Summary
מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.
Abstract
זרחון חלבון באתרים ספציפיים קובע את הקונפורמציה שלו ואת האינטראקציה עם מולקולות אחרות. לפיכך, זרחון חלבון משפיע על פונקציות ביולוגיות ומאפיינים של התא. כיום, השיטה הנפוצה ביותר לגילוי אתרי זירחון היא ניתוח כרומטוגרפי נוזלי / ספקטרומטריית מסה (LC / MS), שיטה מהירה ורגישה. עם זאת, זרחני פוספט זולה יחסית משוחררים לעתים קרובות phosphopeptides במהלך שלב פיצול, אשר לעתים קרובות מניב אותות שלילי שווא. במקרים כאלה, מסורתי assay קינאז במבחנה באמצעות מוטנטים מכוונים האתר יהיה מדויק יותר, אבל שיטה זו היא מייגעת זמן רב. לכן, שיטה חלופית באמצעות תחרות פפטיד עשוי להיות יתרון. מוטיב ההכרה הקונצנזוס של 5 'אדנוזין monophosphate המופעל קינאז חלבון (AMPK) הוקם 1 ו תוקף באמצעות פוזיטיון סריקה פפטיד סריקה התחתAy. לפיכך, אתרי זרחון AMPK עבור מצע הרומן יכול להיות ניבא ואושר על ידי מבחני התחרות פפטיד. בדו"ח זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים ונהלים עבור במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ידי המחשה AMPK בתיווך גורם גרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2) זרחון. כדי לאמת את האתר זרחן, ביצענו רציף assay קינאז במבחנה באמצעות מוטציה באתר ספציפי. בסך הכל, assay התחרות פפטיד מספק שיטה למסך אתרי זרחן פוטנציאליים פוטנציאליים כדי לזהות אתרים לאימות על ידי מוטציות האתר זרחן.
Introduction
חלבון זרחן ב שאריות מסוים ממלא תפקיד משמעותי במגוון רחב של תהליכים תאיים. לפיכך, הבנה של רשתות איתות דורשת זיהוי של אתרי זרחן ספציפיים. בנוסף, האתר זרחן קובע את ההשפעה על תפקוד החלבון, כי תחומים בודדים בתוך חלבון יש מבנים שונים פונקציות. פעילות הגורם הגרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2), גורם נוגד חמצון מפתח, הוא מוסדר דו כיווני באמצעות זרחון באתרים שונים. המחקרים שלנו התמקדו קינאזות כי לזרז את זרחון של Nrf2. תגובת הלחץ של Nrf2 נגד אתגר חמצוני מתרחשת במהירות, בעיקר באמצעות זרחון ב serine 40 ו מתווכת על ידי חלבון קינאז C (PKC) -δ, אשר מפעיל Nrf2 3 , 4 . לעומת זאת, Fyn מזרז את זרחון מעכב של Nrf2 ב tyrosine 5עבור פיקוח הדוק על הפעילות.
השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לגלות אתרי זרחון הוא כרומטוגרפיה נוזלית / ספקטרומטריית מסה (LC / MS) ניתוח. מהיר וזמן רגיש זרחון באתר מיפוי נתונים ניתן להפיק בדרך זו; עם זאת, יש כמה מגבלות טכניות, לעתים קרובות יצירת אותות מזויפים שלילי. כיסוי רצף גרוע לעתים קרובות מתרחשת ניתוח LC / MS. כדי לזהות אתרי זרחון, מידע על כיסוי מקסימלי של חומצות אמינו של חלבון נדרש 6 . פרוטאוליזה של חלבון של עניין עם מספר פרוטאזות במהלך הצעד העיכול עשוי להיות לעזור בשיפור רצף הכיסוי. מכשול נוסף לזיהוי שאריות זרחון הוא אובדן של חומצה זרחתית כי הוא נצפה לעתים קרובות עבור serine ו threonine-phosphideslated פפטידים 6 , 7 . זרחן פוספט moieties הם לעתים קרובותשוחרר מ phosphopeptides במהלך תהליך הפיצול 7 . האפשרות השנייה בעת חיפוש אתרי זרחון היא באמצעות שיטת microarray פפטיד. ניתן לבדוק את אתרי היעד kinase באמצעות שבב microarray המכיל שברי פפטיד נגזר חלבון של עניין. עם זאת, בשל הדרישה הציוד לייצור וזיהוי שבב microarray, שיטת microarray פפטיד נחשב זמן רב ויקר.