고 3.2.2.5-3.2.2.6 단계를 두 번 반복하십시오.
- 정제 된 GST-Nrf2 단백질의 확인
- 표준 단백질 BSA 0.5 μg로 단백질 양의 시각화를 위해 시료 5 μL를 준비하십시오.
- 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간,이어서 140V에서 60 분간 실시한다.
- 겔을 2 시간 동안 0.1 % CBB 염색 용액 (CBB R250 0.1g, 99 % 메탄올 40mL, 빙초산 10mL 및 증류수 50mL)로 염색하고 탈염시킨다 (메탄올 30mL, 10 mL의 빙초산, 60 mL의 증류수)로 뚜껑을 덮는다.
- destained 젤을 필터 용지에 놓고 투명한 래퍼로 덮습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다.
- 시험 관내 AMPK 키나아제 분석을 위해 농도계로 돌연변이 GST-Nrf2 단백질의 양을 결정하십시오.
- 대장균에서 돌연변이 유발 GST-Nrf2 융합 단백질의 발현
- 사이트 특이 돌연변이 체를 이용한 In Vitro AMPK Activity Assay
아니E : 시험 관내 AMPK 키나아제 분석은 정제 된 야생형 GST-Nrf2 또는 펩타이드 억제제가없는 GST-Nrf2-S558A 돌연변이 체 0.4 μg을 사용하여 단계 2.2 내지 2.4에 따라 수행 하였다. 1 단계에서 설명한 모든 방사선 안전 지침을 따르십시오.- 0.15 μg의 AMPK, 0.4 μg의 돌연변이 체 또는 야생형 GST-Nrf2 및 5 개의 키나아제 완충액 6 μL로 얼음 상에 반응 완충액을 준비한다. 멸균 DW로 최대 30 μL를 채 웁니다.
- 얼음 위에서 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 혼합하고 원심 분리기.
- 30 분 30 ° C 가열 블록에서 샘플을 품어.
- 10 × SDS 샘플 버퍼 3 μL를 추가하여 키나아제 반응을 중지하십시오.
- 70 % V에서 20 분 동안 7.5 % SDS-PAGE 젤에서 실행하고 1 시간 동안 140V에서 실행하십시오.
- 고정 버퍼와 겔을 20 분간 고정하고, 여과지 위로 옮기고, 투명 젤로 덮는다.ent 포장지.
- 진공 젤 건조기로 80 ° C에서 1 시간 동안 젤을 건조시킨 다음 형광 막 또는 X 선 필름에 밤새 노출시킵니다.
- 형광 물질 이미 저로 형광체 화면을 스캔하고 2.4 단계에 따라 시각화 후 CBB 염색을위한 유리 튜브로 젤을 이동합니다.
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Representative Results
그림 1 과 그림 2 는 이전에보고 된 논문 8 에서 반복 된 실험 결과를 보여줍니다. 상응하는 AMPK 표적 부위를 모방 한 3 개의 상이한 10 잔기 올리고 펩타이드 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330 내지 339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553 내지 562)가 합성되어 in 시험 관내 키나아제 분석. AMPK에 의한 Nrf2의 인산화는 올리고 펩타이드 # 3 ( 그림 1 )의 존재 하에서 크게 감소했다. 다음으로, 부위 특이 적 돌연변이 유발 분석을 수행하여 펩티 도미넴 실험의 결과를 확인 하였다. Nrf2의 AMPK 매개 인산화에 대한 올리고 펩타이드 # 3의 억제 효과를 감안할 때 ( 그림 1 ), 우리는 S558A-Nrf2 돌연변이를 만들었습니다. 인산화 수준을 야생형 Nrf2와 S558A 돌연변이 체를 시험관 내 AMPK 키나아제 분석법을 사용하여 분석 하였다. Nrf2의 단일 아미노산 치환 (558에서의 Ser → Ala)은 AMPK가 Nrf2를 인산화시키는 것을 막아 AMPK가 Ser558에서 Nrf2를 직접 인산화 시킨다는 것을 나타낸다 ( 도 2 ).
그림 1 : 시험 관내 경쟁 AMPK 키나아제 분석. 시험 관내 키나제 검정은 지시 된 올리고 펩타이드 (# 1, 148-157은 Ser153을 포함하고, # 2, 330-339는 Ser335를 포함하고, # 3, 553-562는 Ser558을 포함 함)의 존재하에 수행 하였다.
