Summary
Här beskriver vi en teknik för att isolera sidopopulationcellerna från en zebrafiskmodell av mycinducerad T-cells akut lymfoblastisk leukemi (T-ALL). Denna sidpopulationstest är mycket känslig och beskrivs för zebrafisk T-ALL, men den kan vara tillämplig på andra maligna och icke maligna zebrafiskcelltyper.
Abstract
Heterogena cellpopulationer, från antingen friska eller maligna vävnader, kan innehålla en population av celler som kännetecknas av en differentiell förmåga att utflöda det DNA-bindande färgämnet Hoechst 33342. Denna "sidopopulation" av celler kan identifieras med hjälp av flödescytometriska metoder efter Hoechst 33342 Färgämne är upphetsad av en ultraviolett (UV) laser. Sidopopulationen av många celltyper innehåller stam- eller progenitorliknande celler. Emellertid har inte alla celltyper en identifierbar sidopopulation. Danio rerio , zebrafish, har en robust in vivo- modell av T-cells akut lymfoblastisk leukemi (T-ALL), men om dessa zebrafisk-T-ALL har en sidopopulation är okänd. Metoden som beskrivs här beskriver hur man isolerar sidopopulationcellerna i zebrafisk T-ALL. Till att börja med genereras T-ALL i sebrafisk via mikroinjektion av tol2-plasmider i embryon med en cellstegstadium. När tumörerna har vuxit till ett stadium där de expanderar till mer än hälften av animal kropp, kan T-ALL-cellerna skördas. Cellerna färgas sedan med Hoechst 33342 och undersöktes med flödescytometri för sidopopulationsceller. Denna metod har breda tillämpningar inom zebrafisk T-all forskning. Medan det inte finns några kända cellytmarkörer i zebrafisk som bekräftar huruvida dessa sidopopulations celler är cancerstamcellsliknande, in vivo-funktionella transplantations analyser är möjliga. Vidare kunde encelliga transkriptomik tillämpas för att identifiera de genetiska egenskaperna hos dessa sidopopulationsceller.
Introduction
Sido befolkningen analysen drar fördel av den förbättrade förmågan hos vissa celler inom en vävnad för att efflux den DNA-bindande färgämnet Hoechst 33342 på grund av höga nivåer av ATP-bindningskassett (ABC) transportproteiner på cellmembranet. De celler som efflux Hoechst 33342 färgämne kan identifieras med användning dubbla våglängder flödescytometrisk analys efter färgämnet exciteras av en UV-laser. Denna analys användes först för att identifiera murina hematopoietiska stamceller (HSCs) 1, men det har sedan använts för att identifiera stam / ursprungscellpopulationer i många vävnader och cancrar (översikt i referens 2). Men inte alla populationer av celler har en sida befolkning, och inte alla sidopopulationer anrikas för stam / progenitorceller.
Zebrafisk är en kraftfull ryggradsdjur genetisk modellsystem för att studera human cancer 3, 4, med ett antal fördelar jämfört med traditionella murin moDels av cancer. Zebrafish embryon befruktas externt och är optiskt tydliga, underlättar transgenes och in vivo observation av patologiska processer, inklusive cancerinitiering och progression. Hittills har sidopopulationen för att upptäcka potentiella stam- eller stamceller endast applicerats på njurmärgen i zebrafisk för att identifiera HSCs och inte till några sebrafiskcancermodeller 5 , 6 .
Zebrafish-modellen av T-cells akut lymfoblastisk leukemi (T-ALL) är morfologiskt och genetiskt lik human T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL är en aggressiv malignitet som hos människor står för 10-15% av barn och 25% av vuxna ALL-fall 9 . Medan behandlingen av T-ALL har förbättrats är återfall fortfarande vanligt och förknippas med en dålig prognos. T-ALL tumörer är heterogenaous och innehålla många olika tumörcellunderpopulationer, inklusive leukemi initierande celler (LIC). LIC definieras genom sin förmåga att växa tillbaka hela tumören från en enda cell, och frekvensen hos låginkomstländer inom en tumörcellpopulation kan beräknas genom att transplantera olika celldoser in i mottagare via en begränsande utspädning transplantationsanalys (LDA). Medan LDA experiment har utförts i zebrafisk för att beräkna frekvensen av låginkomstländerna 8, 10, 11, görs denna bestämning i efterhand och inte tillåter för den potentiella isoleringen av låginkomstländerna. Därför en metod för att prospektivt isolera en population anrikad för cancerstamcellsaktivitet saknas. Identifiering och isolering av sidopopulationsceller från zebrafisk T-alls är det första steget mot att avhjälpa denna brist.
