Summary
Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.
Abstract
Heterogene Zellpopulationen, aus entweder gesund oder malignes Geweben, enthalten können eine Population von Zellen durch eine Differential Fähigkeit gekennzeichnet können den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 Diese „Neben population“ von Zellen Efflux durchflusszytometrischen Verfahren nach dem Hoechst 33342 identifiziert werden, unter Verwendung von Farbstoff wird durch ein Ultraviolett (UV) Laser angeregt. Die Seiten Bevölkerung vieler Zelltypen enthält Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zellen. Allerdings sind nicht alle Zelltypen haben eine identifizierbare Seiten Bevölkerung. Danio rerio, Zebrafisch, hat eine robusten in vivo Modell der T-Zell - akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL), aber ob dieser Zebrabärbling T-All hat eine Seitenpopulation ist unbekannt. Das hier beschriebene Verfahren beschreibt, wie die Seiten Bevölkerung Zellen in Zebrabärbling T-ALL zu isolieren. Um zu beginnen, die T-ALL in Zebrabärbling wird über die Mikroinjektion von TOL2 Plasmide in eine Zellstadium Embryonen erzeugt. Sobald die Tumoren, bei denen auf eine Stufe gewachsen erweitern sie in mehr als der Hälfte des animal der Körper, die T-ALL-Zellen können geerntet werden. Die Zellen werden dann mit Hoechst 33342 und untersucht durch Durchflußzytometrie für Seitenpopulation Zellen gefärbt. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen in Zebrabärbling T-ALL-Forschung. Zwar gibt es keine bekannten Zelloberflächenmarker in Zebrabärbling , dass diese Nebenpopulation Zellen Krebsstammzellen-like, in vivo Transplantation funktionelle Assays sind möglich sind , bestätigen , ob. Darüber hinaus könnte Single-Cell-Transkriptomik die genetischen Merkmale dieser Seite Bevölkerung Zellen zu identifizieren, angewandt werden.
Introduction
Die Seiten Population Assay nutzt die verbesserte Fähigkeit bestimmter Zellen in einem Gewebe, das den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 aufgrund des hohen Niveaus von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Transporter-Proteine auf der Zellmembran Efflux. Die Zellen, die den Farbstoff Hoechst 33342 Efflux können duale Wellenlänge Durchflusszytometrieanalyse identifiziert werden, nachdem der Farbstoff durch einen UV-Laser angeregt wird. Dieser Test wurde zuerst 1 murinen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu identifizieren , verwendet, aber es seither verwendet Stamm- / Vorläuferzellpopulationen in vielen Geweben und Krebserkrankungen zu identifizieren (in Bezug auf 2 überprüft). Allerdings sind nicht alle Populationen von Zellen haben eine Seitenpopulation, und nicht alle sind für die Populationen Seiten Stamm- / Vorläuferzellen angereichert ist.
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges wirbel genetisches Modellsystem zur Untersuchung von menschlichem Krebs 3, 4, mit einer Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichem Maus - models von Krebs. Zebrabärblingembryonen werden extern befruchtet und sind optisch klar, erleichtert und die Transgenese in vivo Beobachtung von pathologischen Prozessen, einschließlich Krebs Initiierung und Progression. Bis heute zu den Seiten Population Assay potentiellen Stamm- oder Vorläuferzellen erkennen wurde lediglich an der Nierenmark in Zebrabärbling angewendet worden HSCs zu identifizieren, und nicht auf irgendwelche Zebrabärbling Krebsmodellen 5, 6.
