Summary
I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.
Abstract
La fosforilazione della proteina in determinati siti determina la sua conformazione e l'interazione con altre molecole. Così, la fosforilazione delle proteine influenza le funzioni e le caratteristiche biologiche della cellula. Attualmente, il metodo più comune per la scoperta dei siti di fosforilazione è mediante analisi liquida / cromatografia / spettrometria di massa (LC / MS), un metodo rapido e sensibile. Tuttavia, le parti fosfatiche relativamente labili sono spesso rilasciate dai fosfopeptidi durante la fase di frammentazione, che spesso produce segnali falsi negativi. In questi casi, un test tradizionale in vitro di chinasi con mutanti localizzati sul sito sarebbe più preciso, ma questo metodo è laborioso e richiede tempo. Pertanto, un metodo alternativo che utilizza concorrenza peptidica può essere vantaggioso. Il motivo di riconoscimento del consenso di 5 'adenosina monofosfato-attivato proteina chinasi (AMPK) è stato stabilito 1 e è stato convalidato utilizzando una scansione di posizionamento peptide libreria asinoAy 2 . Così, i siti di fosforilazione AMPK per un nuovo substrato potrebbero essere predittuti e confermati dai test di concorrenza peptidica. In questa relazione descriviamo le fasi e le procedure dettagliate per il test di chinasi in concorrenza con oligopeptide in vitro illustrando la fosforilazione del fattore 2 (Nrf2) correlata con eritroide 2 a fattore nucleare mediata da AMPK. Per autenticare il sito di fosforilazione, abbiamo effettuato un test sequenziale in vitro di chinasi usando un mutante specifico del sito. Nel complesso, il test di concorrenza peptide fornisce un metodo per la screening di più potenziali siti di fosforilazione e per identificare siti per la convalida da parte dei mutanti del sito di fosforilazione.
Introduction
La fosforilazione della proteina in un residuo specifico svolge un ruolo significativo in una vasta gamma di processi cellulari. Pertanto, una comprensione delle reti di segnalazione richiede l'individuazione di specifici siti di fosforilazione. Inoltre, il sito di fosforilazione determina l'effetto sulla funzione proteica perché i singoli domini all'interno di una proteina possiedono strutture e funzioni diverse. L'attività del fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (Nrf2), un fattore chiave di trascrizione antiossidante, è bi-direzionale regolata attraverso la fosforilazione in diversi siti. I nostri studi si sono concentrati sulle chinasi che catalizzano la fosforilazione di Nrf2. La risposta dello stress di Nrf2 contro la sfida ossidativa si verifica rapidamente, principalmente attraverso la fosforilazione in serina 40 e mediata da proteina chinasi C (PKC) -δ, che attiva Nrf2 3 , 4 . Al contrario, Fyn catalizza la fosforilazione inibitoria di Nrf2 alla tirosina 568 per un controllo stretto dell'attività 5 .
Il metodo più comune per scoprire i siti di fosforilazione è la cromatografia liquida / analisi di spettrometria di massa (LC / MS). I dati di mappatura del sito di fosforilazione rapida e altamente sensibile possono essere generati in questo modo; Tuttavia, ha diverse limitazioni tecniche, generando spesso segnali falsi negativi. Nella LC / MS analisi si riscontra frequentemente la scarsa sequenza di sequenza. Per identificare i siti di fosforilazione è richiesta informazioni sulla copertura ottimale di aminoacidi di una proteina 6 . La proteolisi della proteina di interesse con diverse proteasi durante la fase di digestione può aiutare a migliorare la copertura delle sequenze. Un altro ostacolo per l'identificazione dei residui di fosforilazione è l'immediata perdita di acido fosforico spesso osservata per i peptidi 6 , 7 , serine e treonina fosforilati. Le parti di fosfati Labile sono spessoRilasciato da fosfopeptidi durante il processo di frammentazione 7 . La seconda opzione nella ricerca di siti di fosforilazione sta utilizzando un metodo di microarray peptidico. È possibile schermare i siti di destinazione di chinasi usando un chip di microarray contenente frammenti peptidi derivanti da una proteina di interesse. Tuttavia, a causa del requisito di attrezzatura per la produzione e la rilevazione di un chip microarray, il metodo del microarray peptide è considerato tempo e costoso.
