Summary
여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.
Abstract
건강 악성 조직 중 어느 하나에서 이종 세포 집단은 상기 DNA 결합 염료 훽스트 33342. 셀이 "측면 인구"유출하는 차동 기능을 특징으로 세포 집단을 포함 할 수있다 훽스트 33342 후 유세포 방법을 이용하여 식별 될 수있다 염료는 자외선 (UV) 레이저에 의해 여기된다. 많은 세포 유형의 측면 인구는 stem- 또는 전구와 같은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나 모든 종류의 세포는 식별 측면 인구가 있습니다. 다니오의 레 리오 (rerio), 제브라 피쉬는 T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL)의 생체 내 모델의 강력한을 가지고 있지만 이러한 제브라 피쉬 T-ALLS가 있는지 여부 측면 인구는 알 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 제브라 피쉬 T-ALL의 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우선, 제브라 피쉬의 T-ALL은 하나의 세포 단계의 배아로 TOL2 플라스미드의 미세 주입을 통해 생성됩니다. 종양 무대로 성장했으면하는 그들은 항문의 절반 이상으로 확장T-ALL 세포를 수확 할 수 있습니다. 그 다음, 세포를 Hoechst 33342로 염색하고 측면 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 검사한다. 이 방법은 zebrafish T-ALL 연구에 광범위한 응용이 있습니다. 제브라 피쉬에는 이러한 측면 세포가 암 줄기 세포와 유사한지를 확인하는 알려진 세포 표면 마커는 없지만 생체 내 기능 이식 분석이 가능합니다. 또한, 단일 세포 transcriptomics이 측면 인구 세포의 유전 특징을 식별하는 데 적용 할 수 있습니다.
Introduction
측면 집단 분석은 세포막상의 ATP 결합 카세트 (ABC) 전달체 단백질의 높은 수치로 인해 DNA 결합 염료 Hoechst 33342를 유출시키는 조직 내 특정 세포의 증진 된 능력을 이용합니다. Hoechst 33342 염료를 유출하는 세포는 염료가 UV 레이저로 여기 된 후 이중 파장 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 분석법은 처음에 마우스 조혈 줄기 세포 (HSC) 1 을 확인하는 데 사용되었지만 이후 많은 조직과 암에서 줄기 / 전구 세포 집단을 확인하는 데 사용되었습니다 (참고 문헌 2 참조). 그러나 모든 세포 집단이 부수적 인 집단을 가지고있는 것은 아니며, 모든 부 모집단이 줄기 / 전구 세포를 위해 풍부하지는 않습니다.
제브라 피쉬는 인간의 암을 연구하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 3 , 4 , 전통적인 murine암의 델. Zebrafish의 배아는 외부 형질 전환 및 암 개시 및 진행을 포함한 병리학 적 과정의 생체 내 관찰을 용이하게 수정 된 광학적 분명합니다. 현재까지, 측면 인구 분석은 잠재적 인 줄기 또는 전구 세포만을 조혈 모세포를 식별하는 제브라 피쉬의 신장 골수에 적용, 그리고 어떤 제브라 피쉬 암 모델 5, 6되었습니다 감지합니다.
T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)는 형태 학적으로 인간 T-ALL 7, 8, 11 유전자와 유사하다. T-ALL은, 인간의, 소아 10 ~ 15 %와 모든 경우 9 성인의 25 %를 차지하는 공격적인 악성 종양이다. T-ALL의 치료가 개선 된 반면, 재발은 여전히 일반적이며 예후와 연관되어 있습니다. T-ALL 종양은 heterogene입니다조직 구성 단위 및 백혈병 개시 세포 (저소득) 등 다양한 종양 세포의 소집단가 포함되어 있습니다. 저소득 그들의 단일 세포에서 종양 전체를 자라게 할 수있는 능력, 및 종양 세포 집단 내 저소득의 주파수에 의해 정의는 제한 희석 이식 분석 (LDA)을 통해 수신자로 변화하는 셀 용량을 이식하여 계산 될 수있다. LDA 실험은 저소득 8, 10, 11의 주파수를 계산하기 위해 제브라 수행 하였지만, 이러한 판정은 제 지나고되고 저소득의 잠재적 분리를 허용하지 않는다. 따라서, 방법은 전향 적으로 암 줄기 세포의 활동에 대한 풍부한 인구가 부족한 분리합니다. 식별 및 지브라 피쉬 T-ALLS 측으로부터 세포 집단을 분리하는 것은 이러한 결함을 해결하기위한 첫 단계이다.
