在侧群的分离的Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病斑马鱼

Summary

在这里，我们描述了一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型中分离侧群体细胞的技术。这种侧群体测定是高度敏感的，描述为斑马鱼T-ALL，但它可能适用于其他恶性和非恶性斑马鱼细胞类型。

Abstract

异质细胞群，从任一健康或恶性组织，可以含有其特征在于，外排至DNA结合染料赫斯特33342细胞的这种“侧群”的差分能力的细胞群可使用的Hoechst 33342后流式细胞方法来鉴定染料由紫外线（UV）激光激发。许多细胞类型的侧群包含茎或祖细胞样细胞。然而，并非所有类型的细胞具有可识别的侧群。 斑马鱼 ，斑马鱼， 在 T细胞急性淋巴细胞性白血病（T-ALL）的体内模型中一个健壮的，但这些斑马鱼T-承滴盘是否具有侧群是未知的。这里所描述的方法概述了如何分离在斑马鱼T-ALL侧群细胞。首先，经由TOL2质粒的显微注射到单细胞阶段的胚胎产生的T-ALL在斑马鱼。一旦肿瘤已发展到一个阶段，在其业务拓展到超过一半的ANI的马氏体，T细胞可以收获。然后将细胞用Hoechst 33342染色，并通过流式细胞术检查侧群细胞。该方法在斑马鱼T-ALL研究中有广泛应用。虽然斑马鱼中没有已知的细胞表面标志物证实这些侧面细胞是否是癌症干细胞样的，但是体内功能性移植测定是可能的。此外，单细胞转录组学可以应用于鉴定这些侧群体细胞的遗传特征。

Introduction

侧群体测定利用细胞膜上的ATP结合盒（ABC）转运蛋白的高水平来增强组织内某些细胞的能力，从而排出DNA结合染料Hoechst 33342。使用UV激光激发染料后，可以使用双波长流式细胞术分析鉴定外排Hoechst 33342染料的细胞。该测定首先用于鉴定鼠造血干细胞（HSCs） ¹ ，但是它已被用于鉴定许多组织和癌症中的干细胞/祖细胞群（参见参考文献2）。然而，并不是所有的细胞群均具有侧面群体，并且并不是所有的侧面群体都富含茎/祖细胞。

斑马鱼是一种强大的脊椎动物遗传模型系统，用于研究人类癌症^3,4 ，具有优于传统小鼠的许多优点癌症的皮肤。斑马鱼胚胎在外部受精并且是光学透明的，促进转基因和体内观察病理过程，包括癌症起始和进展。迄今为止，用于检测潜在的干细胞或祖细胞的侧面群体测定仅已经应用于斑马鱼中的肾脏骨髓来识别HSC，而不是任何斑马鱼癌模型^5,6 。

T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型与人类T-ALL 7,8,11的形态学和遗传学相似。 T-ALL是一种侵略性恶性肿瘤，在人类中占儿童的10-15％，成人ALL的占25％。虽然T-ALL的治疗有所改善，但复发仍然很常见，预后不良。 T-ALL肿瘤是异质的并含有许多不同的肿瘤细胞亚群，包括白血病起始细胞（LIC）。 LIC通过其从单个细胞再生整个肿瘤的能力来定义，并且可以通过有限稀释移植测定（LDA）将不同的细胞剂量移植到受体中来计算肿瘤细胞群体内的LIC的频率。虽然已经在斑马鱼中进行LDA实验以计算LIC 8,10,11的频率，但是这种确定是事后做出的，并且不允许LIC的预期分离。因此，缺乏前瞻性分离富集癌症干细胞活性的群体的方法。识别和分离侧群体细胞与斑马鱼T-ALLs是解决这一缺陷的第一步。

这里提出的方案描述了如何有效地产生斑马鱼的T-ALL肿瘤afish利用TOL2介导的转基因，收获T-ALL肿瘤细胞，并用Hoechst 33342染色他们能够识别细胞的侧群。未来与斑马鱼T-ALL 体内实验可以包括侧群细胞是否被富集低收入国家或有其他茎或祖样性质。

Protocol

与斑马鱼的所有程序已批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在芝加哥大学。芝加哥大学是由协会为实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的认可。