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז יכול לשמש קינאז חלבון עם מוטיבים הכרה ידוע. אם מוטיב ההכרה של קונצנזוס של קינאז הוא הקימה, אתרי זרחון putative של המצע המועמד ניתן לחזות, ואת האותנטיות של האתרים ניתן לאמת. השיטה המשכנעת ביותר עבור הליך זה היא להראות את הביטול של זרחון בחלבון מוטנטי שבו תחזיתD שאריות מוחלפת בחומצת אמינו שאינה phosphorylatable ( כלומר, serine או threonine כדי alanine, tyrosine כדי פנילאלנין). עם זאת, ייצור ובידוד של חלבונים מוטנטים הוא זמן רב. כחלופה בשלב הראשוני של המחקר, assay פפטיד קינאז תחרותי הוא פשוט ונוח. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור assay מבחנה במבחנה פפטיד ו עבור אימות של אתר זרחון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בטיחות
זהירות: פרוטוקול זה משתמש [γ- 32 P] -ATP כדי להעריך את הפעילות של AMPK. זרחן -32 הוא איזוטופ רדיואקטיבי, המוביל בעיקר לקרינת בטא. מאז גודל של חלקיק בטא הוא קטן מאוד, זה יכול בקלות לחדור בגדים ועור. חשיפה חיצונית וחיצונית לקרינת ביתא עלולה להזיק לבריאות האדם, לרבות על ידי גרימת כוויות בעור ונזק לרקמות.
- בצע את כל השלבים המחייבים שימוש [γ- 32 P] -ATP באמצעות הגנה נאותה, כגון אקריליק מיגון.
- ודא כי כל אנשי מצויד dosimeters אישי אלקטרוניים (EPD) כדי לפקח על מידת החשיפה לקרינה מזיקה במהלך כל ההליכים.
- טיפול בקרינת קוד פתוח רק לאחר הדרכה מתאימה ואישור רגולטורי.
הערה: כאן, כל הניסויים נערכו לאחר השלמת האימון על השימוש בקורא פתוח בקוד פתוח ב- National National UnivErsity והאישור של ממשלת קוריאה (nssc.go.kr/nssc/en). - השליכו פסולת רדיואקטיבית לפי תקנות מקומיות.
הערה: להלן הוראות של המכון להגנת הסביבה ובטיחות של האוניברסיטה הלאומית של סיאול. להלן רשימת הרגולטורים בארצות הברית ובמדינות אירופה: ארצות הברית של אמריקה, ארצות הברית רגולטורית הוועדה הגרעינית (http://www.nrc.gov/); בריטניה, בריאות ובטיחות Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); צרפת, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); גרמניה, המשרד הפדרלי לאיכות הסביבה, שימור טבע, בניין בטיחות גרעינית (BMU) (http://www.bmu.de).
2. ויטרו תחרותי קינאז Assay
- בניית פפטידים תחרותיים
- לקבוע את מוטיב הקונצנזוס phosphorylated ידי AMPK.
הערה: AMPK מזהה מוטיב קונצנזוס, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. ברצף הקונצנזוס, Φ מייצג חומצות אמינו הידרופוביות ( כלומר, valine [V], leucine [L], methionine [M] ו- isoleucine [I]) ו- β מייצג חומצות אמינו בסיסיות ( כלומר, ליזין [K], ארגינין [ R], ו histidine [H]) 1 . - בחר שאריות סרין או threonine מתוך רצפים היעד על פי מוטיב הקונצנזוס לעיל. השתמש שלושה אתרים משוערים של Nrf2 אנושי (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 הכולל Ser558) 8 .
- מסחרי לסנתז 10-שאריות פפטידים לחקות את האתרים putative. השג את המוצר מסונתז כמו אבקת lyophilized עם טוהר גדול מ 98% עבור כל פפטיד.
- ממיסים את הפפטידים באמצעות חיץ kinase להשיג ריכוז של 71.667 גרם / L. אם פפטיד אינו מסיס במאגר kinase, להמיס אותו DMSO 20%. אם זה נשאר בלתי מסיס, פפטיד מחקה את לשיםניתן להרחיב את האתר האטום להגדלת המסיסות.