그림 2 : 부위 특이 적 돌연변이 단백질을 이용한 시험관 내 AMPK 키나아제 분석. 시험관 내 (in vitro) 키나아제 분석은 야생 (wildt)예를 들어 GST-Nrf2 또는 그 S558A 돌연변이.
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Discussion
AMPK에 의해 매개되는 예측 된 인산화 부위의 신뢰성을 평가할 수있는 간단하고 편리한 방법으로 경쟁 펩타이드를 사용하여 특정 인산화 부위를 발견하고 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여이를 검증 할 수있는 in vitro 키나아제 분석 에 대해 설명합니다 . 시험관 내 경쟁 AMPK 활성 분석 에서 얻은 대표적인 데이터는 펩타이드 경쟁 분석이 인산화 부위를 결정하는 유용한 도구임을 나타내는 사이트 지정 돌연변이 단백질을 사용하여 분석의 결과와 일치. 이 방법은 세린 40 3 에서 Nrf2를 인산화시키는 PKCδ에 의해 인산화 된 특정 부위를 확인하는 연구에서도 사용되었다. 펩타이드는 단백질과 경쟁적으로 결합하기 때문에이 원리는 결합 모티프 10 , 11 을 확인하기위한 시험관 내 GST 풀다운 분석에도 적용될 수 있습니다. 또한,이 펩티 도미 메tic 방법은 또한 라이신 잔기에서의 아세틸 화와 같은 다른 번역 후 변형의 동정에도 적용될 수있다.
이 프로토콜을 사용하면 일부 소수성 펩티드를 용해시키는 것이 어려울 수 있습니다. 펩타이드가 키나아제 완충액에 녹지 않는다면 20 % DMSO에 용해시켜야합니다. 매우 소수성 인 펩타이드를 녹이기 위해서는 먼저 100 % DMSO에 용해시킨 다음 키나아제 완충액으로 용액을 희석하십시오. Sonication은 또한 펩타이드를 녹이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것이 불용성으로 남아 있다면, 추정 부위를 모방 한 펩타이드는 용해도를 증가시키기 위해 확장되어야한다.
이 논문에서 소개 된 프로토콜은 정제 된 키나아제와 기질이 반응하는 " in vitro system"을 기술한다. 시험 관내 시스템에서 농도가 기질 단백질보다 낮지 않으면 경쟁력있는 펩티드 농도의 작은 차이가 결과에 영향을 미치지 않습니다. The rin vitro 실험 에서 얻은 esult는 인위적인 근접성과 높은 농도의 반응물에 의해 생성 된 인공적인 사건이되는 고유의 가능성을 포함합니다. 이 전망을 없애기 위해 데이터의 해석에는 세포 기반 실험의 결과가 수반되어야합니다. 펩타이드를 사용하여 위양성 결과를 얻는 또 다른 가능성은 기질 구조 및 / 또는 키나아제 인식의 변화 때문일 수 있습니다. 이 가능성을 배제하기 위해서는 돌연변이 단백질에 대한 확인 실험이 필요합니다.
반면에 잘못된 음성 데이터도이 시스템에서 생성 될 수 있습니다. 많은 키나아제가 세포 내에서 단백질 복합체 역할을하며 완전한 기능을 위해서는 보조 인자가 필요합니다. AMPK는 AMPKα, AMPKβ 및 AMPKγ 서브 유니트로 구성된 대표적인 단백질 키나아제 복합체이며 AMPKγ 서브 유니트에 대한 AMP의 결합은 키나아제의 활성화에 필수적이다. 사실, AMPKAMP-없는 키나제 완충액에서 Nrf2를 인산화시키지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 성공적인 in vitro 분석을 위해서는 AMP가 키나아제 반응 완충액에 용해되어야 함을 유의해야한다.
가장 보편적 인 방법 인 인산화 부위의 확인을위한 질량 분광법의 사용은 단편화 과정에서 인산의 손쉬운 손실로 인해 종종 거짓 음성 신호를 생성하는 몇 가지 기술적 한계를 가지고있다. 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 인산화 부위를 찾는 두 번째 옵션이 될 수 있습니다. 그러나이 방법은 시간 소모적이며 비용이 많이 듭니다. 추정 인산화 부위를 스크리닝하기위한 대안 방법으로, 경쟁적인 펩타이드 방법은 추정 인산화 부위의 특성에 대한 통찰력을 얻는 편리하고 저렴한 방법 일 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 한국 정부가 후원하는 한국 연구 재단 (National Research Foundation for Korea) (No. 2015R1A2A1A10052663 및 No. 2014M1A3A3A02034698)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
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