Summary
Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.
Abstract
A fosforilação de proteínas em locais específicos determina sua conformação e interação com outras moléculas. Assim, a fosforila�o proteica afecta as fun�es biol�icas e as caracter�ticas da c�ula. Atualmente, o método mais comum para descobrir sítios de fosforilação é a análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS), um método rápido e sensível. Contudo, as porções de fosfato relativamente lábeis são frequentemente libertadas dos fosfopéptidos durante o passo de fragmentação, o que muitas vezes produz sinais falso-negativos. Nesses casos, um ensaio de quinase in vitro tradicional utilizando mutantes dirigidos ao local seria mais preciso, mas este método é laborioso e demorado. Por conseguinte, pode ser vantajoso um método alternativo utilizando a competição de péptidos. O motivo de reconhecimento de consenso da quinase de proteína activada por monofosfato de adenosina 5 '(AMPK) foi estabelecido 1 e foi validado utilizando um colo de biblioteca de peptídeo de localização de varrimentoAy 2 . Assim, os locais de fosforila�o de AMPK para um novo substrato poderiam ser previstos e confirmados pelos ensaios de competi�o de p�tidos. Neste relatório, descrevemos os passos e procedimentos detalhados para o ensaio de quinase competitiva de oligopéptido in vitro ilustrando a fosforilação do fator 2 do factor nuclear 2 mediado por AMPK (Nrf2). Para autenticar o local de fosforila�o, realizou-se um ensaio sequencial in vitro de quinase utilizando um mutante espec�ico do local. Em geral, o ensaio de competição de péptidos proporciona um método para pesquisar múltiplos locais de fosforilação potenciais e para identificar locais para validação pelos mutantes de sítio de fosforilação.
Introduction
A fosforilação de proteínas num resíduo específico desempenha um papel significativo numa vasta gama de processos celulares. Assim, a compreensão das redes de sinalização requer a identificação de locais específicos de fosforilação. Além disso, o local de fosforilação determina o efeito na função da proteína porque os domínios individuais dentro de uma proteína possuem estruturas e funções diferentes. A atividade do fator nuclear 2 relacionado ao eritróide 2 (Nrf2), um importante fator de transcrição antioxidante, é regulada bidirecionalmente através da fosforilação em diferentes locais. Nossos estudos têm se concentrado nas quinases que catalisam a fosforilação de Nrf2. A resposta ao estresse de Nrf2 contra o desafio oxidativo ocorre rapidamente, principalmente através da fosforilação na serina 40 e mediada pela proteína quinase C (PKC) -δ, que ativa Nrf2 3 , 4 . Por outro lado, Fyn catalisa a fosforilação inibitória de Nrf2 na tirosina 568 para controlo rigoroso da actividade 5 .
O método mais comum utilizado para descobrir locais de fosforilação é a cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS). Dados de mapeamento de sítios de fosforilação rápidos e altamente sensíveis podem ser gerados deste modo; No entanto, tem várias limitações técnicas, muitas vezes gerando sinais falsos negativos. Frequentemente ocorre uma fraca cobertura de sequências na análise de LC / MS. Para identificar locais de fosforila�o, �necess�ia informa�o sobre a cobertura m�ima de amino�idos de uma prote�a 6 . A proteólise da proteína de interesse com várias proteases durante o passo de digestão pode ser de ajuda na melhoria da cobertura da sequência. Outro obstáculo para a identificação de resíduos de fosforilação é a fácil perda de ácido fosfórico que é frequentemente observada para os péptidos fosforilados com serina e treonina 6,7. As porções fosfato labílicas são frequentementeLibertado dos fosfopéptidos durante o processo de fragmentação 7 . A segunda opção quando se procura locais de fosforila�o �utilizar um m�odo de microarrays de p�tidos. É possível pesquisar os locais alvo de cinase utilizando um chip de microarray contendo fragmentos peptídicos derivados de uma proteína de interesse. No entanto, devido ao requisito de equipamento para a produção e detecção de um chip de microarray, o método de microarray de péptido é considerado demorado e dispendioso.