Der Zebrafisch Modell der T-Zell - akute lymphatische Leukämie (T-ALL) ist morphologisch und genetisch ähnlich der menschlichen T-ALL 7, 8, 11. T-ALL ist eine aggressive Bösartigkeit , die beim Menschen macht 10-15% der Kinder und 25% der erwachsenen alle Fälle 9. Während die Behandlung von T-ALL verbessert hat, ist Rückfall immer noch üblich und ist mit einer schlechten Prognose verbunden. T-ALL-Tumoren sind heterogeneous und enthält viele verschiedene Subpopulationen von Tumorzellen, einschließlich Leukämie initiierende Zellen (LICs). LICs ist durch ihre Fähigkeit definiert, um den gesamten Tumor aus einer einzelnen Zelle, und die Frequenz des LICs in einer Tumorzellpopulation nachwachsen kann durch Verpflanzen unterschiedliche Zell Dosen in Empfänger über eine Grenzverdünnung Transplantation Assay (LDA) berechnet werden. Während LDA Experimente haben in Zebrabärbling durchgeführt worden , um die Häufigkeit des LICs 8, 10, 11 zu berechnen, wird diese Feststellung im Nachhinein gemacht und für die Isolierung von prospektiven LICs nicht gestattet. Deshalb, um ein Verfahren prospektiv eine Population von Krebsstammzellaktivität angereichert zu isolieren fehlt. Identifizierung und Isolierung von Nebenpopulation Zellen von Zebrabärbling T-All ist der erste Schritt auf dem Weg, diesen Mangels Adressierung.
Das Protokoll hier vorgestellten, wie effizient T-ALL-Tumoren in Zebr erzeugenafish Verwendung TOL2-vermittelte Transgenese, ernten die T-ALL-Zellen Tumoren und verfärben sie mit Hoechst 33342 die Seiten Population von Zellen zu identifizieren. Zukunft in - vivo - Experimente mit Zebrabärbling T-ALL könnten , ob die Seitenpopulation Zellen für LICs angereichert oder andere Stamm- oder Vorläuferähnlichen Eigenschaften.
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Protocol
Alle Verfahren mit Zebrabärbling wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Chicago genehmigt. Die University of Chicago wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert.
1. Erstellen und Isolierkanne fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen in Zebrabärbling
- Mikroinjektion in syngenen Zebrabärblingembryonen
- Im Handel erhältlichen Kits, Isolat Kreis rag2: c-myc und rag2: green fluorescent protein (rag2: GFP) Plasmid - DNA - invertierte terminale Repeats von TOL2 Transposase (siehe die Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) 12 und Eluieren der DNA erfasst enthaltend in sterilem Wasser.
HINWEIS: GFP wird in dieser Studie verwendet wurden, aber jedes fluoreszierendes Protein funktioniert. - Bereiten Sie pCS2-Transposase (TOL2) RNA
- Isolieren TOL2 Plasmid DNA im Handel erhältlichen Kits (siehe ter Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) 12 und die DNA in sterilem Wasser eluieren.
- Inkubiere 1 ug TOL2 DNA bei 37 ° C für 1 h mit 5 Einheiten Restriktionsenzym NotI in dem geeigneten Puffer das Plasmid linearisieren. Wärme-Inaktivierung der NotI bei 65 ° C für 20 min.
- Transkribieren der RNA TOL2 mit SP6 RNA - Polymerase aus dem linearisierten DNA mit einer handelsüblichen RNA - Transkription unter Verwendung von 13 - Kit. Lagern Sie die RNA in Einweg- Aliquots bei -80 ° C.
- Bereiten Sie die Einspritzmischung auf Eis durch Zugabe von 250 ng rag2: c-myc - Plasmid - DNA, 250 ng von rag2: GFP - Plasmid - DNA, 150 ng von TOL2 RNA und 0,5 & mgr; l Phenolrot. Stellen Sie die Lautstärke auf 10 & mgr; l mit Nuklease-freien Wasser.
- Einzuzuspritzen ~ 1 nL Injektionsmischung in die Zelle von einem Ein-Zell-Stadium syngenen Zebrafischembryo mit einem Mikroinjektor und die Nadel aus einer Glaskapillare gezogen, folgenden zuvor estabVerfahren 8 , 14 .
HINWEIS: Synogene Zebrafiken, die durch Parthenogenese 15 erzeugt werden, werden hier verwendet, um genetische Heterogenität und Immunabstoßung nach der Transplantation zu eliminieren. Jedoch kann auch Wildtyp-Zebrafisch oder irgendein gewünschter Stamm verwendet werden. - Entfernen Sie tote, unterentwickelte oder fehlerhafte Embryonen bei 24 h und 48 h nach der Injektion 16 .