Per superare queste sfide, un test di chinasi in concorrenza in vitro con oligopeptide può essere utilizzato per una chinasi di proteina con motivi riconosciuti di riconoscimento. Se si stabilisce il motivo di riconoscimento del consenso di una chinasi, si possono prevedere siti di fosforilazione supposto di un substrato candidato e l'autenticità dei siti può essere convalidata. Il metodo più convincente per questa procedura è quello di mostrare l'abrogazione della fosforilazione in una proteina mutante in cui la predizioneD è sostituito da un aminoacido non fosforilabile ( vale a dire, sierina o treonina ad alanina, tirosina alla fenilalanina). Tuttavia, la produzione e l'isolamento delle proteine mutanti richiedono molto tempo. Come alternativa alla fase iniziale della ricerca, il concorso di peptide chinasi competitivo è semplice e conveniente. Qui descriviamo un protocollo per un test di concorrenza peptidico in vitro e per la convalida del sito di fosforilazione.
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Protocol
1. Sicurezza
ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza [γ- 32 P] -ATP per valutare l'attività di AMPK. Fosforo-32 è un isotopo radioattivo, che emette in gran parte le radiazioni beta. Poiché la dimensione di una particella beta è estremamente piccola, può facilmente penetrare l'abbigliamento e la pelle. L'esposizione esterna ed interna a radiazioni beta possono essere dannose per la salute umana, anche causando ustioni cutanee e danni ai tessuti.
- Eseguire tutti i passaggi che richiedono l'uso di [γ- 32 P] -ATP utilizzando una protezione adeguata, come la schermatura acrilica.
- Assicurarsi che tutto il personale sia dotato di dosimetri elettronici elettronici (EPD) per monitorare l'entità dell'esposizione alla radiazione nociva durante tutte le procedure.
- Gestire le radiazioni a sorgente aperta solo dopo un'appropriata formazione e approvazione regolamentare.
NOTA: Qui, tutti gli esperimenti sono stati condotti dopo la conclusione della formazione sull'uso di radiazioni a fonte aperta all'Univ di Seoul NationalL'approvazione del governo coreano (nssc.go.kr/nssc/en). - Smaltire i rifiuti radioattivi in base alle normative locali.
NOTA: Qui sono state seguite le direttive dell'Istituto per la protezione ambientale e la sicurezza dell'Università Nazionale di Seoul. Di seguito sono elencati i regolatori degli Stati Uniti e dei paesi europei: gli Stati Uniti d'America, la Commissione per la Nuclear Regulatory (http://www.nrc.gov/); Regno Unito, responsabile della salute e della sicurezza (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Francia, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); E la Germania, Ministero Federale per l'Ambiente, la Conservazione della Natura, la Costruzione e la Sicurezza Nucleare (BMU) (http://www.bmu.de).
2. Analisi competitiva della cinasi in Vitro
- Costruzione di peptidi competitivi
- Determinare il motivo di consenso fosforilato da AMPK.
NOTA: AMPK riconosce il motivo di consenso,# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Nella sequenza di consenso, Φ rappresenta gli amminoacidi idrofobi ( vale a dire valine [V], leucina [L], metionina [M] e isoleucina [I]) e β rappresenta amminoacidi di base ( cioè la lisina [K] R] e istidina [H]) 1 . - Selezionare residui di serina o treinina da sequenze bersaglio secondo il suddetto motivo di consenso. Utilizzare tre siti supposti di umano Nrf2 (# 1, 148-157 composto da Ser153; # 2, 330-339 composto da Ser335; e # 3, 553-562 composto da Ser558) 8 .
- Commercializza sinteticamente 10 peptidi residui che imitano i siti presuntivi. Ottenere il prodotto sintetizzato come polvere liofilizzata con una purezza superiore al 98% per ogni peptide.
- Sciogliere i peptidi utilizzando un tampone di chinasi per ottenere una concentrazione di 71,667 g / L. Se un peptide non è solubile in un tampone di chinasi, sciogliere nel 20% di DMSO. Se rimane insolubile, un peptide che imita il putPuò essere esteso per aumentare la solubilità.