Protokollet presenteras här beskriver hur effektivt att generera T-alla tumörer i zebrAvish med användning av tol2-medierad transgenes, skör T-ALL-tumörcellerna och fläckar dem med Hoechst 33342 för att identifiera sidopopulationen av celler. Framtida in vivo- experiment med zebrafisk T-ALL kan innefatta om sidopopulationcellerna är berikade för LICs eller har andra stam- eller stamcellerliknande egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden med zebrafisk har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Chicago. The University of Chicago är ackrediterat av Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Generera och isolering fluorescensmärkt T-ALL-celler i zebrafisk
- Mikroinjektion i syngena zebrafisk embryon
- Med användning av kommersiellt tillgängliga kit, isolera cirkulär rag2: c-myc och rag2: grönt fluorescerande protein (rag2: GFP) plasmid-DNA innehållande inverterade terminala upprepningar igen av tol2 transposas (se Tabell över Material för källa till plasmid-DNA) 12 och eluera DNA i sterilt vatten.
OBS: GFP används i denna studie, men alla fluorescerande proteinet kommer att fungera. - Förbereda pCS2-transposas (tol2) -RNA
- Isolera tol2 plasmid-DNA med användning av kommersiellt tillgängliga kit (se tHan materialblock för källan till plasmid-DNA) 12 och eluera DNA i sterilt vatten.
- Inkubera 1 μg tol2-DNA vid 37 ° C i 1 h med 5 enheter NotI-restriktionsenzym i lämplig buffert för att linearisera plasmiden. Värmeinaktivera NotI vid 65 ° C under 20 minuter.
- Transkribera tol2-RNA med SP6-RNA-polymeras från det lineariserade DNA med användning av ett kommersiellt tillgängligt RNA-transkriptionssats 13 . Förvara RNA i alikvoter med engångsbruk vid -80 ° C.
- Förbered injektionsblandningen på is genom att tillsätta 250 ng rag2 : c-myc-plasmid-DNA, 250 ng rag2 : GFP-plasmid-DNA, 150 ng tol2-RNA och 0,5 | il fenolrött. Justera volymen till 10 μL med nukleasfritt vatten.
- Injicera ~ 1 nl injektionsblandning i cellen i ett ett-cellstegs syngeniskt zebrafiskembryo med hjälp av en mikroinjektor och nål som dras från ett glaskapillärrör, efter tidigare estabinrättats metoder 8, 14.
OBS: Syngena zebrafisk som genereras av partenogenes 15 används här för att eliminera genetisk heterogenitet och avstötning efter transplantation. Emellertid kan också användas vildtyp zebrafisk eller någon önskad stam. - Avlägsna döda, underutvecklade, eller missbildade embryon vid 24 h och 48 h efter injektion 16.
- Placera den injicerade fisk på fisk systemet vid 6 dagar efter injektion och höja dem enligt standardprotokoll 6.
- Med användning av kommersiellt tillgängliga kit, isolera cirkulär rag2: c-myc och rag2: grönt fluorescerande protein (rag2: GFP) plasmid-DNA innehållande inverterade terminala upprepningar igen av tol2 transposas (se Tabell över Material för källa till plasmid-DNA) 12 och eluera DNA i sterilt vatten.
- Screening injiceras zebrafisk och övervakning av tumörtillväxt
- Vid 21 dagar efter injektion, placera en enda injicerad larv i en droppe av embryo medium i en petriskål och skärm för GFP-fluorescens med användning av ett epifluorescent mikroskop (excitation bandpass: 470/40, emission bandpass: 525/50) 8.