- Legen Sie den Spritzfisch auf das Fischsystem bei 6 Tagen nach der Injektion und heben Sie sie nach Standardprotokoll 6 an .
- Im Handel erhältlichen Kits, Isolat Kreis rag2: c-myc und rag2: green fluorescent protein (rag2: GFP) Plasmid - DNA - invertierte terminale Repeats von TOL2 Transposase (siehe die Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) 12 und Eluieren der DNA erfasst enthaltend in sterilem Wasser.
- Screening injiziert Zebrafisch und Überwachung des Tumorwachstums
- Nach 21 Tagen nach der Injektion eine einzelne injizierte Larve in ein Tröpfchen Embryo-Medium auf eine Petrischale geben und GFP-Fluoreszenz mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop (Anregungsbandpass: 470/40, Emissionsbandpass: 525/50) 8 auftragen.
HINWEIS: Zebrafisch-Larven, die have integriert sowohl rag2: c-myc und rag2: GFP wird einen grün fluoreszierenden Thymus (positiver Fisch) hat und bereits die Expansion maligner grün fluoreszierender Zellen außerhalb des Thymus aufweist. Alle Fische mit einem GFP + Thymus wird weitergehen ein GFP + T-ALL zu entwickeln. Die Larven, die keine grün fluoreszierenden Zellen (negativer Fisch) haben keine Integration der Plasmide demonstrieren. - Trennen Sie den negativen Fisch (basierend auf einem Mangel an Fluoreszenz) in einen anderen Tank und Monitor wieder die Fische bei 28 und 35 Tagen nach der Injektion. Bei 28 und 35 Tage nach der Injektion, betäuben die Fische mit 0,02% gepuffertem Tricaine (MS-222) in Fischsystemwasser vor dem Screening.
- Platzieren Sie jede Zebrabärbling Larve, die für ein fluoreszierend markiertes Thymus oder einen fluoreszierend markierten Tumor in einem einzelnen Tank zur Überwachung von Tumorwachstum dreimal pro Woche positiv ist.
- Nach 21 Tagen nach der Injektion eine einzelne injizierte Larve in ein Tröpfchen Embryo-Medium auf eine Petrischale geben und GFP-Fluoreszenz mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop (Anregungsbandpass: 470/40, Emissionsbandpass: 525/50) 8 auftragen.
- Sammlung von fluoreszenz T-ALL - Zellen aus dem Primärtumor Fisch markierte
- Vorbereiten mindestens 20 ml 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum in 0.9x phosphatgepufferter Salzlösung (FBS / PBS).
- 1 ml FBS / PBS auf ein Fläschchen von Heparin-Natriumsalz (300 Einheiten).
- Wählen Sie Fisch Lager Tumoren in mehr als 50% des Körpers, oder jene Fische, die Schwierigkeiten beim Essen oder Schwimmen. Opfern, um die Fische, indem sie mit Tricaine oder durch Eiswasser Tauchdosierung. Bestätigen Tod durch Mangel eines Kiemen Bewegung und Herzschlag.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge den Kopf des Fisches zu entfernen.
- Wäscht den Hohlraum des Fisches mit der Heparin-Lösung überschüssige rote Blutzellen zu entfernen.
- Mit einer Pipette injiziert 100 ul Heparin-Lösung (hergestellt in Schritt 1.3.2) in die Körperhöhle des Fisches. Entfernt alle Flüssigkeit, die aus Leckagen (es wird Blutzellen enthalten) und Pipetten es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze wieder in den Körper zu waschen. Führen mindestens drei Wäschen, oder bis die Flüssigkeit, die frei schwappt aus bl erscheintOod
- Verwerfen Sie alle Flüssigkeiten aus den Waschungen in den Schritten 1.3.5.1 und 1.3.5.2, da sie nicht in weiteren Analysen verwendet werden.
- Sammle die Leukämiezellen.
- 100 μl FBS / PBS in die Körperhöhle des Fisches injizieren.