- לקבוע את מוטיב הקונצנזוס phosphorylated ידי AMPK.
- ב ויטרו מתחרה AMPK Assay קינאז
- הכן 5 × חיץ kinase כדלקמן: 100 מ"מ HEPES, pH 7.4; 25 מ"מ MgCl 2 ; 5 מ"מ EGTA; 5 מ"מ DTT; 125 מ"מ β-glycerophosphate (סרין / threonine phosphatase inhibitor); 5 mM Na 3 VO 4 (מעכב tyrosine phosphatase); 0.5% (V / V) Protease מעכב קוקטייל הגדר III, 1 מ"מ ATP קר; ו 500 מיקרומטר AMP.
הערה: AMP הוא מרכיב חיוני במאגר kinase לבדיקת פעילות AMPK. המאגר ניתן להשתמש כדי למדוד את הפעילות של שני סרין / threonine קינאזות ו טירוזין קינאזות. - להפשיר את החלבון רקומביננטי הבא פפטידים סינתטיים על הקרח: AMPK; Nrf2; ו oligopeptides # 1, # 2, ו # 3.
- הכן חיץ התגובה על הקרח: 0.15 מיקרוגרם של AMPK, 0.4 מיקרוגרם של Nrf2 (~ 4 pmol), 0.43 מ"ג של אוליגופפטיד (~ 300 nmol), ו 6 μL של חיץ 5 × קינאז. אDjust נפח הסופי μL 30 עם מים מזוקקים סטריליים (DW).
הערה: תוספת של [γ- 32 P] -ATP לאחר הכנת המאגר התגובה עשויה להפחית את האות רדיואקטיבי עקב autoposphorylation kinase.
- הכן 5 × חיץ kinase כדלקמן: 100 מ"מ HEPES, pH 7.4; 25 מ"מ MgCl 2 ; 5 מ"מ EGTA; 5 מ"מ DTT; 125 מ"מ β-glycerophosphate (סרין / threonine phosphatase inhibitor); 5 mM Na 3 VO 4 (מעכב tyrosine phosphatase); 0.5% (V / V) Protease מעכב קוקטייל הגדר III, 1 מ"מ ATP קר; ו 500 מיקרומטר AMP.
- הפעלת הריאקאנטים
הערה: כל התהליכים הבאים חייבים להתבצע תחת הגנה עם מגן אקרילי, מתלה או בלוק, כמו גם ציוד מגן אישי מתאים.- הגדר בלוקים חימום עד 30 מעלות צלזיוס לפני תחילת הניסוי.
- הוסף 1 μL של [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) כדי צינורות התגובה על הקרח. מערבבים את המאגר התגובה על ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים.
הערה: לרדיואקטיביות של 32 P יש אורך חיים קצר של כ 14 ימים 9 . התאם את עוצמת הקול על ידי בחינת מחצית החיים ( למשל, לאחר חודש אחד מן הייצור של [γ- 32 P] -ATP, להוסיף 4 μL של [γ- 32 P]-ATP לעשות 1 μCi). - דגירה המדגם בלוק חימום ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות. במהלך שלב זה, להכין 7.5% נתרן dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'לים. התאם את אחוז הג'ל בהתאם לגודל של חלבון המטרה.
- עצור את התגובה kinase על ידי הוספת 3 μL של 10 × SDS חיץ מדגם (10% (v / v) גליצרול, 20% (w / V) SDS, 15.42% (w / v) dithiothreitol, 90% (v / v) 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), ו 0.02% (w / v) bromophenol כחול). מערבבים את המאגר התגובה על ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים.
- הפעל את דגימות ב SDS-PAGE ג'ל 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ברציפות ב 140 V עבור 1 שעות.
הערה: הקו הכחול bromophenol בסוף הג'ל מכיל אותות רדיואקטיביים גבוהים במיוחד. מומלץ להסיר את הג'ל מתחת לקו הכחול לפני שתמשיך לשלב הבא כדי להפחית את אותות הרקע. - לאחר SDS-PAGE, הסר בעדינות את הג'ל מן גלגלית. מניחים את הג'ל בכוס לאעבור לשלב הבא.
- תקן את הג'ל עם חיץ קיבעון במשך 20 דקות (מתנול 50% ו 10% חומצה אצטית קרח).