- Determinare il motivo di consenso fosforilato da AMPK.
- In Vitro Competizione AMPK Kinase Assay
- Preparare il tampone di chinasi 5 × come segue: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-glicerofosfato (inibitore della serina / treonina fosfatasi); 5 mM Na 3 VO 4 (inibitore della tirosina fosfatasi); 0,5% (v / v) Set Cocktail inibitore della Proteasi III, 1 mM ATP freddo; E 500 μM AMP.
NOTA: AMP è una componente essenziale del tampone di chinasi per verificare l'attività AMPK. Il buffer può essere utilizzato per misurare l'attività di entrambe le chinasi di serina / treonina e le tirosin-chinasi. - Sciogliere le seguenti proteine ricombinanti e peptidi sintetici sul ghiaccio: AMPK; Nrf2; E gli oligopeptidi # 1, # 2 e # 3.
- Preparare un tampone di reazione sul ghiaccio: 0,15 μg di AMPK, 0,4 μg di Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg di oligopeptide (~ 300 nmol) e 6 μl di 5 × chinasi tampone. UNAppoggiare il volume finale a 30 μL con acqua distillata sterile (DW).
NOTA: L'aggiunta di [γ- 32 P] -ATP dopo la preparazione del tampone di reazione può ridurre il segnale radioattivo dovuto all'autophosphorylation di chinasi.
- Preparare il tampone di chinasi 5 × come segue: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-glicerofosfato (inibitore della serina / treonina fosfatasi); 5 mM Na 3 VO 4 (inibitore della tirosina fosfatasi); 0,5% (v / v) Set Cocktail inibitore della Proteasi III, 1 mM ATP freddo; E 500 μM AMP.
- Correre i reagenti
NOTA: Tutti i processi di seguito riportati devono essere eseguiti sotto protezione con uno scudo, una cremagliera o un blocco acrilico, nonché adeguati dispositivi di protezione individuale.- Impostare i blocchi di riscaldamento a 30 ° C prima di iniziare l'esperimento.
- Aggiungere 1 μL di [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) ai tubi di reazione sul ghiaccio. Mescolare il tampone di reazione pipettando su e giù diverse volte.
NOTA: La radioattività di 32 P ha un'emivita breve di circa 14 giorni 9 . Regolare il volume considerando l'emivita ( ad esempio, dopo un mese dalla produzione di [γ- 32 P] -ATP, aggiungere 4 μL di [γ- 32 P]-ATP per fare 1 μCi). - Incubare il campione nel blocco di riscaldamento a 30 ° C per 15-30 min. Durante questa fase, preparare gel di elettroforesi con gel di sodio dodecil-solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) di 7,5%. Regolare la percentuale del gel in base alla dimensione della proteina bersaglio.
- Arrestare la reazione di chinasi con l'aggiunta di 3 μL di 10 volte di SDS campione di tampone (10% (v / v) glicerolo, 20% (w / v) SDS, 15,42% (w / v) dithiotreitolo, 90% (v / M Tris-HCl (pH 6,8) e 0,02% (w / v) blu bromofenolo). Mescolare il tampone di reazione pipettando su e giù diverse volte.
- Eseguire i campioni in un gel 7.5% SDS-PAGE a 70 V per 20 minuti e continuamente a 140 V per 1 h.
NOTA: La linea blu bromofenolo alla fine del gel contiene segnali radioattivi estremamente elevati. Si raccomanda di rimuovere il gel sotto la linea blu prima di passare alla fase successiva per ridurre i segnali di sfondo. - Dopo SDS-PAGE, togliere delicatamente il gel dal caster. Posizionare il gel in un bicchiere di vetroUbe per il passo successivo.
- Fissare il gel con il buffer di fissazione per 20 minuti (50% metanolo e 10% acido acetico glaciale).
- Spostare delicatamente il gel sul filtro e coprire con un involucro trasparente. Si noti che il gel può essere facilmente tagliato a questo punto. Asciugare il gel con un asciugatore a vuoto ad 80 ° C per 1 h.
- visualizzazione
- Esporre il gel a uno schermo di fosforo oa un film a raggi X durante la notte (di solito per circa 16 ore).