- Tragen Sie sanften Druck auf die Außenseite des Körpers des Fisches mit der Pipettenspitze, um die Tumorzellen zu quetschen / herauszudrücken.
HINWEIS: Wenn dieser Schritt mit einem Seziermikroskop durchgeführt wird, sind die aus der Körperhöhle verschütteten Tumorzellen offensichtlich. - Sammeln Sie die Flüssigkeit und die Zellen aus jeder Waschung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6.1-1.3.6.3 bis die meisten Tumorzellen gesammelt werden (meist 5-10 mal). Sammle alle Tumorzellen in das gleiche 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur.
- Mischen Sie die gesammelten Tumorzellen aus Schritt 1.3.6 durch sanftes Pipettieren, um die Klumpen der Zellen zu dissoziieren. Filtriere die Zellsuspension durch eine 40 & mgr; m-Mesh-Filter. Das Filter wird 1-2 mal mit 100 ul FBS / PBS. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur.
- Mix 2 & mgr; l der Zellsuspension mit 18 ul Trypanblau (0,4%, 1:10 verdünnt und filtriert) in einem neuen Röhrchen. Last 10 & mgr; l auf einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebenden (non-blue) fluoreszierende Zellen die Anzahl der isolierten Tumorzellen zu berechnen.
HINWEIS: Nicht-blau GFP-negative Zellen sind wahrscheinlich normal, nicht-malignen T-Zellen und nicht gezählt werden sollen. Mindestens 2 x 10 6 Zellen benötigt , um die Zellen mit Hoechst 33342 zu färben.
2. Die Färbung der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen mit Hoechst 33342 identifizieren die Seiten Bevölkerung
- Man verdünnt im Verhältnis 1:10 mit Hoechst 33342 Nuklease-freien H 2 O , die 1 mg / ml Arbeitskonzentration zu bilden. Speichert den Farbstoff bei 4 ° C und im Dunkel.
- Vorbereiten eine 100-mM-Lösung von Verapamil durch Auflösen von 49,1 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO).
HINWEIS: Verapamil ist ein Inhibitor von ABC-Transportern und ist eine wichtige Kontrolle für Nebenbevölkerungsexperimente. Das Hinzufügen von Verapamil zu Proben hemmt die Fähigkeit der ABC-Transporter, den Hoechst 33342-Farbstoff auszulöschen. Daher wird eine wahre Seitenpopulation verschwinden, wenn Verapamil dem Stichprobe hinzugefügt wird. - Wasserbad auf 28 ° C stellen.
- Bereiten Sie Proben und Kontrollen im Dunkeln vor, indem Sie Zellen und Lösungen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierer (FACS) Röhrchen hinzufügen.
- Bereiten Sie die Proben durch Zugabe von 10 6 Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl DMSO zu einem FACS-Röhrchen vor. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein.
- Bereiten Sie die Kontrollen vor, indem Sie 10 6 Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl 100 mM Verapamil zu einem FACS-Röhrchen hinzufügen. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein.
HINWEIS: Es wird ein Minimum von 10 6 Zellen / Probe empfohlen, aber die Färbung von mehr Zellen wird bevorzugt, besonders wenn die Seitenbevölkerung bevorzugt istIonen-Zellen werden zur weiteren Analyse sortiert. 10 6 Zellen / ml nicht überschreiten und die Hoechst 33342-Konzentration bei 15 μg / ml aufrechterhalten. Wenn 10 x 10 & sup6; Zellen gefärbt sind, beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 10 ml.
- In einem 28 ° C Wasserbad im Dunkeln für 120 min inkubieren.
- Nach der Inkubation legen Sie die Zellen sofort auf Eis und halten sie im Dunkeln.
- Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Mit 1 ml FBS / PBS waschen.
- Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Resuspendieren der Zellen in 1 ml FBS / PBS.
- Bei 4 ° C bis zur Zellsortierung aufbewahren.
- 15 min vor der Zellsortierung 2 μl Propidiumjodid (PI) -Stand (1 mg / ml) zu je 1 ml FBS / PBS (Endkonzentration: 2 μg / ml) zugeben. Gut mischen.