- בעדינות להזיז את הג'ל על נייר סינון לכסות אותו עם עטיפה שקופה. שים לב כי ג'ל עשוי להיות קרוע בקלות בשלב זה. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
- רְאִיָה
- לחשוף את הג'ל או מסך זרחן או סרט רנטגן לילה (בדרך כלל כ 16 שעות).
הערה: ניתן להשתמש בחלון זרחן לאחר החשיפה לאור בהיר במיוחד. כאשר סרט רנטגן משמש, לחשוף את הג'ל על פני יומיים. סרטי רנטגן יש רגישויות נמוכות יותר מאשר מסכי זרחן. - סרוק את המסך זרחן עם imager זרחן. לייצא את התמונה כקובץ TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות.
- לאחר ויזואליזציה, להעביר את הג'ל לכוס או פלסטיק מיכל עבור Coomassie מבריק כחול (CBB) מכתים.
- לשטוף את הג'ל עם DW. מחק את DW ו כתם הג 'ל עם מגיב מכתים עבור 1 ח.
- מחק את מגיב destain את הג'ל עם DW עבור 1 שעות או לילה. מניחים את הג'ל בין סרטי פלסטיק שקופים (או שווה ערך) לסריקה באמצעות סורק משרדי.
- לחשוף את הג'ל או מסך זרחן או סרט רנטגן לילה (בדרך כלל כ 16 שעות).
3. ויטרו קינאז Assay באמצעות אתר ספציפי מוטציה
- אתר מוטגניזה מכוונת של pGEX-Nrf2
- מוטגני פריימר עיצוב
הערה: תכנון primages mutagenic תקין הוא קריטי עבור תוצאה מוצלחת של mutagenesis. להלן מספר שיקולים לעיצוב primers mutagenic. צור פריימר המורכב של 25 עד 45 בסיסים, עם המוטציה הרצויה באמצע הפריימר. פריימר צריך להיות 40-60% תוכן GC ולסיים עם אחד או יותר בסיסים G או C. וודאו כי T מ ' של פריימר שווה 78 מעלות צלזיוס או יותר על פי הנוסחה [T m = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / אורך בסיסים) -% mismatch].
הערה: לטהר אתפריימר כי טוהר שלה חשוב עבור יעילות המוטציה. ישנם מספר אתרי אינטרנט לעיצוב primers mutagenic.- פתח את תוכנית עיצוב פריימר עבור "עיצוב primers עבור mutagenesis מכוונת האתר" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- הדבקת רצף DNA של Nrf2 אנונימי (גישה למספר NM_006164.4) ובחר בלחצן "טען מתורגם".
- בחר את הסרין 558 שאריות מתוך רצף חומצות אמינו מתורגם כדי לשנות אלנין. באמצעות primager mutagenic, תחליף קודון עבור serine מ AGC ל GCC, עבור alanine.
- שקול אורך פריימר, T, ותוכן GC.
הערה: תחל מוטגני הוא סוף סוף מתוכנן כמו 5'-ctactgaaaaaacaactc GCC accttatatctcgaag-3 '.
- תגובה עבור סינתזה סטרנד מוטציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)
- הכן את תערובת התגובה PCR על הקרח: 10 × חיץ התגובה, 50 ng שלPGEX-GST-Nrf2, 125 ng של תחל קדימה, 125 ng של היפוך לאחור, 1 μL של תערובת dNTP (10 מ"מ כל), 2.5 U פולימרז DNA Pfu , ו DW סטרילי ל 50 μL.
- הפעל את PCR עבור pGEX-GST-Nrf2 מוטציה גדיל סינתזה עם תוכנית אופניים הבאה: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 18 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ב 55 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, ב 68 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות; ו 1 מחזור ב 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
הערה: בהתאם אורך פלסמיד, הפרמטרים רכיבה ניתן לשנות. - מניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות כדי לצנן את המגיבים עבור השלב הבא. לחלופין, לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- Dpn I העיכול ואת הבחירה של מוטציה פלסמיד
- הוסף 1 μL של Dnn אני הגבלה אנזים (10 U / μL) לכל אחד המגיבים לאחר הקירור. מערבבים ביסודיות בעדינות על ידי pipetting ו צנטריפוגה במשך 1 דקות.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לעכל הורים pGEX-GST-Nrf2 פעמיים,דנ"א תקוע.
- להפשיר בעדינות DH5 α תאים supercompetent על הקרח.