OBS: Zebrafish larver som hAve integrerat både rag2 : c-myc och rag2 : GFP kommer att ha en grön fluorescerande thymus (positiv fisk) och kan redan uppvisa expansion av maligna gröna fluorescerande celler bortom thymus. Alla fiskar med GFP + thymus kommer att fortsätta utveckla en GFP + T-ALL. Larverna som inte demonstrerar integration av plasmiderna kommer inte att ha några gröna fluorescerande celler (negativa fiskar). - Separera den negativa fisken (baserat på brist på fluorescens) i en annan tank och övervaka fisken igen vid 28 och 35 dagar efter injektionen. Vid 28 och 35 dagar efter injektion bedövas fisken med 0,02% buffrad tricain (MS-222) i fiskesystemvatten före screening.
- Placera varje zebrafisklarva som är positiv för en fluorescensmärkt tymus eller en fluorescensmärkt tumör i en individuell tank för övervakning av tumörtillväxt tre gånger i veckan.
- Vid 21 dagar efter injektion, placera en enda injicerad larv i en droppe av embryo medium i en petriskål och skärm för GFP-fluorescens med användning av ett epifluorescent mikroskop (excitation bandpass: 470/40, emission bandpass: 525/50) 8.
- Insamling av fluorescensmärkta T-ALL-celler från den primära tumörfisken
- Förbered minst 20 ml 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum i 0,9x fosfatbuffrad saltlösning (FBS / PBS).
- Tillsätt 1 ml FBS / PBS till en injektionsflaska med heparinnatriumsalt (300 enheter).
- Välj fiskbärande tumörer i mer än 50% av kroppen, eller de fiskar som har svårt att äta eller simma. Offra fisken genom att överdosera dem med trica eller genom isvatten nedsänkning. Bekräfta döden genom att inte ha en gillrörelse och hjärtslag.
- Använd ett rakblad för att ta bort fiskens huvud.
- Tvätta håligheten hos fisken med heparinlösningen för att avlägsna överskott av röda blodkroppar.
- Använd en pipett, injicera 100 μl heparinlösning (framställd i steg 1.3.2) i fiskens kroppshålighet. Ta bort all vätska som spolas ut (det kommer att innehålla blodkroppar) och pipettera den i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Använd en ny pipettspets för att tvätta kroppen igen. Utför minst tre tvättar, eller tills vätskan som spilla ut ser sig fri från blood.
- Kassera all vätska från tvätten i steg 1.3.5.1 och 1.3.5.2, eftersom den inte kommer att användas i ytterligare analyser.
- Samla leukemi celler.
- Injicera 100 μl FBS / PBS i fiskens kroppshålighet.
- Applicera försiktigt tryck på utsidan av fiskens kropp med pipettspetsen för att pressa / skjuta ut tumörcellerna.
OBS! Om detta steg utförs med hjälp av ett dissekeringsmikroskop kommer tumörcellerna att spilla ut ur kroppshålan att bli uppenbara. - Samla vätskan och cellerna från varje tvätt i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Upprepa steg 1.3.6.1-1.3.6.3 tills de flesta tumörcellerna samlas in (vanligtvis 5-10 gånger). Samla alla tumörceller i samma 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara cellerna vid rumstemperatur.
- Blanda de uppsamlade tumörcellerna från steg 1.3.6 genom att försiktigt pipettera dem för att dissociera klumparna av celler. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm mesh filter. Tvätta filtret 1-2 gånger med 100 pl FBS / PBS. Förvara cellerna vid rumstemperatur.
- Blanda 2 μl cell suspension med 18 μl trypanblått (0,4%, utspätt 1:10 och filtreras) i ett nytt rör. Ladda 10 μL på en hemocytometer och räkna antalet levande (icke-blå) fluorescerande celler för att beräkna antalet isolerade tumörceller.
OBS: Icke-blåa GFP-negativa celler är sannolikt normala, icke-maligna T-celler och bör inte räknas. Minst 2 x 106 celler behövs för att fläcka cellerna med Hoechst 33342.