3. Verwenden Sie FACS, um die Seitenbevölkerung innerhalb der fluoreszenzbeschrifteten T-ALLE Zellpopulation zu finden
- Bestimmen Sie ein Tor für die Live, GFP + T-ALL Zellen.
- Verwenden Sie Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), um Schutt zu verteilen.
HINWEIS: FSC wird verwendet, um Zellgröße zu unterscheiden und SSC wird verwendet, um die Granularität der Zelle zu unterscheiden. - Verwenden Sie FSC und SSC Breite, um Dubletten zu unterscheiden.
HINWEIS: Es gibt drei Komponenten, die durch die Durchflusszytometer-Detektoren identifiziert werden: Fläche, Höhe und Breite. Der Bereich wird typischerweise verwendet, um die Fluoreszenz der Zelle zu messen. Breite misst die Flugzeit und ist doppelt so breit, wenn zwei Zellen zusammengeklammert sind. - Für lebende Tumorzellen zeichnen Sie ein Gate um die Zellen positiv für GFP und negativ für PI mit den entsprechenden Detektoren ( zB FITC für GFP und PerCP Cy5-5 für PI).
- Verwenden Sie Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), um Schutt zu verteilen.
- Bei der Sortierung der Seitenpopulationszellen für weitere Experimente die große Düsenspitze (100 μm) verwenden und die Zellen in ein FACS-Röhrchen sammeln, das 3 ml 100% FBS enthält. Verwenden Sie eine größere Düsenspitze (100 μm) anstelle der kleineren Spitze (70 μm), um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Sortierung zu verbessern.
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Representative Results
Um effizient zu fluoreszierenden myc-induzierte T-ALL-Tumoren in Zebrabärbling, zirkuläre DNA-Konstrukte, flankiert von TOL2 Transposase Seiten zu erzeugen kann mit TOL2 RNA coinjiziert. Frühere Studien von der Injektion von linearisierter DNA in Zebrabärblingembryonen berichten über eine 5% Transgene Rate 8. Mit dem Protokoll TOL2-vermittelte Transgenese umfassen angepasst und reicht Transgenität Raten von 10 bis 44% kann (Tabelle 1) beobachtet werden.
In dem repräsentativen Beispiel ein Fisch mit einem GFP + T-ALL wurde mit Hoechst 33342 gefärbt dem Prozentsatz an Zellen in der Seitenpopulation zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt das Gating - Schema verwendet , um den Prozentsatz der Population Seiten Zellen zu bestimmen. Zuerst wird unter Verwendung von FSC und SSC, die T-ALL - Zellen werden isoliert , indem ohne Ablagerungen (1A) und anschließend gegen Dubletts (1B) Auswählen. Als nächstes werden alle lebenden Zellen durch Gating-Zellen, die GFP + und Negativ für den toten Zelldiskriminator PI ( 1C ) sind, isoliert. Sobald die einzelnen, Live T-ALL Zellen ausgewählt sind, kann die Seitenpopulation im Hoechst 33342 Profil gefunden werden. In der Hauptzellpopulation bleibt Hoechst 33342 in den Zellen, und diese Zellen können durch DNA-Inhalte in Gruppen getrennt werden. Jedoch unterscheidet sich die Seitenpopulation von Zellen von der Hauptzellpopulation, da die Seitenpopulationszellen den Farbstoff aufgrund einer höheren Anzahl von ABC-Transportern auf der Zellmembran auslöschen. Um die Seitenpopulation zu visualisieren, wird das Hoechst-Profil verwendet, um zwei Kanäle, Hoechst Blue und Hoechst Red zu vergleichen. Die Seitenpopulation ist der schwache Schwanz der Zellen, der sich von der linken Seite der Hauptzellpopulation bis zur Hoechst Blue Achse erstreckt (Abbildung 1D ).