- הוסף 50 μL של מגיב ל 150 μL של מראש DH5 α מקורר תאים supercompetent ו דגירה על קרח במשך 30 דקות לפחות.
- מעבירים את הצינורות לחימום חימום מחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותם 90 s. מניחים אותם על קרח במשך 2 דקות.
- הוסף מראש לחמם מרק lysogeny (LB) לתאי DH5 α השתנה ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם רעד בסל"ד 180.
- מורחים את התאים הופכים על LB-ampicillin אגר צלחות דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: Ampicillin משמש לבחירה מאז פלסמיד GEX-GST-Nrf2 יש סמן עמיד ampicillin. השתמש אנטיביוטיקה מתאימה, בהתאם סמן ההתנגדות של mutasmized פלסמיד. - בחר מושבה אחת מהצלחת, להעביר אותו 5 מ"ל של LB-ampicillin, ו דגירה לילה זה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד.לאימות של רצף mutagenic, להעריך לפחות שלוש מושבות.
- חלץ DNA באמצעות ערכת miniprep DNA עבור ניתוח רצף DNA; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
- אמת את רצפי הדנ"א mutagenic באמצעות רצף DNA אוטומטי Analyzer בהתאם לפרוטוקול של היצרן. השתמש לפחות 200 ng של DNA לבנות עבור אימות רצפים מוטציה.
- מוטגני פריימר עיצוב
- טיהור של רקומביננטי GST-Nrf2 חלבון
- ביטוי של חלבון מוטגני GST-Nrf2 פיוז 'ן ב Escherichia coli
- להפוך את מוטגני pGEX-GST-Nrf2 פלסמיד לתוך תאים BL21 . לחסן מושבה אחת 25 מ"ל של מרק LB המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על מסובבים בן לילה.
- לחסן את התאים בתרבית 100 מ"ל של מרק LB המכיל ampicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) על יחס דילול 1: 100.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס על סיבובאו עד ספיגה ב 600 ננומטר מגיע סביב 0.4-0.8 (כ 4 שעות).
- הוסף 100 μL של 1 M IPTG ל 100 מ"ל של תאים בתרבית להכין ריכוז סופי של 1 mM IPTG.
- דגירה התאים על 30 מעלות צלזיוס על מסובבת במשך 6 שעות או לילה לביטוי חלבון.
- צנטריפוגה התאים ב XG 5000 במשך 20 דקות ו resuspend כדורי התא עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה חיידקי (25 מ"מ HEPES, 5 מ"מ EDTA, 2 מ"מ DTT, 0.1% CHAPS, 1 מיקרוגרם / מ"ל pepstatin, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, ו 1 מ"מ PMSF) על הקרח.
- Lyse תא כדורי באמצעות homogenizer קולי עם 2-s intervals עבור 2 דקות ב 50% של הפלט הכוח המרבי.
- צנטריפוגה התאים ב 12,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant.
- טיהור של רקומביננטי GST-Nrf2 חלבון
- הכן 200 μL של 50% (V / V) גלוטתיון אגרוס חרוזים לשטוף עם 1 מ"ל PBS (pH 7.3; 140 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 mM Na 2 4 , ו 1.8 mM KH 2 PO 4 ). לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 1 דקות. חזור על צעד כביסה שלוש פעמים.
- הוסף את lysate התא 200 μL מוכן של 50% (V / V) גלוטתיון אגרוס חרוזים ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס על מסובך סוף סוף עבור 2 שעות.
- איסוף חרוזי גלוטתיון agarose בשילוב עם חלבון GST-Nrf2 על ידי צנטריפוגה ב XG 500 למשך 1 דקות. הסר את supernatant באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 31 G.
- שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS (pH 7.3), כמו בשלב 1.
- הוסף 500 μL של חיץ elution (50 מ"מ טריס HCl ו 10 mM מופחת גלוטתיון, pH 8.0) כדי חרוזי גלוטתיון-אגרוס בשילוב עם GST-Nrf2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס על סוף סוף מעל מסובב במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב XG 500 דקות 1 ולאסוף את supernatant.
- שוב להוסיף 300 μL של חיץ elution כדי חרוזים חוזרים צעדים 3.2.2.5-3.2.2.6 פעמיים.