여기에 제시된 프로토콜은 효율적으로 zebr에서 T-ALL 종양을 생성하는 방법에 대해 설명합니다(tol2-mediated transgenesis)를 이용하여 T-ALL 종양 세포를 수확하고 Hoechst 33342로 염색하여 세포의 부작용을 확인한다. 제브라 피쉬 T-ALL 에 대한 미래 의 생체 내 실험 은 측면 세포가 LIC를 강화 시키거나 다른 줄기 - 또는 전구체 - 유사 성질을 갖는지 여부를 포함 할 수있다.
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Protocol
제브라 피쉬의 모든 절차는 시카고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시카고 대학은 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며.
Zebrafish의 1. 생성 및 분리 찬란 레이블이 T-ALL 세포
- 동계 제브라 피쉬 배아에 미세 주입
- 녹색 형광 단백질 (rag2 : GFP) C-myc 유전자 및 rag2 : 시판되는 키트를 사용하여, 원형 rag2 격리 TOL2의 트랜스 (플라스미드 DNA의 소스 재료의 도표 참조) (12)에 의해 인식 된 역전 된 말단 반복 부를 포함하는 플라스미드 DNA를 상기 DNA를 용출 멸균한다.
참고 : GFP는이 연구에서 사용되지만, 어떤 형광 단백질이 작동합니다. - PCS2 - 트랜스 준비 (TOL2) RNA
- t 참조 (시판 키트를 사용하여 TOL2 플라스미드 DNA를 분리플라스미드 DNA의 소스 재료의 그 테이블) (12) 및 멸균의 DNA를 용출시킨다.
- 플라스미드를 선형화하는 적절한 버퍼를 NotI 제한 효소 5 개 유닛으로 1 시간 동안 37 ° C에서 TOL2의 DNA 1 μg의 부화. 20 분 동안 65 ° C에서을 NotI을 열 - 불 활성화.
- 시판 RNA 전사 세트 (13)를 사용하는 선형화 된 DNA로부터의 SP6 RNA 폴리머 라제와 RNA를 TOL2의 전사. -80 ° C에서 단일 사용 씩의 RNA를 저장합니다.
- C-myc의 플라스미드 DNA, 250 ng의 rag2 : GFP 플라스미드 DNA, RNA의 TOL2 150 NG 및 페놀 레드 0.5 μL rag2 250 NG를 첨가하여 얼음에 주입 혼합을 준비한다. 핵산 분해 효소가없는 물 10 μL에 볼륨을 조절합니다.
- 이전 맛 음료 다음, 유리 모세관으로부터 뽑아 마이크로 인젝터와 바늘을 이용하여 단일 세포 단계 동계 지브라 피쉬의 배아 세포에 주입 혼합 ~ 1 거리 nL 주입lished 방법 8, 14.
참고 : 처녀 생식 (15)에 의해 생성 된 동계 제브라 피쉬는 이식 후 유전 적 이질성과 면역 거부 반응을 제거하기 위해 여기에 사용됩니다. 그러나, 야생형 제브라 또는 임의의 변형이 사용될 수있다. - 24 시간 및 48 시간 후 주사 16 죽은 낙후 또는 잘못된 배아를 제거한다.
- 주입 후 6 일째에 물고기 시스템에 주입 된 물고기를 놓고 표준 프로토콜 6 항 키우기.