Eine wahre Seitenpopulation wird verloren gehen, wenn die Zellen mit einem Inhibitor behandelt werden of ABC-Transporter, wie Verapamil. Abbildung 2 zeigt die Seiten Populationen in mehrere repräsentativen T-ALL - Tumoren sowie Tumoren , wenn diese mit Verapamil bei der Anfärbung mit Hoechst 33342 behandelt werden , um sicherzustellen , dass die Population in der Probe festgestellt ist eine echte Seitenpopulation, müssen diese Zellen verschwinden in Gegenwart des Inhibitors, wie in Abbildung 2 dargestellt.
| stock Number | Anzahl Fische Abgeschirmte | Anzahl Positive | Rate von Transgenese |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabelle 1: Transgenese Preise Wenn TOL2 Transposase Verwendung für Plasmid Mikroinjektion in Zebrafischembryonen. Die berechneten Preise von Transgene sind neunzehn verschiedenen Injektionstagen gezeigt. Die Anzahl der Fische Abgeschirmte stellt die Anzahl der Fische, die am Leben blieben 21 Tage nach der Injektion, und die Zahl positiv stellt die Anzahl der Fische, die für fluoreszierende Tumoren positiv waren.
Abbildung 1: Bevölkerung Gating Schema Seite. Ein Beispiel für das Gating-Schema verwendet, um die Seitenpopulation in einem GFP + T-ALL in Zebrabärbling zu identifizieren. (A) Zunächst wird der Schmutz unter Verwendung von Vorwärtsstreuung (FSC) ausgeschlossen undSeitenstreuung (SSC) Bereich. (B) Als nächstes werden einzelne Zellen isoliert , indem gegen Dubletts Diskriminieren FSC und SSC Breitenparameter. (C) Da dieses Beispiel Tumor GFP + war, alle lebenden Zellen müssen GFP + und negativ für den toten Zellmarker Propidiumiodid- sein. (D) Die Seiten Bevölkerung kann mit dem Hoechst Rot gegen Hoechst Blau Profil zu sehen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Side Population verschwindet , wenn mit dem ABC - Transporter - Inhibitor, Verapamil behandelt. Tore für die Seiten Bevölkerung gezeigt. Die oberen Platten zeigen vier verschiedene Tumorproben. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle Tumoren der gleichen Seite Bevölkerung Prozentsatz haben, und die Seiten Bevölkerung caN für jeden getesteten Tumor anders aussehen Die Bodenplatten zeigen Tumorproben, die mit Verapamil während der Färbung mit Hoechst 33342 behandelt wurden, um den Farbstoffausfluss zu blockieren. Während die Seitenpopulationen für jeden Tumor unterschiedlich aussehen können, ist die Wirkung des Verapamil gleich: die Seitenpopulation verschwindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Seiten Population Assay ist hochempfindlich; Daher kleine Änderungen an dem Protokoll kann in Nachweisseitenpopulation Zellen in einer Schwierigkeit führen. Zuerst wird die Temperatur während des Färbeschritt spezifisch für jedes Tier / Zellensystem. Für Säugetiersystemen wird die Seitenpopulation Assay typischerweise bei 37 ° C 2 durchgeführt. Wenn die Zebrabärbling T-ALL-Zellen bei 37 ° C inkubiert wurden, starben viele der Zellen, die diese Inkubationstemperatur inakzeptabel gemacht (Daten nicht gezeigt). Wenn Kobayashi und Mitarbeiter (2008) Zebrabärbling Nierenmark für die Seiten Population Assay seziert wurden die Inkubationen bei 25 ° C 5 durchgeführt. Diese Inkubationstemperatur betrug für Zebrabärbling T-ALL-Zellen nicht ausreichend, da sie in einem schwachen Hoechst 33342 Profil resultierte (Daten nicht gezeigt). In dem hier beschriebenen Protokoll wurde eine Inkubationstemperatur von 28 ° C einem optimale Zelllebensfähigkeit zu erhalten und ein starkes Hoechst 33342 Profil zu erreichen.