2. Färgning av de fluorescensmärkta T-ALL-cellerna med Hoechst 33342 för att identifiera sidob populationen
- Torka Hoechst 33342 1:10 med nukleasfri H2O för att göra arbetskoncentrationen på 1 mg / ml. Förvara färgämnet vid 4 ° C och i mörkret.
- Förbered en 100 mM lösning av verapamil genom upplösning av 49,1 mg i 1 ml dimetylsulfoxid (DMSO).
OBS: Verapamil är en hämmare av ABC transportörer och är en viktig kontroll för sidobefolknings experiment. Lägga verapamil prover kommer att hämma möjligheten för ABC transportörer att utflödet Hoechst 33342 färgämne. Därför kommer en sann sida population försvinner när verapamil sättes till provet. - Ställa ett vattenbad till 28 ° C.
- Framställning av prover och kontroller i mörker genom att lägga till celler och lösningar till fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) rör.
- Bereda proverna genom tillsats av 10 6 celler, 15 | il av 1 mg / mL Hoechst 33342, och 2,5 mikroliter av DMSO till en FACS-rör. Justera volymen till 1 ml med FBS / PBS.
- Förbereda kontrollerna genom tillsats av 10 6 celler, 15 | il av 1 mg / mL Hoechst 33342, och 2,5 mikroliter av 100 mM verapamil till ett FACS-rör. Justera volymen till 1 ml med FBS / PBS.
OBS: Ett minimum av 10 6 celler / prov rekommenderas, men färgning flera celler är föredragen, särskilt om den sida population celler kommer att sorteras för ytterligare analys. Inte överstiger 10 6 celler / ml, och underhålla Hoechst 33342-koncentrationen vid 15 | ig / ml. Om 10 x 10 6 celler är färgade, är den totala reaktionsvolymen 10 ml.
- Inkubera i en 28 ° C vattenbad i mörker under 120 min.
- Efter inkubation placera cellerna omedelbart på is och hålla dem i mörkret.
- Pelletera cellerna vid 4 ° C under 6 min vid 300 x g. Avlägsna supernatanten. Tvätta med 1 ml av FBS / PBS.
- Pelletera cellerna vid 4 ° C under 6 min vid 300 x g. Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 ml FBS / PBS.
- Förvara vid 4 ° C tills cellsortering.
- 15 min före cellsortering, tillsätt 2 mikroliter av propidiumjodid (PI) lager (1 mg / ml) till varje 1 ml FBS / PBS (slutlig koncentration: 2 | ig / ml). Blanda väl.
3. Använd FACS att hitta sido Population i fluorescensmärkta T-ALL cellpopulation
- Bestäm en port för de levande, GFP + T-ALL-cellerna.
- Använd spridningsfältet (FSC) och sidospridnings (SSC) för att förhindra skräp.
OBS: FSC används för att skilja cellstorlek och SSC används för att skilja cellens granularitet. - Använd FSC och SSC bredd för att diskriminera dubletter.
OBS! Det finns tre komponenter som identifieras av flödescytometerdetektorerna: område, höjd och bredd. Området används vanligtvis för att mäta cellens fluorescens. Bredd mäter tidpunkten för flygningen och är dubbelt så bred om två celler klumpas ihop. - För levande tumörceller, dra en grind runt cellerna positiva för GFP och negativ för PI med hjälp av lämpliga detektorer ( t.ex. FITC för GFP och PerCP Cy5-5 för PI).
- Använd spridningsfältet (FSC) och sidospridnings (SSC) för att förhindra skräp.
- Om sortering av sidopopulationsceller för ytterligare experiment, använda den stora munstycksspetsen (100 um) och samla upp cellerna i en FACS-rör innehållande 3 ml 100% FBS. Använda en större munstycksspets (100 ^ m) i stället för den mindre spetsen (70 | j, m) för att förbättra cellviabilitet efter sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att effektivt generera fluorescerande myc-inducerad T-ALL-tumörer i zebrafisk, cirkulära DNA-konstruktioner flankerade av tol2 transposas ställen kan användas samtidigt injiceras med tol2 RNA. Tidigare studier från injektionen av linjäriserad DNA i zebrafisk embryon rapporterar en 5% transgenes hastighet 8. Med det protokoll justeras för att inkludera tol2 förmedlad transgenes, kan observeras (tabell 1) transgenes hastigheter varierande från 10-44%.