- 녹색 형광 단백질 (rag2 : GFP) C-myc 유전자 및 rag2 : 시판되는 키트를 사용하여, 원형 rag2 격리 TOL2의 트랜스 (플라스미드 DNA의 소스 재료의 도표 참조) (12)에 의해 인식 된 역전 된 말단 반복 부를 포함하는 플라스미드 DNA를 상기 DNA를 용출 멸균한다.
- 주입 지브라 피쉬 검사 및 종양 성장을 모니터링
- 8 이십일일 후 분사에서 epifluorescent 현미경 (: 40분의 470, 발광 대역 50분의 525 여기 대역)을 이용하여 GFP 형광을위한 배양 접시와 화면 배아 매체의 액적 단일 주입 유충 놓는다.
참고 : 시간 Zebrafish의 유충ave는 rag2 : c-myc와 rag2 : GFP를 모두 통합하여 녹색 형광성 흉선 (양성 어류)을 가지며 이미 흉선을 넘어 악성 녹색 형광 세포의 확장을 나타낼 수 있습니다. GFP + 흉선이있는 모든 물고기는 GFP + T-ALL을 개발합니다. 플라스미드의 통합을 입증하지 않는 유충은 녹색 형광 세포 (음성 생선)를 갖지 않을 것이다. - 다른 탱크에 (형광 부족에 따라) 부정적인 물고기를 분리하고 사후 28 일 및 35 일에 다시 물고기를 모니터하십시오. 주사 후 28 일 및 35 일에, 선별 전 물고기 시스템 물에서 0.02 % 완충 된 트리 세인 (MS-222)으로 물고기를 마취시킨다.
- 일주일에 세 번씩 종양 성장을 모니터링하기 위해 형광성으로 분류 된 흉선 또는 형광성 종양에 양성인 각 제브라 피쉬 애벌레를 개별 탱크에 놓습니다.
- 8 이십일일 후 분사에서 epifluorescent 현미경 (: 40분의 470, 발광 대역 50분의 525 여기 대역)을 이용하여 GFP 형광을위한 배양 접시와 화면 배아 매체의 액적 단일 주입 유충 놓는다.
- 일차 종양 어류에서 형광 표지 된 T-ALL 세포의 수집
- 적어도 0.9 20 ㎖의 인산염 완충 식염수 (FBS / PBS)에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 우 태아 혈청으로 준비한다.
- 헤파린 나트륨의 한 바이알 (300 개)에 FBS / PBS 1 ㎖를 추가한다.
- 선택 물고기 몸의 50 % 이상에서 종양 베어링, 또는 그 물고기는 어려움 먹고 수영을 가지고. tricaine 또는 얼음물에 담가을 했나봐하여 물고기를 희생. 아가미의 움직임과 심장 박동의 부족 (a)에 의해 죽음을 확인합니다.
- 물고기의 머리를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
- 과도한 적혈구를 제거하기 위해 헤파린 용액과 물고기의 구멍을 씻으십시오.
- 피펫을 사용하여, 물고기의 체강 내에 헤파린 용액 (단계 1.3.2에서 제조) 100 μL를 주입. 밖으로 유출 모든 액체를 제거합니다 (그것은 혈액 세포를 포함) 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫.
- 다시 몸을 씻어 신선한 피펫 팁을 사용합니다. 적어도 세 세척을 수행하거나 밖으로 유출 액체는 BL의 무료 나타날 때까지짐 우드.
- 이를 추가 분석에 사용되지 않으므로, 단계 1.3.5.1 및 1.3.5.2에 세척 모든 액체 폐기.
- 백혈병 세포를 수집합니다.
- 물고기의 체강 내에 FBS / PBS 100 ㎕를 주입한다.
- 종양 세포를 밀어 / 짜내 피펫 팁과 물고기의 몸의 외부에 부드러운 압력을 적용합니다.
주 :이 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행되는 경우 체강 흘리 종양 세포가 명백 할 것이다. - 각 액상 세포 수집은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 세척 하였다.
- 단계를 반복 1.3.6.1-1.3.6.3 종양 세포의 대부분은 (일반적으로 5 ~ 10 회)를 수집 할 때까지. 동일한 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 모든 종양 세포를 수집한다. 실온에서 세포를 유지합니다.