Para ultrapassar estes desafios, pode ser utilizado um ensaio de quinase concorrente de oligopéptido in vitro para uma proteína quinase com motivos de reconhecimento conhecidos. Se o motivo de reconhecimento de consenso de uma quinase for estabelecido, os sítios de fosforilação putativos de um substrato candidato podem ser previstos e a autenticidade dos sítios pode ser validada. O método mais convincente para este procedimento é mostrar a anulação da fosforilação numa proteína mutante na qual o predicteD é substituído por um aminoácido não fosforilável ( isto é, serina ou treonina em alanina, tirosina em fenilalanina). No entanto, a produção e isolamento de proteínas mutantes é demorada. Como uma alternativa na fase inicial da pesquisa, o ensaio de peptídeo quinase competitivo é simples e conveniente. Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de competição de péptidos in vitro e para a validação do local de fosforilação.
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Protocol
1. Segurança
ATENÇÃO: Este protocolo utiliza [γ- 32 P] -ATP para avaliar a actividade da AMPK. Fósforo-32 é um isótopo radioativo, em grande parte emitindo radiação beta. Uma vez que o tamanho de uma partícula beta é extremamente pequeno, ele pode facilmente penetrar roupas e pele. Tanto a exposição externa quanto a interna à radiação beta podem ser prejudiciais para a saúde humana, inclusive causando queimaduras na pele e danos nos tecidos.
- Realizar todas as etapas que exigem a utilização de [γ- 32 P] -ATP usando proteção adequada, como a blindagem acrílica.
- Assegurar que todo o pessoal esteja equipado com dosímetros eletrônicos pessoais (EPD) para monitorar a extensão da exposição a radiação nociva durante todos os procedimentos.
- Manuseie radiação de fonte aberta somente após treinamento apropriado e aprovação regulamentar.
NOTA: Aqui, todas as experiências foram conduzidas após a conclusão do treinamento sobre o uso de radiação de fonte aberta na Universidade Nacional de SeulE a aprovação do governo coreano (nssc.go.kr/nssc/en). - Eliminar os resíduos radioactivos de acordo com as regulamentações locais.
NOTA: Aqui, as diretrizes do Instituto de Proteção Ambiental e Segurança da Universidade Nacional de Seul foram seguidas. Os seguintes são uma lista de reguladores nos Estados Unidos e países europeus: Os Estados Unidos da América, Estados Unidos Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Reino Unido, Executivo de Saúde e Segurança (HSE) (http://www.hse.gov.uk); França, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); E Alemanha, Ministério Federal do Ambiente, Conservação da Natureza, Construção e Segurança Nuclear (BMU) (http://www.bmu.de).
2. Ensaio de Kinase Competitiva In Vitro
- Construção de Peptídeos Competitivos
- Determinar o motivo consenso fosforilado por AMPK.
NOTA: AMPK reconhece o motivo consenso, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Na sequência de consenso, Φ representa aminoácidos hidrofóbicos ( isto é, valina [V], leucina [L], metionina [M] e isoleucina [I]) e β representa aminoácidos básicos ( ie, lisina [K], arginina [ R], e histidina [H]) 1 . - Selecionar res�uos de serina ou treonina das sequ�cias alvo de acordo com o motivo de consenso acima. Utilizar três locais putativos de Nrf2 humano (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335 e # 3, 553-562 compreendendo Ser558) 8 .
- Sintetizam comercialmente peptídeos com 10 resíduos que imitam os sítios putativos. Obter o produto sintetizado como um pó liofilizado com uma pureza superior a 98% para cada péptido.
- Dissolver os péptidos utilizando um tampão de cinase para se obter uma concentração de 71,667 g / L. Se um péptido não é solúvel num tampão de quinase, dissolva-o em DMSO a 20%. Se permanecer insolúvel, um péptido imitando oPode ser prolongado para aumentar a solubilidade.