- אישור של חלבון GST-Nrf2 מטוהרים
- הכן 5 μL של המדגם להדמיה של כמות חלבון עם 0.5 מיקרוגרם של BSA חלבון סטנדרטי.
- הפעל את דגימות ב SDS-PAGE 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ולאחר מכן ב 140 V במשך 60 דקות.
- כתם ג'ל עם 0.1% CBB פתרון מכתים (0.1 גרם CBB R250, 40 מ"ל של מתנול 99%, 10 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, ו 50 מ"ל של H 2 מזוקקים) במשך 2 שעות ו destain (30 מ"ל של מתנול, 10 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, ו 60 מ"ל של מזוקק H 2 O) עד להקות מוצגים בבירור.
- מניחים את ג'ל destained על נייר סינון לכסות עם מעטפת שקוף. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
- לקבוע את כמות חלבון GST-Nrf2 מוטציה עם densitometry עבור assay במבחנה AMPK קינאז.
- ביטוי של חלבון מוטגני GST-Nrf2 פיוז 'ן ב Escherichia coli
- ויטרו AMPK פעילות Assay עם אתר ספציפי מוטציה
לֹאE: assay במבחנה AMPK קינאז מבוצעת על פי הצעדים 2.2-2.4, באמצעות 0.4 מיקרוגרם של מטוהרים wildtype GST-Nrf2 או מוטציה GST-Nrf2-S558A ללא מעכבי פפטיד. עקוב אחר כל הנחיות בטיחות הקרינה המתוארות בשלב 1.- הכן חיץ התגובה על הקרח עם 0.15 מיקרוגרם של AMPK, 0.4 מיקרוגרם של מוטציה או wildtype GST-Nrf2, ו 6 μL של חיץ 5 kinase. מלא עד 30 μL עם DW סטרילית.
- הוסף 1 μL של [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) כדי תגובה צינורות על הקרח. מערבבים את המאגר התגובה ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים צנטריפוגות.
- דגירה דגימות בבלוק חימום ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- עצור את התגובה kinase ידי הוספת 3 μL של חיץ 10 × SDS מדגם.
- הפעל ג'ל SDS-PAGE 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ולאחר מכן ב 140 V עבור 1 שעות.
- תקן את הג'ל עם חיץ קיבוע במשך 20 דקות, להעביר אותו על נייר הסינון, וכן לכסות את הג'ל עם שקףעטיפה.
- יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן לחשוף אותו לילה או למסך זרחן או סרט רנטגן.
- סרוק את המסך זרחן עם imager זרחן ולהזיז את הג 'ל על צינור זכוכית עבור מכתים CBB לאחר ויזואליזציה על פי צעד 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 ואיור 2 מדגימים את התוצאות מניסויים חוזרים ונשנים בעיתון שדווח בעבר. שלושה oligopeptides 10-שאריות שונים מחקה את אתרי היעד AMPK putative (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 המורכבת Ser558) היו מסונתז המשמשים מתחרים ב Assay קינאז מבחנה . זרחון של Nrf2 על ידי AMPK היה מאוד פחתה בנוכחות אוליגופפטיד # 3 ( איור 1 ). לאחר מכן, assay mutagenesis מכוונת האתר בוצע כדי לאמת את התוצאה של הניסוי peptidomimetic. בהתחשב אפקט מעכב של אוליגופפטיד # 3 על AMPK בתיווך זרחון של Nrf2 ( איור 1 ), יצרנו מוטציה S558A-Nrf2. רמות הזרחן הושוו בין nrf2 wildtype לבין S558A מוטציה באמצעות assay במבחנה AMPK קינאז. תחליף חומצת אמינו אחת של Nrf2 (Ser → Ala ב 558) מנע AMPK מ nff2 phosphorylating, המציין כי AMPK ישירות phosphorylates Nrf2 ב Ser558 ( איור 2 ).
איור 1: במבחנה תחרותי assay קינאז AMPK. ב מבחני קינאז מבחנה נעשו בנוכחות oligopeptides המצוין (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 כולל Ser558).