I det representativa exempel användes en fisk med en GFP + T-ALL färgas med Hoechst 33342 för att bestämma den procentuella andelen celler i sidopopulationen. Figur 1 visar den grindningsschema som används för att bestämma den procentuella andelen av sidopopulationsceller. Först, med användning av FSC och SSC är de T-ALL-celler isolerades genom exklusive skräp (Figur 1A) och därefter välja mot dubletter (Figur 1B). Därefter isoleras alla levande celler genom att gata celler som är GFP + och negativa för dödcellsdiskriminatorn PI ( Figur 1C ). När de ensamma, levande T-ALL-cellerna väljs, kan sidopopulationen hittas i Hoechst 33342-profilen. I huvudcellpopulationen förblir Hoechst 33342 i cellerna, och dessa celler kan separeras i grupper med DNA-innehåll. Emellertid är sidopopulationen av celler urskiljbara från huvudcellpopulationen, eftersom sidopopulationcellerna utströmmar färgämnet på grund av högre antal ABC-transportörer på cellmembranet. För att visualisera sidopopulationen används Hoechst-profilen för att jämföra två kanaler, Hoechst Blue och Hoechst Red. Sidopopulationen är den svarta svansen av celler som sträcker sig från vänster sida av huvudcellpopulationen mot Hoechst Blue-axeln ( Figur 1D ).
En sann sidopopulation kommer att gå vilse när cellerna behandlas med en hämmare oF ABC-transportörer, såsom verapamil. Figur 2 visar sidpopulationerna i flera representativa T-ALL-tumörer, såväl som när dessa tumörer behandlas med verapamil under färgningen med Hoechst 33342. För att säkerställa att befolkningen som finns i provet är en sann sidopopulation, måste dessa celler försvinna I närvaro av inhibitorn, såsom visas i figur 2 .
| Lagernummer | Antal Fish Screened | Antal Positiv | Transgenes hastighet |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabell 1: Transgenesatser vid användning av tol2 Transposase för Plasmid Microinjection i Sebrafiskembryon. De beräknade transgenesgraden visas för nitton separata injektionsdagar. Antalet visade visningar representerar antalet fiskar som förblev levande 21 dagar efter injektion och antalet Positiva representerar antalet fiskar som var positiva för fluorescerande tumörer.
Figur 1: Sidopopulation Gating Scheme. Ett exempel på gating-systemet som användes för att identifiera sidopopulationen i en GFP + T-ALL i zebrafisk. ( A ) Först utesluts skräpet med hjälp av framåtriktad scatter (FSC) ochSidospridningsområde (SSC). ( B ) Därefter isoleras enskilda celler genom att diskriminera dubbletter med användning av FSC- och SSC-breddparametrar. ( C ) Eftersom detta exempel var tumör var GFP +, måste alla levande celler vara GFP + och negativa för dödcellmarkören Propidium Iodide. ( D ) Sidopopulationen kan ses med Hoechst Red versus Hoechst Blue profilen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Sidopopulationen försvinner när den behandlas med ABC Transporter Inhibitor, Verapamil. Portar för sidopopulationen visas. De övre panelerna visar fyra olika tumörprover. Det är viktigt att notera att inte alla tumörer har samma sidopopulation, och sidopopulationen caN ser annorlunda ut för varje testad tumör. Bottenpanelerna visar tumörprover som behandlades med verapamil under färgningen med Hoechst 33342 för att blockera färgutsläpp. Medan sidopopulationerna kan se annorlunda ut för varje tumör, är verapamidens effekt detsamma: sidopopulationen försvinner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sidopopulationen är mycket känslig; Därför kan små förändringar i protokollet resultera i svårigheter att upptäcka sidopopulationsceller. För det första är temperaturen under färgningssteget specifikt för varje djur / cellsystem. För däggdjursystem utföres sidopopulationstestet typiskt vid 37 ° C. När zebrafisk-T-ALL-cellerna inkuberades vid 37 ° C dog många av cellerna, vilket gjorde denna inkubationstemperatur oacceptabel (data visas inte). När Kobayashi och kollegor (2008) dissekerade zebrafisk njurmärg för sidopopulationen, genomfördes inkubationerna vid 25 ° C 5 . Denna inkubationstemperatur var inte tillräcklig för zebrafisk-T-ALL-celler, eftersom det resulterade i en svag Hoechst 33342-profil (data ej visad). I det här beskrivna protokollet var en inkubationstemperatur på 28 ° C optimal för att upprätthålla cellens livskraft och för att uppnå en stark Hoechst 33342-profil.