- Determinar o motivo consenso fosforilado por AMPK.
- Ensaio de Cinase AMPK Competitivo In Vitro
- Preparar 5 x cinase tampão como se segue: 100 mM HEPES, pH 7,4; MgCl2 25 mM; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; P-glicerofosfato 125 mM (inibidor de serina / treonina fosfatase); 5 mM de Na3VO4 (inibidor de tirosina fosfatase); 0,5% (v / v) de Conjunto de Cocktail Inibidor de Protease III, ATP frio 1 mM; E 500 μM de AMP.
NOTA: AMP é um componente essencial do buffer de quinase para testar a atividade AMPK. O tampão pode ser utilizado para medir a actividade tanto de serina / treonina cinases como de tirosina quinases. - Descongelar a seguinte proteína recombinante e peptídeos sintéticos em gelo: AMPK; Nrf2; E oligopéptidos # 1, # 2 e # 3.
- Preparar um tampão de reacção em gelo: 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg de oligopéptido (~ 300 nmol) e 6 μL de tampão quinase 5 ×. UMAAjustar o volume final a 30 μL com água destilada estéril (DW).
NOTA: A adição de [γ- 32 P] -ATP após a preparação do tampão de reacção pode reduzir o sinal radioactivo devido à autofosforilação da cinase.
- Preparar 5 x cinase tampão como se segue: 100 mM HEPES, pH 7,4; MgCl2 25 mM; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; P-glicerofosfato 125 mM (inibidor de serina / treonina fosfatase); 5 mM de Na3VO4 (inibidor de tirosina fosfatase); 0,5% (v / v) de Conjunto de Cocktail Inibidor de Protease III, ATP frio 1 mM; E 500 μM de AMP.
- Executando os Reagentes
NOTA: Todos os processos abaixo devem ser realizados sob proteção com escudo acrílico, rack ou bloco, bem como equipamento de proteção pessoal apropriado.- Ajustar os blocos de aquecimento a 30 ° C antes de iniciar a experiência.
- Adicionar 1 μL de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) aos tubos de reacção em gelo. Misture o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes.
NOTA: A radioactividade de 32 P tem uma semi-vida curta de aproximadamente 14 dias 9 . Ajustar o volume considerando a meia-vida ( por exemplo, após um mês da produção de [γ- 32 P] -ATP, adicionar 4 μL de [γ- 32 P]-ATP para fazer 1 μCi). - Incubar a amostra no bloco de aquecimento a 30 ° C durante 15-30 min. Durante este passo, preparar geles de electroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 7,5% (SDS-PAGE). Ajustar a percentagem do gel de acordo com o tamanho da proteína alvo.
- Parar a reacção de quinase por adição de 3 μL de tampão de amostra 10 × SDS (glicerol a 10% (v / v), SDS a 20% (p / v), ditiotreitol a 15,42% (p / v) Tris-HCl (pH 6,8) e azul de bromofenol a 0,02% (p / v). Misture o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes.
- Executar as amostras num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e continuamente a 140 V durante 1 h.
NOTA: A linha azul de bromofenol na extremidade do gel contém sinais radioactivos extremamente elevados. Recomenda-se remover o gel abaixo da linha azul antes de prosseguir para a próxima etapa para reduzir os sinais de fundo. - Depois de SDS-PAGE, remover suavemente o gel do rodízio. Coloque o gel em um copoPara o próximo passo.
- Fixar o gel com tampão de fixação durante 20 min (50% de metanol e 10% de ácido acético glacial).
- Mova suavemente o gel para papel de filtro e cubra-o com um invólucro transparente. Note-se que o gel pode ser facilmente rasgado nesta etapa. Secar o gel com um secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h.
- Visualização
- Exponha o gel a uma tela de fósforo ou a uma película de raios-X durante a noite (geralmente durante aproximadamente 16 h).