- 부드럽게 세포 덩어리 해리하도록하여 피펫 팅 단계 1.3.6에서 수집 된 종양 세포를 섞는다. 4 통해 세포 현탁액을 필터0 ㎛의 메쉬 필터. FBS / PBS 100 μL와 필터 1-2 회 반복한다. 실온에서 세포를 유지합니다.
- 새로운 튜브에 트리 판 블루 18 μL (0.4 %로 1:10으로 희석하고 여과)하여 세포 현탁액 2 μL를 섞는다. 로드 혈구 10 μL와 격리 된 종양 세포의 수를 계산하는 라이브 (비 블루) 형광 세포의 수를 계산합니다.
참고 : 비 블루 GFP - 부정적인 세포가 가능성이 정상이 아닌 악성 T 세포이며, 계산되어서는 안된다. 적어도 2 × 106 세포 훽스트 33342로 세포를 염색하기 위해 요구된다.
훽스트 (Hoechst) 33342 2. 염색 찬란 레이블이 T-ALL 세포는 사이드 인구를 식별하는
- 1 ㎎ / ㎖의 농도를 작동하도록 클레아없는 H 2 O로 훽스트 33342 1:10 희석. 4 ℃에서 어둠에서 염료를 저장한다.
- 디메틸 설폭 사이드 1 ㎖ (DMSO) 49.1 mg을 용해시켜 베라파밀의 100 mm의 용액을 제조 하였다.
참고 : 베라파밀은 ABC 트랜스 포터의 억제제 및 측면 인구 실험을위한 중요한 컨트롤입니다. 샘플 베라파밀를 추가하면 훽스트 33342 염색을 유출하는 ABC 수송의 기능을 억제한다. 베라파밀이 샘플에 추가 될 때 따라서, 진정한 측면 인구는 사라집니다. - 28 ° C에 수욕을 설정합니다.
- 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS) 튜브 셀 솔루션을 추가하여 어두운 곳에서 샘플 및 제어를 준비한다.
- 106 개 세포를 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342 및 FACS 튜브 DMSO 2.5 μL를 첨가하여 샘플을 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다.
- FACS 튜브 베라파밀 106 셀, 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342, 100 mM의 2.5 μL를 추가하여 제어를 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다.
참고 : 10 개 6 세포의 최소 / 샘플 권장되지만 더 세포를 염색 특히 측면의 populat 경우 바람직이온 전지는 추가 분석을 위해 정렬된다. 106 개 세포 / ㎖를 초과하고, 15 ㎍ / ㎖의에 훽스트 33342 농도를 유지하지 않는다. 10 × 106 세포를 염색하는 경우, 총 반응 부피 10 ㎖이다.
- 120 분 동안 어둠 속에서 28 ° C의 수조에서 인큐베이션.
- 배양 후, 얼음에 즉시 세포를 배치하고 어두운에 보관하십시오.
- 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ml로 세척 하였다.
- 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁.
- 세포 정렬 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
- 정렬 셀 FBS / PBS 각각 1 mL의 요오드화 프로피 듐 (PI) 재고 2 μL (1 ㎎ / ㎖)을 첨가하기 전에 15 분 (최종 농도 2 ㎍ / ㎖). 잘 섞다.
3. FACS 찬란 레이블이 T-ALL 세포 인구 내에서 사이드 인구를 찾기
- 살아있는 GFP + T-ALL 세포의 게이트를 결정하십시오.
- 파편을 게이트 아웃하려면 FSC (forward scatter) 및 SSC (side scatter) 영역을 사용하십시오.
참고 : FSC는 셀 크기를 구별하는 데 사용되고 SSC는 셀의 세분성을 구별하는 데 사용됩니다. - 이중 선별을 위해 FSC와 SSC 너비를 사용하십시오.