1.生成并分离荧光标记的T-ALL中斑马鱼细胞

1. 显微注射进同源斑马鱼胚胎
   1. 使用市售试剂盒，隔离圆形RAG2：c-myc和RAG2：绿色荧光蛋白（RAG2：GFP）含有末端反向重复的质粒DNA通过TOL2转座（参见材料的表用于质粒DNA的源^）12识别并洗脱DNA在无菌水中。
      注：GFP在这项研究中使用，但任何荧光蛋白会工作。
   2. 制备PCS2-转座（TOL2）RNA
      1. 使用市售试剂盒隔离TOL2质粒DNA（见吨材料的质粒DNA的来源的他表^）12和洗脱在无菌水中的DNA。
      2. 孵育TOL2 DNA的1微克，在37℃用在适当的缓冲液以线性化质粒5个单位的NotI限制性内切酶的1个小时。热灭活的NotI在65℃下20分钟。
      3. 转录从使用市售的RNA转录试剂盒¹³中的线性化DNA SP6 RNA聚合酶的TOL2 RNA。在-80℃下储存在单次使用的等分试样的RNA。
   3. c-myc基因的质粒DNA，RAG2的250ng的：GFP的质粒DNA，RNA TOL2 150纳克，和酚红的0.5μL加入250ng的RAG2的制备在冰上注射组合。将音量调整到10微升无核酸酶的水。
   4. 注入注射混合物的〜1纳升成单细胞阶段的同基因斑马鱼胚胎的细胞使用微量注射器和针头从玻璃毛细管拉动时，按照先前在ESTAB发现方法8,14。
      注意：通过孤雌生殖¹⁵产生的同基因斑马鱼在这里用于消除移植后的遗传异质性和免疫排斥反应。然而，也可以使用野生型斑马鱼或任何所需的菌株。
   5. 在注射后24小时和48小时内清除死亡，不发达或畸形的胚胎¹⁶ 。
   6. 注射后6天将注射的鱼放在鱼系统上，并按照标准方案⁶提高。
2. 筛选注射斑马鱼并监测肿瘤生长
   1. 注射后21天，使用荧光显微镜（激发带通：470/40，发射带通：525/50） ⁸将一只注射的幼虫置于培养皿中的胚液培养基液滴中并筛选GFP荧光。
      注意：斑马鱼幼虫hAVE集成两个RAG2：c-myc和RAG2：GFP将具有绿色荧光胸腺（阳性鱼），并且可以显示出已经超出了胸腺恶性肿瘤绿色荧光细胞的扩增。用GFP +胸腺所有的鱼会继续发展成一个GFP + T-ALL。不证明质粒的整合幼虫不会有任何绿色荧光的细胞（负鱼）。
   2. 分离负鱼（基于缺少荧光的）到不同的罐，并在28天和35天注射后再次监视鱼。在28天和35天注射后，麻醉鱼用0.02％（MS-222）在鱼系统水之前筛选缓冲三卡因。
   3. 将每个斑马鱼幼虫结果为阳性的荧光标记的胸腺或用于监测肿瘤的生长，每周三次的个体罐荧光标记的肿瘤。
3. 收集的荧光标记的T-ALL细胞从原发肿瘤鱼
   1. 制备至少20 0.9倍磷酸盐缓冲盐水（FBS / PBS）10％热灭活的胎牛血清中的溶液。
   2. 加入1毫升FBS / PBS中，以盐肝素钠的一个管形瓶（300个单位）。
   3. 选择鱼轴承在身体的超过50％的肿瘤，或者具有进食困难或游泳那些鱼。用三卡因或冰水浸泡过量他们牺牲的鱼。确认通过鳃运动和心跳的缺乏死亡。
   4. 用刀片除去鱼的头部。
   5. 洗鱼的空腔与肝素溶液以除去过量的红血细胞。
      1. 使用移液管，注入100微升肝素溶液（在步骤1.3.2的方法制备）成鱼的体腔内。去除溢出的所有液体（它将包含血细胞），并将其移液到1.5mL微量离心管中。
      2. 选用一个新鲜枪头再次冲洗身体。执行至少三次洗涤，或直到溢出从液体出现免费BL的洪水。
      3. 从在步骤1.3.5.1和1.3.5.2洗液丢弃所有液体，因为它不会在进一步的分析中使用。
   6. 收集白血病细胞。
      1. 注入100μL的FBS / PBS的成鱼的体腔内。
      2. 轻轻推压到鱼与移液管尖端的主体的外侧以挤压/压出的肿瘤细胞。
         注意：如果使用解剖显微镜执行该步骤，所述肿瘤细胞溢出体腔将是显而易见的。
      3. 收集液体和细胞从每个洗到1.5mL微量离心管中。
      4. 重复步骤1.3.6.1-1.3.6.3直到大部分肿瘤细胞被收集（通常5-10倍）。收集所有的肿瘤细胞在同一个1.5毫升微量离心管中。使细胞保持在室温下。
   7. 轻轻吹打它们以解离细胞的团块混合来自步骤1.3.6收集到的肿瘤细胞。通过4过滤细胞悬浮液0-μm筛网。用100μLFBS / PBS清洗过滤器1-2次。将细胞保持在室温。
   8. 将2μL细胞悬浮液与18μL台盼蓝（0.4％，1:10稀释，并过滤）在新管中混合。在血细胞计数器上加载10μL，计数活（非蓝）荧光细胞数，计算分离的肿瘤细胞数。
      注意：非蓝色GFP阴性细胞可能是正常的，非恶性的T细胞，不应该计数。使用Hoechst 33342染色细胞需要至少2×10 ^6个细胞。