Eine zweite Bedingung für den Seitenpopulationstest, der eine Berücksichtigung und eine vorherige Prüfung erfordert, ist die Konzentration von Hoechst 33342. Wenn die Konzentration von Hoechst 33342 zu niedrig ist, ist die Seitenpopulation möglicherweise nicht sichtbar, oder der Seitenpopulationspotyp (Farbstoffausflussfähigkeit) kann Fälschlicherweise erhöht werden, mehr Seitenbevölkerungszellen identifizieren als tatsächlich vorhanden sind 2 . Auf der anderen Seite kann eine zu hohe Konzentration von Hoechst 33342 für die Zellen toxisch sein. Für Zebrafisch-T-ALL-Zellen sind 15 μg / ml Hoechst 33342 für 120 min inkubiert die optimale Kombination. Niedrigere Konzentrationen von Hoechst 33342 wurden für Zebrafisch-T-ALL-Zellen versucht, aber die Seitenpopulation war nicht immer offensichtlich (Daten nicht gezeigt). Eine Gesamtinkubationszeit von 90 min war ausreichend, um eine Seitenpopulation zu detektieren, aber die maximale Anzahl der Seitenpopulationszellen wurde nach 120 min Inkubationszeit beobachtet.
Wie bereits erwähnt für Säugetiere s Ystems, nicht jeder Tumor wird eine nachweisbare Seitenpopulation haben 17 , 18 , 19 . Mit dieser Methode beobachteten wir eine Seitenpopulation in 14 von 17 T-ALLs getestet (Daten nicht gezeigt). Mit isolierten Nebenpopulationszellen aus T-ALLs wird erwartet, dass diese Methode auf andere Zebrafisch-Tumormodelle anwendbar ist.
Innerhalb des heterogenen Zebrafisch-T-ALL-Tumors können Leukämie-initiierende Zellen (LICs) in der Lage sein, das Tumorwachstum neu zu initiieren und als solche für das Krebs-Rezidiv und die Metastase verantwortlich zu sein. Derzeit gibt es keine Methode in Zebrafisch, die für die prospektive Isolierung von LICs in vivo ermöglicht. Die Berechnung der LIC-Frequenz erfordert die Tumorzelltransplantation bei einer limitierenden Verdünnung 8 , 10 . Bisher veröffentlichte Studien mit klonalem Zebrafisch haben festgestellt, dass LICs 0,1-1,4% der primären T-ALL-Zellen ausmachen"Xref"> 10 Hier wird eine ähnliche Variabilität in der Häufigkeit der Seitenpopulationszellen (0,2-1,0%) aus klonalen Zebrafisch-T-ALLs berichtet (Abbildung 2 ). Es sind weitere Experimente erforderlich, um zu bestimmen, ob die Seitenpopulation an LICs angereichert ist; Allerdings unterstützt die Ähnlichkeit zwischen den Bereichen der LIC-Frequenz und dem Prozentsatz der Seitenpopulationszellen in diesen T-ALLs diese Hypothese.
Während der Seitenpopulationstest empfindlich ist und nicht immer leicht durchzuführen ist, ermöglicht der Assay den Forschern erstmals, eine seltene Population von Zellen in Zebrafisch T-ALL zu isolieren, die Stamm- oder Vorläuferzelleneigenschaften haben kann. Es gibt derzeit keine Zelloberflächenmarkierungen in Zebrafisch, um Stamm- oder Progenitor-ähnliche Zellen zu identifizieren; Daher ist die Fähigkeit, die Seitenbevölkerung zu isolieren, sehr vielversprechend. Zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens umfassen Grenzverdünnungstransplantationsexperimente von sortierten Seitenpopulationen T-ALL-Zellen, um die Anreicherung von L zu bestimmenIC. Darüber hinaus wird diese Methode Eigenschaften erlauben es, die LICs definieren, einschließlich der molekularen Mechanismen aufgeklärt, werden die LICs in Zebrabärbling T-ALL regieren. Diese Experimente könnten Ansatzpunkte für die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele für T-ALL bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Women's Board, der Wendy Will Case Fund und der University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Chicago für ihre Hilfe bei der Erstellung dieses Experiments und auch für andere Mitglieder des de Jong Labors, insbesondere Leslie Pedraza und Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
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- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
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