NOTA: uno schermo di fosforo può essere riutilizzato dopo l'esposizione alla luce extra-brillante. Quando viene utilizzato un film a raggi X, esporre il gel per due giorni. I film a raggi X hanno sensibilità inferiori rispetto alle schermate di fosforo. - Scansione dello schermo di fosforo con un impianto di fosforo. Esportare l'immagine come file TIFF o bitmap ad alta risoluzione.
- Dopo la visualizzazione, spostare il gel in un contenitore in vetro o in plastica per la colorazione brillante Coomassie blu (CBB).
- Lavare il gel con DW. Scartare il DW e macchiaE con il reagente di colorazione per 1 h.
- Scartare il reagente e destainare il gel con DW per 1 ora o durante la notte. Posizionare il gel tra film trasparenti in plastica (o equivalente) per eseguire la scansione con uno scanner per ufficio.
- Esporre il gel a uno schermo di fosforo oa un film a raggi X durante la notte (di solito per circa 16 ore).
3. Analisi in vitro di cinasi usando un mutante specifico del sito
- Mutagenesi del sito di pGEX-Nrf2
- Mutageno Primer Design
NOTA: La progettazione di primer mutageni appropriati è fondamentale per l'esito positivo della mutagenesi. Di seguito sono riportate alcune considerazioni per la progettazione di primer mutagenici. Creare un primer costituito da 25 a 45 basi, con la mutazione desiderata nel mezzo del primer. Il primer dovrebbe avere un contenuto GC del 40-60% e terminare con una o più basi G o C. Assicurarsi che il T m del primer sia pari a 78 ° C o superiore secondo la formula [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / lunghezza delle basi) -% mismatch].
NOTA: Purificare ilPrimer perché la sua purezza è importante per l'efficienza della mutazione. Ci sono diversi siti web per la progettazione di primer mutageni.- Aprire il programma di progettazione di primer per "la progettazione di primer per la mutagenesi localizzata" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Incollare la sequenza umana Nrf2 DNA (Access No. NM_006164.4) e selezionare il pulsante "carica tradotto".
- Selezionare il residuo della serina 558 dalla sequenza di aminoacidi tradotta per essere trasformata in alanina. Utilizzando il primer mutageno, sostituire il codone per la serina da agc a gcc, per alanina.
- Considerare la lunghezza del primer, T m e il contenuto del GC.
NOTA: Il primer mutagenico è finalmente progettato come 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reazione per la sintesi della fila di mutanti usando la reazione della catena della polimerasi (PCR)
- Preparare la miscela di reazione PCR in ghiaccio: tampone di reazione di 10 ×, 50 ng diPGEX-GST-Nrf2, 125 ng di primer in avanti, 125 ng di primer inverso, 1 μL di dNTP mix (10 mM ciascuno), 2,5 U Pfu DNA polimerasi e sterile DW a 50 μL.
- Eseguire il PCR per la sintesi del filamento del pGEX-GST-Nrf2-mutante con il seguente programma di ciclismo: 1 ciclo a 95 ° C per 30 s; 18 cicli a 95 ° C per 30 s, a 55 ° C per 1 min e a 68 ° C per 90 s; E 1 ciclo a 68 ° C per 5 min.
NOTA: A seconda della lunghezza del plasmide, i parametri di ciclo possono essere modificati. - Mettere su ghiaccio per 2 minuti per raffreddare i reagenti per il passo successivo. In alternativa, conservarli a 4 ° C durante la notte.
- Digestione Dpn I e Selezione di un Plasmide Mutante
- Aggiungere 1 μl di enzima di restrizione Dpn I (10 U / μL) a ciascuno dei reagenti dopo il raffreddamento. Mescolare accuratamente e delicatamente pipettando e centrifugare per 1 min.
- Incubare a 37 ° C per 2 ore per digerire il pGEX-GST-Nrf2 parentale con doppio-Stranded DNA.
- Scollegare delicatamente le cellule super-competenti DH5 α sul ghiaccio.
- Aggiungere 50 μL del reagente a 150 μl di cellule supercompetenti DH5 α pre-refrigerate e incubare su ghiaccio per almeno 30 min.