2.用Hoechst 33342染色荧光标记的T-ALL细胞以鉴定侧面群体

1. 稀释的Hoechst 33342 1:10用无核酸酶的H ₂ O制成1mg / mL的工作浓度。将染料在4℃和黑暗中储存。
2. 通过将49.1mg溶解在1mL二甲基亚砜（DMSO）中来制备维拉帕米的100mM溶液。
   注：维拉帕米是ABC转运的抑制剂，并且是侧群实验的重要控制。添加维拉帕米样品会抑制ABC转运至外排赫斯特33342染料的能力。因此，当维拉帕米加入到样品真实的一面人口将消失。
3. 设定水浴至28℃。
4. 通过添加细胞和解决方案，荧光激活细胞分选仪（FACS）管制备在黑暗中的样品和对照。
   1. 通过加入10个^6个细胞，/ 15μL的1毫克姆·霍赫斯特33342，和2.5微升DMSO的至FACS管中制备样品。调整音量，以1毫升FBS / PBS。
   2. 通过加入10个^6个细胞，/ 15μL的1毫克姆·霍赫斯特33342，和100mM的2.5μL维拉帕米至FACS管中制备的对照。调整音量，以1毫升FBS / PBS。
      注：至少10个^6个细胞的/推荐的样品，但染色更多的细胞是优选的，特别是如果侧populat离子电池将被排序以用于进一步分析。不超过10个^6个细胞/毫升，并保持在15微克/毫升的Hoechst的33342浓度。如果10×10 ^6个细胞染色时，总反应体积为10毫升。
5. 在孵育在黑暗中120分钟的28℃水浴中。
6. 培养结束后，立即置于冰上的细胞，并让他们在黑暗中。
7. 沉淀细胞在4℃下在300×g下6分钟。除去上清液。用1mL FBS / PBS清洗。
8. 沉淀细胞在4℃下在300×g下6分钟。除去上清液。重悬细胞在1mL FBS / PBS中。
9. 保持在4℃直至细胞分选。
10. 到的细胞分选，加入2μL的碘化丙啶（PI）的库存（1毫克/毫升），以每1毫升FBS / PBS的15分钟之前（终浓度：2微克/毫升）。拌匀。

3.使用FACS找到荧光标记的T-ALL细胞群中侧群

1. 确定门的活，GFP + T-ALL细胞。
   1. 使用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）区与栅极出碎屑。
      注：FSC是用来区分细胞大小和SSC用于区分细胞的粒度。
   2. 使用FSC和SSC宽度歧视双峰。
      注意：有通过流式细胞仪检测器确定了三个部分组成：面积，高度，和宽度。区域通常用于测量细胞的荧光。宽度测量的飞行时间，两倍宽，如果两个小区时聚集在一起。
   3. 对于活肿瘤细胞，绘制使用适当的检测器周围的正面为GFP和阴性PI细胞的栅极（ 例如 ，FITC对GFP和PerCP Cy5-5为PI）。
注意：如果存在，侧面人群在建立之后将是明显的。重要的是，侧面人群必须在维拉帕米控制中消失，才能将其视为真正的人口。
2. 如果对侧面细胞进行分选以进一步实验，则使用大的喷嘴尖端（100μm），并将细胞收集到含有3 mL 100％FBS的FACS管中。使用较大的喷嘴尖端（100μm）而不是较小的尖端（70μm），以提高分选后的细胞活力。