NOTA: Uma tela de fósforo pode ser reutilizada após a exposição à luz extra-brilhante. Quando se utiliza um filme de raios X, exponha o gel durante dois dias. Os filmes de raios-X têm menor sensibilidade do que as telas de fósforo. - Digitalizar a tela de fósforo com um fósforo imager. Exporte a imagem como um arquivo TIFF ou bitmap de alta resolução.
- Após a visualização, mover o gel para um recipiente de vidro ou plástico para Coomassie azul brilhante (CBB) coloração.
- Lave o gel com DW. Descarte o DW eE gel com o reagente de coloração durante 1 h.
- Descartar o reagente e remover o gel com DW durante 1 h ou durante a noite. Coloque o gel entre filmes plásticos transparentes (ou o equivalente) para digitalizar com um scanner de escritório.
- Exponha o gel a uma tela de fósforo ou a uma película de raios-X durante a noite (geralmente durante aproximadamente 16 h).
3. Ensaio de Quinase In Vitro Utilizando um Mutante Site-specific
- Mutagénese dirigida ao local de pGEX-Nrf2
- Mutagenic Primer Design
NOTA: A concepção de iniciadores mutagénicos adequados é fundamental para o sucesso da mutagénese. Seguem-se algumas considerações para a concepção de iniciadores mutagénicos. Criar um primer composto de 25 a 45 bases, com a mutação desejada no meio do primer. O iniciador deve ter 40-60% de teor de GC e terminar com uma ou mais bases G ou C. Certifique-se de que a Tm do primer é igual a 78 ° C ou superior de acordo com a fórmula [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / comprimento das bases) -% de discordância].
NOTA: Purifique oPorque a sua pureza é importante para a eficiência da mutação. Existem vários sites para a concepção mutagênicos primers.- Abra o programa do projeto do primer para "projetar primers para a mutagénese dirigida" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Colar a seqüência de DNA Nrf2 humano (Nº de acesso NM_006164.4) e selecionar o botão "upload traduzido".
- Seleccione o resíduo de serina 558 da sequência de aminoácidos traduzida para ser alterado para alanina. Utilizando o iniciador mutagénico, substitua o codão pela serina de agc a gcc, por alanina.
- Considere o comprimento do primer, T m , eo teor de GC.
NOTA: O iniciador mutagénico é finalmente concebido como 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reacção para síntese de cadeia mutante utilizando reacção em cadeia de polimerase (PCR)
- Preparar a mistura de reacção de PCR sobre gelo: tampão de reacção 10x, 50 ng dePGEX-GST-Nrf2, 125 ng de iniciador directo, 125 ng de iniciador inverso, 1 μL de mistura de dNTP (10 mM cada), ADN polimerase Pfu de 2,5 U e DW estéril para 50 μL.
- Executar a PCR para a síntese da cadeia mutante pGEX-GST-Nrf2 com o seguinte programa de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 30 s; 18 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 55 ° C durante 1 min e a 68 ° C durante 90 s; E 1 ciclo a 68 ° C durante 5 min.
NOTA: Dependendo do comprimento do plasmídeo, os parâmetros de ciclagem podem ser alterados. - Colocá-lo em gelo durante 2 min para arrefecer os reagentes para a próxima etapa. Alternativamente, guarde-os a 4 ° C durante a noite.
- Digestão de Dpn I e Selecção de um Plasmídeo Mutante
- Adicionar 1 μl de enzima de restrição Dpn I (10 U / μL) a cada um dos reagentes após arrefecimento. Misturar cuidadosamente e suavemente por pipetagem e centrifugar durante 1 min.
- Incubar a 37 ° C durante 2 h para digerir parental pGEX-GST-Nrf2 dupla-Trançado.
- Descongelar suavemente DH5 α células supercompetentes em gelo.
- Adicionar 50 μL do reagente a 150 μL de células supercompetentes DH5 α pré-arrefecidas e incubar em gelo durante pelo menos 30 min.