- Trasferire i tubi in un blocco di riscaldamento preriscaldato a 42 ° C e lasciarli per 90 s. Metterli su ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere il brodo di lysogeny pre-riscaldato (LB) alle cellule α DH5 trasformate e incubare a 37 ° C per 1 h con agitazione a 180 giri / min.
- Distribuire le cellule trasformate sulle piastre LB-ampicillin agar e incubare per una notte a 37 ° C.
NOTA: L'ampicillina viene usata per la selezione poiché il plasmide GEX-GST-Nrf2 ha il marker di resistenza dell'ampicillina. Utilizzare adeguati antibiotici, a seconda del marker di resistenza del plasmide mutagenizzato. - Scegliere una singola colonia dalla piastra, trasferirla a 5 ml di LB-ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 180 giri / min.Per verificare la sequenza mutagena, valutare almeno tre colonie.
- Estrarre il DNA usando un kit di DNA miniprep per l'analisi della sequenza di DNA; Seguire il protocollo del produttore.
- Verificare le sequenze di mutagenesi del DNA utilizzando un analizzatore di sequenza automatica di DNA secondo il protocollo del produttore. Utilizzare almeno 200 ng del DNA construct per la verifica delle sequenze di mutanti.
- Mutageno Primer Design
- Purificazione della proteina GST-Nrf2 ricombinante
- Espressione della proteina fusione mutagenica GST-Nrf2 in Escherichia coli
- Trasformare il plasmidico muGEN-gST-Nrf2 in cellule BL21 . Inoculare una singola colonia in 25 ml di brodo LB contenente ampicillina (100 μg / ml) e incubare a 37 ° C su un rotatore durante la notte.
- Inoculare le cellule colte in 100 ml di brodo LB contenente ampicillina (100 μg / ml) ad un rapporto di diluizione 1: 100.
- Incubare a 37 ° C in un rotativoO fino a quando l'assorbanza a 600 nm raggiunge circa 0,4-0,8 (circa 4 ore).
- Aggiungere 100 μl di 1 M IPTG a 100 ml di cellule coltivate per preparare una concentrazione finale di 1 mM IPTG.
- Incubare le cellule a 30 ° C su un rotatore per 6 ore o durante la notte per l'espressione di proteine.
- Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 20 min e risospendere le pellicole di cellule con 1 mL di tampone batterico di lisi (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.1% CHAPS, 1 μg / mL peprostatin, 0.5 μg / mL leupeptina, E 1 mM PMSF) su ghiaccio.
- Lyse la pellicola cellulare utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni con intervalli di 2 secondi per 2 min al 50% della potenza massima.
- Centrifugare le cellule a 12.000 g per 15 minuti a 4 ° C e raccogliere il surnatante.
- Purificazione della proteina GST-Nrf2 ricombinante
- Preparare 200 μl di 50% (v / v) brani di glutatione-agarosio e lavare con 1 mL di PBS (pH 7,3, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 4 e 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Raccogliere le perline centrifughe a 500 × g per 1 minuto. Ripetere il passo di lavaggio tre volte.
- Aggiungere il lisato cellulare alle preparate 200 μL di margine di glutatione-agarosio del 50% (v / v) e incubare a 4 ° C su un rotatore a fine-fine per 2 ore.
- Raccogliere le perle di glutatione-agarosio combinate con la proteina GST-Nrf2 per centrifugazione a 500 xg per 1 min. Rimuovere il surnatante usando una siringa da 1 ml con un ago da 31 G.
- Lavare le perle con 1 ml di PBS (pH 7,3), come nel punto 1.
- Aggiungere 500 μl di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl e 10 mM ridotto glutatione, pH 8,0) ai branchi di glutatione-agarosio combinati con GST-Nrf2. Incubare a 4 ° C su un rotatore di fine-fine per 30 min.
- Centrifugare a 500 xg per 1 min e raccogliere il surnatante.
- Di nuovo aggiungere 300 μL di tampone di eluizione alle perle e ripetere i passaggi 3.2.2.5-3.2.2.6 due volte.
- Conferma della proteina GST-Nrf2 purificata
- Preparare 5 μL del campione per la visualizzazione della quantità di proteine con 0.5 μg di proteina standard BSA.