Representative Results

为了有效地产生荧光myc基因诱导的T-ALL在斑马鱼中的肿瘤，通过转座TOL2位点侧接的环状DNA构建体可以被共注射TOL2 RNA。从注射线性化DNA引入斑马鱼胚胎以前的研究报告，5％的转基因率^8。与协议调整包括TOL2介导的转基因，转基因率从10-44％，可观察到（ 表1）。

在代表性例子中，与GFP + T-ALL鱼用Hoechst 33342染色以确定细胞在侧群的百分比。 图1示出用于确定侧群细胞的百分比的选通方案。首先，使用FSC和SSC中，T-ALL细胞通过排除碎片（ 图1A），并随后选择对双重峰分离（ 图1B）。接下来，通过对GFP +进行门控细胞分离所有活细胞，并通过死细胞鉴别器PI（ 图1C ）分离阴性细胞。一旦选择了单个活的T-ALL细胞，侧面群体可以在Hoechst 33342轮廓中找到。在主细胞群中，Hoechst 33342保留在细胞中，这些细胞可以通过DNA含量分成组。然而，由于细胞膜上的ABC转运蛋白数量较多，侧面细胞外排染料，细胞的侧面群体与主要细胞群体区分开。为了可视化侧面人口，Hoechst轮廓用于比较两个通道，Hoechst Blue和Hoechst Red。侧群体是从主细胞群体的左侧朝向Hoechst蓝色轴线延伸的细胞的暗淡的尾巴（ 图1D ）。

当细胞用抑制剂治疗时，真正的人群将会丢失˚FABC转运，如维拉帕米。 图2示出几个代表性T-ALL肿瘤侧种群，以及当这些肿瘤用Hoechst 33342染色过程中与维拉帕米处理以确保样品中发现的人口是一个真正的侧群如，那些细胞必须消失在抑制剂的存在下，如示于图2。

库存数量	的鱼屏蔽	一些积极	转基因率
930	21	3	14.3％
934	12	4	33.3％
950	12	五	41.7％
951	19	3	15.8％
960	3 </ TD>	1	33.3％
983	9	4	44.4％
1004	三十	3	10.0％
1013	4	1	25.0％
1025	35	五	14.3％
1029	10	2	20.0％
1065	五	1	20.0％
1070	6	1	16.7％
1073	19	8	42.1％
1079	8	1	12.5％
1105	38	7	18.4％
1193	三十	8	26.7％
1215	9	1	11.1％
1229	10	2	20.0％
1314	6	1	16.7％

表1：使用tol2转座子质粒显微注射到斑马鱼胚胎时的转基因率。计算出的转基因速率为十九个单独的注射天数。筛选的鱼数表示注射后21天仍然存活的鱼数，数量阳性代表荧光肿瘤阳性的鱼数。

图1：侧面人口门控方案。用于鉴定斑马鱼中GFP + T-ALL中的侧群的门控方案的一个例子。 （ A ）首先，使用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的区域。 （B）接着，单个细胞通过歧视使用FSC和SSC宽度参数双重隔离。 （C）由于本例是肿瘤GFP +，所有活细胞必须是死细胞标记物碘化丙啶GFP +和负。 （D）的侧群可以与Hoechst的红与蓝的Hoechst轮廓中看到。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：侧群消失当与ABC转运蛋白抑制剂，维拉帕米治疗。为侧群盖茨所示。顶部面板显示四个不同的肿瘤样本。需要注意的是并不是所有的肿瘤具有相同的侧群比例和侧群CA是很重要的Ñ寻找测试的每个肿瘤不同。底部面板显示，用Hoechst 33342染色以阻止染料流出期间与维拉帕米治疗的肿瘤样品。而侧种群可能看起来不同对于每个肿瘤，维拉帕米的效果是一样的：侧群消失。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

侧群测定法是高度敏感的;因此，该协议的微小变化可导致在检测侧群细胞是困难的。首先，在染色步骤中的温度是特定于每个动物/细胞系统。对于哺乳动物系统中，侧群测定典型地在37℃下²进行。当斑马鱼T-ALL细胞在37℃孵育，许多细胞死亡，这使得在该温育温度不可接受（数据未示出）。当小林和他的同事（2008），斑马鱼解剖肾髓的侧群分析中，温育在^25℃，5进行。在该温育温度不足以用于斑马鱼T-ALL细胞，因为它导致了弱的Hoechst 33342轮廓（数据未示出）。在这里描述的协议，28℃的温育温度是最佳的，以保持细胞生存力和实现强劲的Hoechst 33342轮廓。