참고 : 유동 세포 계측기 감지기로 식별되는 세 가지 구성 요소가 있습니다 : 면적, 높이 및 너비. 면적은 일반적으로 세포의 형광을 측정하는 데 사용됩니다. 너비는 비행 시간을 측정하며 두 개의 세포가 함께 뭉치면 두 배가됩니다. - 살아있는 종양 세포의 경우 적절한 검출기 ( 예 : GFP의 경우 FITC, PI의 경우 PerCP Cy5-5)를 사용하여 GFP가 양성이고 PI가 음성 인 세포 주위에 게이트를 그립니다.
- 파편을 게이트 아웃하려면 FSC (forward scatter) 및 SSC (side scatter) 영역을 사용하십시오.
- 상기 실험 측부 세포 집단을 분류하면, 큰 노즐 팁 (100 μm의)을 사용하여 100 % FBS의 3 ㎖을 함유하는 FACS 튜브에 세포를 수집한다. 정렬 후에 세포 생존을 향상시키기 위해 더 큰 노즐 팁 (100 μm의) 대신 작은 팁 (70 μm의)을 사용한다.
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Representative Results
효율적 제브라 형광 myc의 유도 된 T-ALL 종양을 생성하기 위해 트랜스 TOL2의 사이트에 의해 측면 원형 DNA 구조체는 TOL2의 RNA와 공동으로 주입 될 수있다. 제브라 피쉬의 수정란으로 선형화 된 DNA의 주입 이전 연구에서 5 %의 형질 전환 레이트 8보고한다. 프로토콜 TOL2 - 매개 형질 전환 등을 조정하여, 10-44 %의 범위의 형질 전환 비율 (표 1)를 관찰 할 수있다.
대표적인 예에서, GFP + T-ALL과 물고기 측면 인구 세포의 비율을 결정하기 위해 훽스트 (Hoechst) 33342로 염색했다. 그림 1은 측 인구 세포의 비율을 결정하는 데 사용되는 게이팅 방식을 보여줍니다. 먼저, FSC 및 SSC를 이용하여 T-ALL 세포 파편 (도 1A)을 제외하고이어서 이중선 대해 선택함으로써 분리된다 (도 1b). 다음에, 모든 살아있는 세포의 GFP + 및 사균 판별 PI (도 1C)에 대한 부정적인 세포를 게이팅에 의해 분리된다. 단일되면, T-ALL 세포가 선택되어 살고, 측면 인구는 훽스트 (Hoechst) 33342 프로파일에서 찾으실 수 있습니다. 주요 세포 집단에서, 훽스트 33342이 세포를 유지하고, 이들 세포는 DNA 함량 그룹으로 분리 될 수있다. 사이드 인구 세포 세포막에 ABC 수송 높은 번호에 의한 염료 유출하지만, 셀의 측면 인구 주요 세포 집단과 구별된다. 측면 인구를 시각화하기 위해, 훽스트 (Hoechst) 프로파일은 두 개의 채널, 훽스트 (Hoechst) 블루와 훽스트 (Hoechst) 레드를 비교하는 데 사용됩니다. 사이드 인구는 훽스트 블루 축 (도 1D)을 향해 메인 세포군의 좌측으로부터 연장되는 세포의 희미 테일이다.
세포가 억제 O를 처리 할 때 진정한 측 인구는 손실됩니다f 베라파밀 (verapamil)과 같은 ABC 트랜스 포터. 그림 2 는 Hoechst 3334로 염색하는 동안 verapamil로 종양을 치료할 때뿐만 아니라 몇 가지 대표적인 T-ALL 종양에서의 측 모집단을 보여줍니다. 표본에서 발견 된 개체군이 참으로 부작용이 없도록하려면 그 세포는 사라져야합니다 도 2 에 도시 된 바와 같이, 억제제의 존재하에 수행된다.