- Eseguire i campioni in un gel 7.5% SDS-PAGE a 70 V per 20 minuti e successivamente a 140 V per 60 min.
- Macellare il gel con soluzione di colorazione CBB 0,1% (0,1 g CBB R250, 40 ml di metanolo 99%, 10 ml di acido acetico glaciale e 50 ml di H 2O distillato) per 2 h e destaina (30 ml di metanolo, 10 mL di acido acetico glaciale e 60 mL di H 2 O distillato) fino a quando le bande sono chiaramente mostrate.
- Posizionare il gel destained sul filtro e coprire con un involucro trasparente. Asciugare il gel con un asciugatore a vuoto ad 80 ° C per 1 h.
- Determinare la quantità di proteina mutante GST-Nrf2 con densitometria per il saggio AMPK kinasi in vitro .
- Espressione della proteina fusione mutagenica GST-Nrf2 in Escherichia coli
- In vitro analisi di attività AMPK con un mutante specifico del sito
NONE: Il test in vitro di AMPK chinasi viene eseguito secondo le fasi 2.2-2.4, utilizzando 0.4 μg di GST-Nrf2 selvatico tipo purificato o il mutante GST-Nrf2-S558A senza inibitori del peptide. Seguire tutte le linee guida per la sicurezza delle radiazioni descritte nel passaggio 1.- Preparare un tampone di reazione sul ghiaccio con 0.15 μg di AMPK, 0.4 μg di mutante o wildtype GST-Nrf2 e 6 μL di 5 chinasi buffer. Riempire fino a 30 μL con DW sterile.
- Aggiungere 1 μL di [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) ai tubi di reazione sul ghiaccio. Mescolare il tampone di reazione pipettando su e giù diverse volte e centrifugare.
- Incubare i campioni in un blocco di riscaldamento a 30 ° C per 30 min.
- Interrompere la reazione di chinasi aggiungendo 3 μl di tampone di campione SDS 10x.
- Eseguire in un gel 7.5% SDS-PAGE a 70 V per 20 minuti e successivamente a 140 V per 1 h.
- Fissare il gel con il buffer di fissaggio per 20 minuti, spostarlo sulla carta filtrante e coprire il gel con un trasparenteEnt wrapper.
- Asciugare il gel con l'asciugatrice a vuoto ad 80 ° C per 1 ora e poi esporla durante la notte allo schermo fosforico oa un film a raggi X.
- Scansione dello schermo di fosforo con un fosforo e spostare il gel in un tubo di vetro per la colorazione CBB dopo la visualizzazione secondo la fase 2.4.
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Representative Results
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i risultati di esperimenti ripetuti nella carta precedentemente riportata 8 . Sono stati sintetizzati tre differenti oligopeptidi di 10 residui che imitavano i siti di destinazione AMPK (# 1, 148-157 comprendenti Ser153; # 2, 330-339 composti da Ser335 e # 3, 553-562 composti da Ser558). Vitro chinasi. La fosforilazione di Nrf2 da AMPK è stata notevolmente diminuita in presenza di oligopeptide # 3 ( Figura 1 ). Successivamente, un test di mutagenesi diretto sul sito è stato eseguito per convalidare il risultato dell'esperimento peptidomimetico. Data l'effetto inibitorio dell'oligopeptide # 3 sulla fosforilazione mediata da AMPK di Nrf2 ( Figura 1 ), abbiamo generato un mutante S558A-Nrf2. I livelli di fosforilazione sono stati confrontati tra il tipo selvatico Nrf2 e il S558A utilizzando il saggio AMPK kinasi in vitro . La singola sostituzione aminoacidica di Nrf2 (Ser → Ala a 558) ha impedito all'AMPK di fosforilazione di Nrf2, indicando che AMPK direttamente fosforilizza Nrf2 a Ser558 ( Figura 2 ).
Figura 1: Analisi in vitro di AMPK chinasi competitivi. I dosaggi in vitro di chinasi sono stati effettuati in presenza degli oligopeptidi indicati (n. 1, 148-157 comprendenti Ser153; # 2, 330-339 comprendenti Ser335; e # 3, 553-562 comprendenti Ser558).