- Transfira os tubos para um bloco de aquecimento pré-aquecido a 42 ° C e deixe-os por 90 s. Colocá-los em gelo por 2 min.
- Adicionar caldo de lisogenia pré-aquecido (LB) às células α DH5 transformadas e incubar a 37 ° C durante 1 h com agitação a 180 rpm.
- Espalhar as células transformadas em placas de agar LB-ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C.
NOTA: A ampicilina é utilizada para selecção uma vez que o plasmídeo GEX-GST-Nrf2 tem o marcador de resistência à ampicilina. Utilizar antibióticos apropriados, dependendo do marcador de resistência do plasmídeo mutagenizado. - Escolher uma única colônia da placa, transferi-la para 5 mL de LB-ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação a 180 rpm.Para a verificação da sequência mutagénica, avaliar pelo menos três colónias.
- Extrair ADN utilizando um kit de miniprep de ADN para análise de sequência de ADN; Siga o protocolo do fabricante.
- Verificar as sequências de ADN mutagénicas utilizando um analisador automático de sequência de ADN de acordo com o protocolo do fabricante. Utilizar pelo menos 200 ng da construção de ADN para a verificação de sequências mutantes.
- Mutagenic Primer Design
- Purificação da Proteína Recombinante GST-Nrf2
- Expressão da proteína de fusão GST-Nrf2 mutagénica em Escherichia coli
- Transformar o plasm�eo mutag�ico pGEX-GST-Nrf2 em c�ulas BL21 . Inocular uma única colónia em 25 mL de caldo LB contendo ampicilina (100 μg / mL) e incubar a 37 ° C num rotador de um dia para o outro.
- Inocular as células cultivadas em 100 mL de caldo LB contendo ampicilina (100 μg / mL) a uma razão de diluição de 1: 100.
- Incubar a 37 ° C sobre uma rotaçãoOu até a absorvância a 600 nm atingir cerca de 0,4-0,8 (aproximadamente 4 h).
- Adicionar 100 μL de IPTG 1 M a 100 mL de células cultivadas para preparar uma concentração final de IPTG 1 mM.
- Incubar as células a 30 ° C num rotador durante 6 h ou durante a noite para a expressão da proteína.
- Centrifugar as células a 5000 xg durante 20 min e ressuspender os sedimentos celulares com 1 mL de tampão de lise bacteriana (HEPES 25 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM, CHAPS a 0,1%, pepstatina a 1 ug / ml, leupeptina 0,5 ug / mL, E PMSF 1 mM) em gelo.
- Lixar os grânulos de células utilizando um homogeneizador ultra-sónico com intervalos de 2 s durante 2 min a 50% da potência máxima produzida.
- Centrifugar as células a 12.000 × g durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante.
- Purificação da Proteína GST-Nrf2 Recombinante
- Preparar 200 μL de esferas de glutationa-agarose a 50% (v / v) e lavar com 1 mL de PBS (pH 7,3; NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2 10 mM 4 , e 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Recolher as esferas por centrifugação a 500 xg durante 1 min. Repita o passo de lavagem três vezes.
- Adicionar o lisado celular aos 200 μL preparados de esferas de glutationa-agarose a 50% (v / v) e incubar a 4 ° C num rotador de extremidade sobre extremidade durante 2 h.
- Recolher as esferas de glutationa-agarose combinadas com a proteína GST-Nrf2 por centrifugação a 500 xg durante 1 min. Remover o sobrenadante usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 31 G.
- Lavar as esferas com 1 mL de PBS (pH 7,3), como no passo 1.
- Adicionar 500 μL de tampão de eluição (Tris-HCl 50 mM e glutationa reduzida 10 mM, pH 8,0) às esferas de glutationa-agarose combinadas com GST-Nrf2. Incubar a 4 ° C em um rotador de ponta-final durante 30 min.
- Centrifugar a 500 xg durante 1 min e recolher o sobrenadante.