| 재고 번호 | 번호 피쉬 선별 | 숫자 긍정적 인 | Transgenesis의 비율 |
| 930 | 21 | 삼 | 14.3 % |
| 934 | 12 | 4 | 33.3 % |
| 950 | 12 | 5 | 41.7 % |
| 951 | 19 | 삼 | 15.8 % |
| 960 | 3 </ td | 1 | 33.3 % |
| 983 | 9 | 4 | 44.4 퍼센트 |
| 1004 | 30 | 삼 | 10.0 % |
| 1013 년 | 4 | 1 | 25.0 % |
| 1025 년 | 35 세 | 5 | 14.3 % |
| 1029 | 10 | 2 | 20.0 % |
| 1065 | 5 | 1 | 20.0 % |
| 1070 | 6 | 1 | 16.7 % |
| 1073 년 | 19 | 8 | 42.1 % |
| 1079 | 8 | 1 | 12.5 % |
| 1105 년 | 38 세 | 7 | 18.4 % |
| 1193 년 | 30 | 8 | 26.7 % |
| 1215 년 | 9 | 1 | 11.1 % |
| 1,229 | (10) | 이 | 20.0 % |
| 1,314 | 6 | 1 | 16.7 % |
표 1 : 형질 전환 가격 제브라 피쉬 배아에 플라스미드 미세 주입을위한 TOL2의 트랜스를 사용. 형질 전환의 계산 된 비율은 아홉 별도 사출 일 나타낸다. 물고기 상영의 수는 이십일일 주입 후 살아 남아 물고기의 수를 나타내며, 번호 긍정적 인 형광 종양에 대한 긍정적이었다 물고기의 수를 나타냅니다.
그림 1 : 인구 게이팅 계획을 측면입니다. 제브라 피쉬에서 GFP + T-ALL의 측면 인구를 식별하는 데 사용되는 게이팅 방식의 예. (A) 먼저, 찌꺼기가 전방 산란 (FSC)을 사용하여 배제되고측부 산란 (SSC) 영역. (B) 다음에, 하나의 세포는 FSC 및 SSC 폭 파라미터를 이용 이중선 차별 의해 분리된다. (C) 본 실시 예는 종양의 GFP +, 이었기 때문에 생균 모두 죽은 세포 마커 프로피 디움 아이오다 이드의 GFP + 및 음성이어야한다. (D) 측면 인구 훽스트 블루 프로파일 대 훽스트 레드 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : ABC 수송기 억제제, 베라파밀과 함께 치료하면 사이드 인구가 사라집니다. 사이드 인구 게이츠가 표시됩니다. 상단 패널은 네 개의 다른 종양 샘플을 보여줍니다. 모든 종양이 같은 측면 인구 비율이 있고, 측면 인구 캘리포니아주의하는 것이 중요하다n는 각 종양에 대해 다르게 보입니다. 아래쪽 패널은 Hoechst 33342로 염색하는 동안 베라파밀로 치료 한 종양 샘플을 보여서 염료 유출을 차단합니다. 부작용이 각 종양마다 다르게 보일 수 있지만 베라파밀의 효과는 동일합니다. 부작용이 사라집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
측면 집단 분석은 매우 민감합니다. 따라서 프로토콜을 조금만 변경하면 측면 세포를 검출하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 얼룩 단계 동안 온도는 각 동물 / 세포 시스템에 특정입니다. 포유류 시스템의 경우, 측면 집단 분석은 일반적으로 37 ° C에서 수행됩니다 2 . 제브라 피쉬 T-ALL 세포가 37 ℃에서 배양되었을 때, 많은 세포가 죽어서이 배양 온도를 용납 할 수 없게 만들었다 (데이터는 표시되지 않음). Kobayashi와 동료 (2008)가 측 모집 분석을 위해 zebrafish kidney marrow를 해부 시켰을 때, 배양은 25 ℃에서 수행되었다. 이 인큐베이션 온도는 약한 Hoechst 33342 프로파일 (데이터는 표시되지 않음)을 나타 내기 때문에 제브라 피쉬 T-ALL 세포에는 충분하지 않았습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 28 ° C의 인큐베이션 온도는 세포 생존 능력을 유지하고 강한 Hoechst 33342 프로파일을 얻기에 최적입니다.