Figura 2: Analisi in vitro di AMPK chinasi usando una proteina mutante specifica del sito. I dosaggi in vitro di chinasi sono stati effettuati in presenza di wildtYpe GST-Nrf2 o il suo mutante S558A.
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Discussion
Come un modo semplice e conveniente per valutare l'autenticità dei siti di fosforilazione previsti mediati da AMPK, qui descriviamo un dosaggio in vitro di chinasi che può essere utilizzato per scoprire uno specifico sito di fosforilazione utilizzando peptidi competitivi e per verificarlo usando un mutante specifico del sito . I dati rappresentativi ottenuti dal saggio di attività AMPK competitivo in vitro hanno raggiunto i risultati di un saggio utilizzando una proteina mutante diretta sul sito, indicando che il test di concorrenza peptide è uno strumento utile per determinare un sito di fosforilazione. Questo metodo è stato utilizzato anche nello studio che identifica il sito specifico fosforilato da PKCδ, che fosforilazione di Nrf2 in serina 40 3 . Dato che i peptidi si legano competitivamente a una proteina, il principio può essere applicato anche ad un test in pull-down GST in vitro per identificare un motivo di legame 10 , 11 . Inoltre, questo peptidomimeIl metodo tic può anche essere applicabile all'identificazione di altre modificazioni post-traslazionali, come l'acetilazione nei residui di lisina.
Utilizzando questo protocollo, può essere difficile dissolvere alcuni peptidi idrofobi. Se un peptide è insolubile in un tampone di chinasi, la sua dissoluzione nel 20% di DMSO può essere utile. Per dissolvere peptidi estremamente idrofobici, prima tentare di dissolverlo in 100% DMSO e quindi diluire la soluzione con un tampone di chinasi. La sonicazione può anche aiutare a sciogliere i peptidi. Se rimane insolubile, un peptide che imita il sito presunto dovrebbe essere esteso per aumentare la solubilità.
Il protocollo introdotto in questo documento descrive un "sistema in vitro " in cui reagisce una chinasi purificata e un substrato. Nel sistema in vitro , piccole differenze nella concentrazione di peptidi competitivi non influenzeranno i risultati a meno che la concentrazione non sia inferiore alla proteina del substrato. Il rEsult ottenuto da un esperimento in vitro include la possibilità intrinseca di essere un evento artificiale prodotto dalla prossimità artificiale e dall'alta concentrazione di reagenti. Per eliminare questa prospettiva, l'interpretazione dei dati dovrebbe essere accompagnata dai risultati degli esperimenti basati su cellule. Un'altra possibilità per ottenere risultati falsi positivi utilizzando peptidi può essere dovuta a alterazioni nella conformazione del substrato e / o riconoscimento di chinasi. Per escludere questa possibilità, è necessario effettuare esperimenti di conferma con proteine mutanti.
D'altra parte, i dati falsi negativi possono essere prodotti anche da questo sistema. Molte chinasi agiscono come complessi proteici all'interno del contesto cellulare e richiedono co-fattori per la piena funzionalità. AMPK è un complesso rappresentativo di proteine chinasi composto da subunità AMPKα, AMPKβ e AMPKγ e il legame di AMP alla subunità AMPKγ è necessario per l'attivazione della chinasi. Anzi, AMPKNon ha fosforilato Nrf2 in un tampone di chinasi privo di AMP (dati non mostrati). Pertanto, va notato che l'AMP deve essere sciolto nel tampone di reazione di chinasi per un esito in vitro efficace.
L'uso della spettrometria di massa per l'identificazione dei siti di fosforilazione, il metodo più diffuso, presenta varie limitazioni tecniche, generando spesso segnali falsi negativi per la facile perdita di acido fosforico durante il processo di frammentazione 7 . Un metodo microarray peptide può essere la seconda opzione per la ricerca di siti di fosforilazione. Tuttavia, questo metodo è considerato tempo e costoso. Come metodo alternativo per lo screening dei siti di fosforilazione supposta, il metodo del peptide competitivo può essere un modo conveniente e poco costoso per ottenere una visione della natura di un sito di fosforilazione ipotetica.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea finanziata dal governo coreano (MSIP) (No. 2015R1A2A1A10052663 e No. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
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- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
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- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
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