- Adicionar novamente 300 μL de tampão de eluição às contas e repita os passos 3.2.2.5-3.2.2.6 duas vezes.
- Confirmação da Proteína GST-Nrf2 Purificada
- Preparar 5 μL da amostra para visualização da quantidade de proteína com 0,5 μg de proteína BSA padrão.
- Executar as amostras num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e depois a 140 V durante 60 min.
- Mancha o gel com 0,1% de solução de coloração CBB (0,1 g de CBB R250, 40 mL de metanol a 99%, 10 mL de ácido acético glacial e 50 mL de H2O destilado) durante 2 h e destain (30 mL de metanol, 10 mL de ácido acético glacial e 60 mL de H2O destilada) até que as faixas sejam claramente mostradas.
- Coloque o gel desprotegido no papel de filtro e cubra com um invólucro transparente. Secar o gel com um secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h.
- Determinar a quantidade de proteína GST-Nrf2 mutante com densitometria para o ensaio in vitro de quinase de AMPK.
- Expressão da proteína de fusão GST-Nrf2 mutagénica em Escherichia coli
- Ensaio de actividade de AMPK in vitro com um mutante espec�ico do local
NÃOE: O ensaio de AMPK quinase in vitro é realizado de acordo com os passos 2.2-2.4, utilizando 0,4 μg de GST-Nrf2 de tipo selvagem purificado ou o mutante GST-Nrf2-S558A sem inibidores peptídicos. Siga todas as diretrizes de segurança radiológica descritas na etapa 1.- Preparar um tampão de reacção em gelo com 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de GST-Nrf2 mutante ou de tipo selvagem e 6 μL de tampão quinase. Encha até 30 μL com DW estéril.
- Adicionar 1 μL de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) aos tubos de reacção em gelo. Misturar o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes e centrifugar.
- Incubar as amostras num bloco de aquecimento a 30 ° C durante 30 min.
- Parar a reacção de quinase adicionando 3 μL de tampão de amostra SDS 10x.
- Executar num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e depois a 140 V durante 1 h.
- Fixar o gel com o tampão de fixação durante 20 min, movê-lo sobre o papel de filtro e cobrir o gel com umaEnv.
- Secar o gel com o secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h e depois expô-lo durante a noite para uma tela de fósforo ou uma película de raios X.
- Digitalizar a tela de fósforo com um marcador de fósforo e mover o gel para um tubo de vidro para coloração CBB após a visualização de acordo com o passo 2.4.
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Representative Results
A Figura 1 e a Figura 2 demonstram os resultados de experiências repetidas no artigo anteriormente relatado 8 . Foram sintetizados três oligosséptidos de 10 resíduos diferentes imitando os locais alvo de AMPK putativos (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335 e # 3, 553-562 compreendendo Ser558) e utilizados como concorrentes no Vitro . A fosforila�o de Nrf2 por AMPK foi grandemente diminu�a na presen� do oligop�tido # 3 ( Figura 1 ). Em seguida, realizou-se um ensaio de mutagénese dirigida para validar o resultado da experiência peptidomimética. Dado o efeito inibitório do oligopéptido # 3 na fosforilação mediada por AMPK de Nrf2 ( Figura 1 ), gerou-se um mutante S558A-Nrf2. Os níveis de fosforilação foram comparados entre o Nrf2 de tipo selvagem e o S558A utilizando o ensaio in vitro de quinase AMPK. A única substituição de aminoácidos de Nrf2 (Ser @ Ala a 558) impediu a AMPK de fosforilar Nrf2, indicando que a AMPK fosforila directamente Nrf2 em Ser558 ( Figura 2 ).
Figura 1: Ensaio de quinase AMPK competitiva in vitro . Os ensaios de quinase in vitro foram realizados na presença dos oligopéptidos indicados (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335; e # 3, 553-562 compreendendo Ser558).