Ett andra villkor för sidopopulationen som kräver övervägande och tidigare test är koncentrationen av Hoechst 33342. Om koncentrationen av Hoechst 33342 är för låg kan sidopopulationen inte vara synlig, eller sidopopulationens fenotyp (färgutflödesförmåga) kan Ökas felaktigt och identifierar fler sidopopulationer än vad som faktiskt finns 2 . Å andra sidan kan för hög koncentration av Hoechst 33342 vara giftigt för cellerna. För zebrafisk-T-ALL-celler är 15 ug / ml Hoechst 33342 inkuberad i 120 min den optimala kombinationen. Lägre koncentrationer av Hoechst 33342 försöktes för zebrafisk T-ALL-celler, men sidopopulationen var inte alltid uppenbar (data ej visad). En total inkubationstid på 90 minuter var tillräcklig för att detektera en sidopopulation, men det maximala antalet sidopopulationsceller sågs efter 120 min inkubationstid.
Som tidigare rapporterats för däggdjur s Ystems, inte varje tumör kommer att ha en detekterbar sidopopulation 17 , 18 , 19 . Med hjälp av denna metod observerades en sidopopulation i 14 av 17 T-ALL-testade (data ej visade). Med isolerade sidopopulationceller från T-ALL, förväntas denna metod vara tillämplig på andra zebrafisktumormodeller.
Inom den heterogena zebrafisk-T-ALL-tumören är leukemiska initierande celler (LIC) kapabla att återinitiera tumörtillväxt och anses som sådana vara ansvariga för återkommande cancer och metastasering. För närvarande finns det ingen metod i zebrafisk som möjliggör en eventuell isolering av LICs in vivo . Beräkning av LIC-frekvensen kräver tumörcellstransplantation vid en begränsande utspädning 8 , 10 . Tidigare publicerade studier med klonal zebrafish har identifierat att LICs utgör 0,1-1,4% av primära T-ALL-celler"xref"> 10. Här, är liknande variation i frekvensen av sidopopulationsceller (0,2-1,0%) från klonal zebrafisk T-alls rapporterats (Figur 2). Det krävs ytterligare experiment för att bestämma om den sida befolkningen är anrikad på låginkomstländerna; emellertid likheten mellan intervallen LIC frekvens och andelen sidopopulationsceller i dessa T-alls stöder denna hypotes.
Medan sidan befolkningen analysen är känslig och inte alltid lätt att utföra, gör analysen forskare för första gången, för att isolera en sällsynt population av celler i zebrafisk T-ALL som kan ha stamceller eller progenitorceller egenskaper. Det finns för närvarande inga cellytemarkörer tillgängliga i zebrafisk att identifiera stem- eller stamceller-liknande celler; Därför är förmågan att isolera sidan befolkningen mycket lovande. Framtida tillämpningar av denna metod innefattar gränsspädtransplantationsexperiment av sorterad sidopopulations T-ALL-celler för att bedöma anrikning av LIC. Dessutom kommer denna metod att tillåta egenskaper som definierar LIC som ska belysas, inklusive de molekylära mekanismerna som styr LIC i zebrafish T-ALL. Dessa experiment kan ge utgångspunkter för upptäckten av nya terapeutiska mål för T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av University of Chicago kvinnors styrelse, Wendy Will Fall fonden och University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). Vi vill tacka Flow Cytometry Kärna vid University of Chicago för deras hjälp med att installera detta experiment, och liksom andra medlemmar av de Jong lab, speciellt Leslie Pedraza och Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