고려 전에 테스트를 요구하는 측의 집단 분석하는 제 조건 월 훽스트 33342의 농도가 너무 낮 으면, 측면 인구 보이지 않을 수 있고, 또는 측면 인구 표현형 (유출 능력 염료) 훽스트 33342.의 농도 거짓 실제로 존재하는 2 이상의 측면 인구 셀 식별이 증가 될 수있다. 한편, 훽스트 33342의 농도가 너무 높으면 세포 독성 일 수있다. 제브라 T-ALL 세포의 경우, 120 분 동안 인큐베이션 15 ㎍ / ML 호엑스트 33342 최적의 조합이다. 훽스트 33342의 낮은 농도는 제브라 T-ALL 세포 시도하였으나, 사이드 인구 (데이타 미기재) 항상 분명하지 않았다. 90 분의 총 인큐베이션 시간 측면 인구를 검출하기에 충분하였으나 측 인구 셀의 최대 수는 배양 시간 120 분 후에 관찰되었다.
포유류의에 대해 이전에보고 된 하여 점검 아닌 모든 종양 검출 측 인구 (17), (18, 19)을 가질 것이다. 이 방법을 사용하여, 우리는 T-ALLS 테스트 (17)의 측면 (14) 집단을 관찰했다 (데이터는 보이지 않음). T-ALLS에서 격리 측 인구 세포를 갖는,이 방법은 다른 제브라 피쉬 종양 모델에 적용 할 것으로 예상된다.
이기종 제브라 피쉬 내에서 T-ALL 종양, 백혈병 시작 셀 (저소득)은 종양 성장을 재개 한 할 수있는과 같은 암의 재발과 전이에 대한 책임을 것으로 추정된다. 현재 생체 내 저소득의 잠재적 분리를 허용 지브라 피쉬의 방법이 없다. LIC 주파수를 계산하는 것은 제한 희석 (8), (10)에서 종양 세포 이식을 필요로한다. 클론 제브라 피쉬와 함께 이전에 발표 된 연구는 저소득 국이 차 T-ALL 세포의 0.1-1.4 %를 차지하는 것을 확인했다"외부 참조"> 10. 여기서, T-클론 제브라 ALLS 측면에서 집단 세포 (0.2 내지 1.0 %)의 주파수와 유사한 가변성 (도 2)에보고된다. 추가 실험은 측면 인구 저소득 농축 여부를 확인하기 위해 필요하다; 그러나, LIC 주파수의 범위 및 이들 T-ALLS 사이드 인구 세포의 비율 사이의 유사성이 가설을 지원한다.
측면 인구 분석이 민감하고 항상 수행하기 쉬운 반면, 분석은 처음으로, T-ALL 그 줄기 또는 전구 세포 특성을 가질 수있다 제브라 피쉬에서 세포의 희귀 인구를 분리, 연구를 할 수 있습니다. stem- 또는 전구와 같은 세포를 식별하는 제브라 피쉬에서 사용 가능한 세포 표면 마커는 현재 없습니다; 따라서, 측면 인구를 분리 할 수있는 능력은 매우 유망하다. 이 방법의 미래 응용 프로그램은 L의 농축을 평가하기 위해 정렬 된 측면 인구 T-ALL 세포의 제한 희석 이식 실험을 포함IC. 또한이 방법을 사용하면 zebrafish T-ALL의 LIC를 제어하는 분자 메커니즘을 비롯하여 LIC를 정의하는 특성을 밝힐 수 있습니다. 이 실험은 T-ALL의 새로운 치료 표적을 발견하기위한 출발점을 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 시카고 대학 여성위원회 (University Board of Chicago Women Board), 웬디 윌 사건 기금 (Wendy Will Case Fund), 시카고 대학 종합 암 센터 지원 교부금 (P30 CA014599)에 의해 지원되었습니다. 이 실험을 설정하는 데 도움을 주신 시카고 대학교의 Flow Cytometry Core와 de Zhong 연구실의 다른 회원, 특히 Leslie Pedraza 및 Sean McConnell에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
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