Figura 2: Ensaio de cinase de AMPK in vitro utilizando uma prote�a mutante espec�ica do local. Os ensaios de quinase in vitro foram realizados na presença de wildtYpe GST-Nrf2 ou o seu mutante S558A.
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Discussion
Como uma maneira simples e conveniente para avaliar a autenticidade dos locais de fosforilação previstos mediados por AMPK, aqui descrevemos um ensaio de quinase in vitro que pode ser utilizado para descobrir um local de fosforilação específico utilizando péptidos competitivos e para verificar isto utilizando um mutante específico do local . Os dados representativos obtidos a partir do ensaio de actividade de AMPK competitivo in vitro combinaram os resultados de um ensaio utilizando uma proteína mutante dirigida ao local, indicando que o ensaio de competição de péptidos é uma ferramenta útil para determinar um local de fosforilação. Este método também foi utilizado no estudo identificando o local específico fosforilado por PKCδ, que fosforila Nrf2 na serina 40 3 . Uma vez que os péptidos se ligam competitivamente a uma proteína, o princípio também pode ser aplicado a um ensaio inibidor de GST in vitro para identificar um motivo de ligação 10 , 11 . Além disso, este peptidomimeTic pode também ser aplicável à identificação de outras modificações pós-translacionais, tais como acetilação em resíduos de lisina.
Utilizando este protocolo, pode ser difícil dissolver alguns péptidos hidrofóbicos. Se um péptido for insolúvel num tampão de cinase, pode ser útil dissolvê-lo em DMSO a 20%. Para dissolver os péptidos extremamente hidrofóbicos, primeira tentativa de dissolvê-la em DMSO a 100% e depois diluir a solução com um tampão de quinase. A sonicação pode também ser de ajuda na dissolução dos péptidos. Se permanecer insolúvel, um péptido imitando o sítio putativo deve ser estendido para aumentar a solubilidade.
O protocolo introduzido neste documento descreve um "sistema in vitro " no qual uma quinase purificada e substrato são feitos reagir. No sistema in vitro , pequenas diferenças na concentração de péptidos competitivos não irão afectar os resultados a menos que a concentração seja inferior à proteína do substrato. O rObtida a partir de um experimento in vitro inclui a possibilidade inerente de ser um evento artefactual produzido por proximidade artificial e a alta concentração de reagentes. Para eliminar essa perspectiva, a interpretação dos dados deve ser acompanhada pelos resultados de experiências baseadas em células. Outra possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos utilizando péptidos pode ser devida a alterações na conformação do substrato e / ou reconhecimento de quinase. Para excluir esta possibilidade, é necessário fazer experimentos de confirmação com proteínas mutantes.
Por outro lado, dados falsos negativos também podem ser produzidos a partir deste sistema. Muitas cinases atuam como complexos proteicos dentro do contexto celular e requerem co-fatores para a funcionalidade completa. AMPK é um complexo de proteína quinase representativo composto por subunidades AMPKa, AMPKβ e AMPKy, e a ligação de AMP à subunidade AMPKy é necessária para a activação da quinase. Na verdade, a AMPKNão fosforilaram Nrf2 num tampão de cinase livre de AMP (dados não apresentados). Assim, deve notar-se que a AMP tem de ser dissolvida no tampão de reacção de quinase para um ensaio in vitro bem sucedido.
A utilização da espectrometria de massas para a identificação de sítios de fosforilação, o método mais popular, apresenta diversas limitações técnicas, muitas vezes gerando sinais falso-negativos pela fácil perda de ácido fosfórico durante o processo de fragmentação 7 . Um método de micro-arranjo de péptidos pode ser a segunda opção para procurar locais de fosforilação. No entanto, este método é considerado demorado e caro. Como um m�odo alternativo para rastreio de locais de fosforila�o putativos, o m�odo de pept�eo competitivo pode ser uma maneira conveniente e barata de obter introspec�o na natureza de um s�io de fosforila�o putativo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (nº 2015R1A2A1A10052663 e nº 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
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- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
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- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