איור 2: במבחנה AMPK Kayase assay באמצעות אתר ספציפי חלבון מוטציה. מבחני מבחנה קינאז נעשו בנוכחות wildtYpe GST-Nrf2 או מוטציה S558A שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדרך פשוטה ונוחה להעריך את האותנטיות של אתרי זרחון חזוי בתיווך AMPK, כאן אנו מתארים assay קינאז במבחנה שניתן להשתמש בהם כדי לגלות אתר זרחן ספציפי באמצעות פפטידים תחרותיים כדי לאמת אותו באמצעות מוטציה אתר ספציפי . הנתונים המייצגים המתקבלים מתוך מבחנה פעילות מבחנה AMPK תחרותי תואם את התוצאות של assay באמצעות חלבון מוטציה האתר מכוונת, המציין כי assay התחרות פפטיד הוא כלי שימושי לקביעת אתר זרחון. שיטה זו שימשה גם במחקר זיהוי אתר ספציפי phosphorylated ידי PKC, אשר phosphorylates Nrf2 בסרין 40 3 . מאז פפטידים להתחרות באופן תחרותי לחלבון, העיקרון עשוי להיות מיושם גם על מבחנה במבחנה GST למטה למטה לזהות מוטיב מחייב 10 , 11 . יתר על כן, זה peptidomimeטיק השיטה עשויה גם להיות ישים לזיהוי של שינויים לאחר טרנסלציה אחר, כגון acetylation ב שאריות ליזין.
באמצעות פרוטוקול זה, זה עלול להיות קשה לפזר כמה פפטידים הידרופובי. אם פפטיד הוא מסיס במאגר kinase, להמיס אותו 20% DMSO עשוי להיות מועיל. כדי לפזר פפטידים הידרופובי ביותר, בניסיון הראשון לפזר אותו DMSO 100% ולאחר מכן לדלל את הפתרון עם חיץ קינאז. Sonication עשוי גם להיות לעזור להמיס את הפפטידים. אם זה נשאר מסיס, פפטיד מחקה את האתר putative צריך להיות המורחבת כדי להגדיל את מסיסות.
פרוטוקול הציג במאמר זה מתאר "במערכת חוץ גופית " שבו קינאז מטוהרים המצע מגיבים. במערכת המבחנה , הבדלים קטנים בריכוז של פפטידים תחרותיים לא ישפיע על התוצאות אלא אם הריכוז נמוך יותר מאשר חלבון המצע. Rהתוצאה המתקבלת מניסוי חוץ גופית כוללת את האפשרות הגלומה בהיותה אירוע ארטפקטואלי המיוצר על ידי קירבה מלאכותית וריכוז גבוה של המגיבים. כדי לחסל את הסיכוי הזה, את הפרשנות של הנתונים צריך להיות מלווה את התוצאות של ניסויים מבוססי תאים. אפשרות נוספת להשגת תוצאות חיוביות שגויות באמצעות פפטידים עשויה להיות תוצאה של שינויים בקונפורמציה של המצע ו / או בקינאז. כדי לא לכלול אפשרות זו, יש צורך לבצע ניסויים אישור עם חלבונים מוטנטים.
מצד שני, נתונים שליליים כוזבים יכול גם להיות מיוצר ממערכת זו. קינאזים רבים פועלים כמרכיבי חלבון בתוך הקשר הסלולר ודורשים שיתוף גורמים עבור פונקציונליות מלאה. AMPK הוא קומפלקס חלבון נציג Kinase המורכב AMPKα, AMPKβ ו AMPKγ יחידות משנה, ואת הכריכה של AMP למקטע AMPKγ יש צורך ההפעלה של קינאז. אכן, AMPKלא phosphorylate Nrf2 במאגר קינאז חינם AMP (נתונים לא מוצג). לכן, יש לציין כי AMP חייב להיות מומס במאגר התגובה kinase עבור מוצלח assay במבחנה .
השימוש של ספקטרומטריית מסה לזיהוי אתרי זירחון, השיטה הפופולרית ביותר, יש מספר מגבלות טכניות, לעתים קרובות מניבים אותות שליליים מזויפים על ידי אובדן של חומצה זרחתית במהלך תהליך הפיצול 7 . שיטה microarray פפטיד יכול להיות האפשרות השנייה לחפש אתרי זרחון. עם זאת, שיטה זו נחשבת זמן רב ויקר. כשיטה חלופית לאיתור אתרי זרחון משוערים, שיטת הפפטיד התחרותית עשויה להיות דרך נוחה וזולה כדי לקבל תובנה לגבי טבעו של אתר זרחון משוער.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (מס '2015R1A2A1A10052663 ו No. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F.
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