为侧群测定，需要考虑与现有的测试第二个条件是Hoechst公司33342的浓度如果赫斯特33342的浓度过低时，侧群可能不可见，或侧群的表型（染料流出能力）可被错误地增加，识别多个侧群细胞比实际存在^2。在另一方面，过高的Hoechst 33342的浓度可能是有毒的细胞。斑马鱼T-ALL细胞，15微克/姆·霍赫斯特33342孵育120分钟是最佳的组合。赫斯特33342的低浓度被尝试用于斑马鱼T-ALL细胞，但侧群并不总是明显的（数据未示出）。的90分钟的总孵育时间为足以检测侧群，但之后的温育时间120分钟观察侧群细胞的最大数目。

正如前面哺乳动物员的报告 ystems，并不是每个肿瘤都会有可检测的边群^17,18,19 。使用这种方法，我们观察到17个T-ALL测试中的14个（数据未显示）。从T-ALLs分离的侧面群体细胞，这种方法预期适用于其他斑马鱼肿瘤模型。

在异质斑马鱼T-ALL肿瘤内，白血病起始细胞（LIC）能够重新启动肿瘤生长，因此被认为是导致癌症复发和转移的原因。目前，斑马鱼没有方法可以在体内预期分离LIC。计算LIC频率需要有限稀释的肿瘤细胞移植8,10。以前发表的克隆斑马鱼研究已经发现，LIC占原代T-ALL细胞的0.1-1.4％“外部参照”> 10。在此，在从克隆斑马鱼T-承滴盘侧群细胞（0.2-1.0％）的频率类似的变异被报告（ 图2）。进一步的实验，需要确定在低收入国家侧群是否富集;然而，LIC频率的范围和侧群细胞在这些T承滴盘的百分比之间的相似性支持这一假设。

而侧人口分析是敏感的，并不总是很容易进行，该测定法允许研究人员，对于第一次，在斑马鱼细胞的罕见群体分离T-ALL可具有干细胞或祖细胞的性质。目前没有在斑马鱼中，以确定茎或祖细胞样细胞可用细胞表面标记物;因此，分离出侧群的能力是非常有前途的。该方法的未来应用包括排序的侧群T-ALL细胞的有限稀释移植实验，以评估L的富集集成电路。此外，这种方法将允许限定低收入国家特性待阐明，包括支配在斑马鱼T-ALL低收入国家的分子机制。这些实验可以为新的治疗靶点的发现为T-ALL提供了出发点。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syngeneic zebrafish (CG2)			See Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plasmid			Langenau Laboratory
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab			rag2 promoter from Langenau Laboratory
pCS2-transposase plasmid			Chien Laboratory
NotI -HF restriction enzyme	New England Bio-Labs Inc.	R3189S	500 units in 25 µL
mMessage Machine SP6 Transcription Kit	Ambion	Thermo Fisher Scientific - AM1340	25 reactions
QIAGEN Plasmid Midi Kit	Qiagen, Inc.	12643
SteREO Discovery V8 Microscope	Carl Zeiss Microscopy	495015-0008-000
Digital microinjector	Tritech Research	MINJ-D
Brass straight-arm needle holder	Tritech Research	MINJ-4
Magnetic base and stand	Tritech Research	MINJ-HBMB
Micromanipulator	Narishige International	MN153
Glass capillaries	Sutter Instrument Co.	B100-50-10	10 cm without filament
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Microloader pipette tips	Eppendorf North America Inc.	930001007
Phenol Red solution	Sigma Life Science	P0290	0.5% concentration 100 mL
Plastic Transfer pipettes	Fisherbrand	137119D	graduated 7.5 mL bulb
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Western Chemical, Inc.	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco by Life Technologies	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 mL
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	2106	15 - 300 unit vials
40 µm mesh filter	Falcon Corning Brand	352340	Case of 50
Trypan blue	Sigma Life Science	T8154	20 mL - Solution (0.4%)
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	10 mL
Verapamil	Sigma Life Science	V4629	1 g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Life Science	D8418	100 mL
Propidium Iodide	Life Technologies	P3566	10 mL
FACSAria Fusion cell sorter	BD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1	BD Biosciences
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC