Summary
Her beskriver vi en teknik til isolering af sidebefolkningscellerne fra en zebrafiskmodel af myc-induceret T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL). Denne sidebestemmelsesanalyse er meget følsom og er beskrevet for zebrafisk T-ALL, men den kan være anvendelig for andre maligne og ikke-maligne zebrafiskcelletyper.
Abstract
Heterogene cellepopulationer, fra enten raske eller maligne væv, kan indeholde en population af celler kendetegnet ved en differens evne til udstrømning DNA-bindende farvestof Hoechst 33342. Denne "side population" af celler kan identificeres under anvendelse af flow-cytometriske metoder efter Hoechst 33342 farvestof er begejstret ved en ultraviolet (UV) laser. Den side population af mange celletyper indeholder stem- eller progenitor-celler. Men ikke alle celletyper har en identificerbar side befolkning. Danio rerio, zebrafisk, har en robust in vivo model af T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL), men om disse zebrafisk T-alls har en side befolkning er ukendt. Den her beskrevne metode skitserer, hvordan man isolere side population celler i zebrafisk T-ALL. Til at begynde, er T-ALL i zebrafisk genereret via mikroinjektion af tol2 plasmider i en celle embryoer. Når tumorerne er vokset til et stadium, hvor de udvide til mere end halvdelen af animal krop, kan de T-ALL-celler høstes. Cellerne farves derefter med Hoechst 33342 og undersøgt ved flowcytometri til side population celler. Denne metode har brede anvendelser i zebrafisk T-ALL forskning. Mens der er ingen kendte celleoverflademarkører i zebrafisk, der bekræfter, om disse side population celler er cancer stamcelle-lignende, in vivo funktionelle transplantationssystemerne assays er mulige. Desuden kunne encellede transcriptomics anvendes til at identificere de genetiske træk ved disse side population celler.
Introduction
Den side befolkning assayet udnytter den forbedrede evne af visse celler i et væv til udstrømning det DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 som følge af høje niveauer af ATP-binding cassette (ABC) transportproteiner på cellemembranen. De celler, der efflux Hoechst 33342 farvestoffet kan identificeres under anvendelse dobbelt bølgelængde flowcytometrisk analyse efter farvestoffet exciteres med en UV-laser. Dette assay blev først anvendt til at identificere murine hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) 1, men det er siden blevet anvendt til at identificere stamceller / progenitor cellepopulationer i mange væv og cancer (gennemgået i reference 2). Men ikke alle populationer af celler har en side befolkning, og ikke alle bivirkninger populationer beriget for stamceller / progenitorceller.
Zebrafisken er en kraftfuld hvirveldyr genetisk modelsystem til forskning i menneskers kræft 3, 4, med en række fordele frem for traditionelle murine moDels af kræft. Zebrafish embryoner er eksternt befrugtede og er optisk klare, letter transgenese og in vivo observation af patologiske processer, herunder kræftinitiering og progression. Hidtil har sidebestemmelsesassayet til at detektere potentielle stamme- eller stamceller kun været anvendt på nyremarven i zebrafisk for at identificere HSC'er og ikke til nogen zebrafiskkræftmodeller 5 , 6 .
Zebrafish-modellen af T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) er morfologisk og genetisk ligner humant T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL er en aggressiv malignitet, som hos mennesker tegner sig for 10-15% af pædiatriske og 25% af voksne ALL-tilfælde 9 . Mens behandlingen af T-ALL er forbedret, er tilbagefald stadig almindeligt og er forbundet med en dårlig prognose. T-ALL-tumorer er heterogeneOus og indeholder mange forskellige tumorcelle-subpopulationer, herunder leukæmi-initierende celler (LIC'er). LIC'er er defineret ved deres evne til at genvinde hele tumoren fra en enkelt celle, og hyppigheden af LIC'er i en tumorcellepopulation kan beregnes ved at transplantere varierende celledoser til recipienter via en begrænsende fortyndingstransplantationsassay (LDA). Mens LDA eksperimenter er blevet udført i zebrafisk for at beregne frekvensen af LICs 8 , 10 , 11 , er denne bestemmelse foretaget i eftersyn og tillader ikke den fremtidige isolering af LIC'er. Derfor mangler en metode til prospektivt isolering af en population beriget for kræft stamcelleaktivitet. Identifikation og isolering af sidebefolkningsceller fra zebrafisk T-ALL er det første skridt i retning af at afhjælpe denne mangel.
Den her præsenterede protokol beskriver, hvordan man effektivt genererer T-ALL-tumorer i zebrAfish ved hjælp af tol2-medieret transgenese, høst T-ALL-tumorcellerne og farvene dem med Hoechst 33342 for at identificere sidepopulationen af celler. Fremtidige in vivo eksperimenter med zebrafisk T-ALL kunne indeholde, om sidebefolkningscellerne er beriget for LIC'er eller har andre stam- eller stamcellerlignende egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer med zebrafisk er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Chicago. The University of Chicago er akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Generering og Isolating fluorescensmærkede T-ALL celler i zebrafisk
- Mikroinjektion i syngene zebrafiskembryoer
- Anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, isolere cirkulær rag2: c-myc og rag2: grønt fluorescerende protein (rag2: GFP) plasmid-DNA indeholdende inverterede terminale gentagelser anerkendt af tol2 transposase (se Tabel over Materialer til kilde af plasmid-DNA) 12 og eluering af DNA i sterilt vand.
BEMÆRK: GFP anvendes i denne undersøgelse, men en hvilken som helst fluorescerende protein vil arbejde. - Forberede pCS2-transposase (tol2) RNA
- Isoler tol2 plasmid-DNA under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits (se tHan Tabel af materialer til kilden til plasmid DNA) 12 og eluere DNA'et i sterilt vand.
- Inkubér 1 μg tol2-DNA ved 37 ° C i 1 time med 5 enheder NotI-restriktionsenzym i den passende buffer for at linearisere plasmidet. Varmeinaktivere NotI ved 65 ° C i 20 minutter.
- Transkriberer tol2-RNA'en med SP6-RNA-polymerase fra det lineariserede DNA ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt RNA-transkriptionssæt 13 . Opbevar RNA'en i engangs-alikvoter ved -80 ° C.
- Forbered injektionsblandingen på is ved at tilsætte 250 ng rag2 : c-myc plasmid-DNA, 250 ng rag2 : GFP plasmid DNA, 150 ng tol2 RNA og 0,5 μl fenolrød. Juster lydstyrken til 10 μL med nukleasefrit vand.
- Injicer ~ 1 nl injektionsblanding i cellen af et syngentisk zebrafiskembryo med en celle-fase ved hjælp af en mikroinjektor og nål trukket fra et glaskapillarrør efter tidligere estabnedsat metoder 8, 14.
BEMÆRK: Syngene zebrafisk genereret af partenogenese 15 bruges her til at eliminere genetisk heterogenitet og immun afstødning efter transplantation. Imidlertid kan også anvendes vildtype zebrafisk eller hvilken som helst ønsket stamme. - Fjerne døde, underudviklede eller misdannede embryoer ved 24 timer og 48 timer efter injektion 16.
- Placer det injicerede fisk på fisk system på 6 dage efter injektion og hæve dem i henhold til standard-protokol 6.
- Anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, isolere cirkulær rag2: c-myc og rag2: grønt fluorescerende protein (rag2: GFP) plasmid-DNA indeholdende inverterede terminale gentagelser anerkendt af tol2 transposase (se Tabel over Materialer til kilde af plasmid-DNA) 12 og eluering af DNA i sterilt vand.
- Screening injiceret zebrafisk og overvågning tumorvækst
- 21 dage efter injektion, placere en enkelt injiceret larve i en dråbe af embryo medium på en petriskål og screening for GFP-fluorescens ved anvendelse af et epifluorescensmikroskop (excitation bandpass: 470/40, emission bandpass: 525/50) 8.
BEMÆRK: Zebrafisk larver, der have integreret både rag2: c-myc og rag2: GFP vil have et grønt fluorescerende thymus (positiv fisk) og kan allerede udvise en udvidelse af maligne grønne fluorescerende celler uden thymus. Alle fisk med et GFP + thymus vil gå på at udvikle en GFP + T-ALL. Larverne, der ikke demonstrerer integration af plasmider vil ikke have nogen grønne fluorescerende celler (negativ fisk). - Adskil negative fisk (baseret på en manglende fluorescens) til en anden tank og overvåge fiskene igen efter 28 og 35 dage efter injektion. Ved 28 og 35 dage efter injektion, bedøver fisken med 0,02% pufret tricaine (MS-222) i fisk systemet vand før screening.
- Placer hver zebrafisk larve, der er positivt for en fluorescensmærket thymus eller en fluorescensmærket tumor i et individ tank til overvågning tumorvækst tre gange om ugen.
- 21 dage efter injektion, placere en enkelt injiceret larve i en dråbe af embryo medium på en petriskål og screening for GFP-fluorescens ved anvendelse af et epifluorescensmikroskop (excitation bandpass: 470/40, emission bandpass: 525/50) 8.
- Indsamling af fluorescensmærkede T-ALL celler fra den primære tumor fisk
- Fremstilles mindst 20 ml 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum i 0,9x phosphatpufret saltvand (FBS / PBS).
- Tilsæt 1 ml FBS / PBS til et hætteglas af heparin-natriumsalt (300 enheder).
- Vælg fisk bærende tumorer i mere end 50% af kroppen, eller de fisk, der har svært ved at spise eller svømning. Sacrifice fisken ved overdosering dem med tricaine eller ved isvand nedsænkning. Bekræft døden ved mangel en af Gill bevægelse og hjerteslag.
- Brug et barberblad til at fjerne lederen af fisk.
- Vask hulrummet i fisken med heparinopløsning at fjerne overskydende røde blodlegemer.
- Anvendelse af en pipette, indsprøjtes 100 pi heparin-opløsning (fremstillet i trin 1.3.2) i legemshulen af fisken. Fjerne al væske, der udslip ud (det vil indeholde blodlegemer) og pipette den ind i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Brug en frisk pipettespids til at vaske kroppen igen. Udføre mindst tre vaske, eller indtil væsken der udslip ud vises fri for blOOD.
- Kassér al væske fra vaskerne i trin 1.3.5.1 og 1.3.5.2, da det ikke vil blive anvendt i yderligere analyser.
- Indsamle leukæmicellerne.
- Injicer 100 μl FBS / PBS i fiskens kropshulrum.
- Påfør forsigtigt tryk på ydersiden af fiskens krop med pipettespidsen for at klemme / skubbe ud tumorcellerne.
BEMÆRK: Hvis dette trin udføres ved hjælp af et dissekeringsmikroskop, vil tumorcellerne, der spilder ud af kropshulrummet, være tydelige. - Saml væsken og cellerne fra hver vask i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Gentag trin 1.3.6.1-1.3.6.3, indtil de fleste tumorceller samles (normalt 5-10 gange). Saml alle tumorceller i det samme 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold cellerne ved stuetemperatur.
- Bland de opsamlede tumorceller fra trin 1.3.6 ved forsigtigt at pipettere dem for at dissociere cellerne. Filtrer cellesuspensionen gennem en 40-um mesh filter. Filteret vaskes 1-2 gange med 100 pi af FBS / PBS. Holde cellerne ved stuetemperatur.
- Bland 2 pi cellesuspension med 18 pi af trypanblåt (0,4%, fortyndet 1:10 og filtreret) i et nyt rør. Belastning 10 pi på et hæmocytometer og tælle antallet af levende (ikke-blå) fluorescerende celler for at beregne antallet af isolerede tumorceller.
BEMÆRK: Ikke-blå GFP-negative celler er sandsynligvis normale, ikke-maligne T-celler og bør ikke medregnes. Mindst 2 x 10 6-celler er nødvendige for at farve cellerne med Hoechst 33342.
2. farvning af fluorescerende mærkede T-ALL Celler med Hoechst 33342 til Identificer Side Befolkning
- Fortynd Hoechst 33342 1:10 med nukleasefri H2O til at 1 mg / mL arbejdskoncentrationen. Opbevare farvestoffet ved 4 ° C og i mørke.
- Forberede en 100-mM opløsning af verapamil ved at opløse 49,1 mg i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO).
BEMÆRK: Verapamil er en inhibitor af ABC-transportører og er en vigtig kontrol for side population eksperimenter. Tilføjelse verapamil til prøver vil inhibere evnen af ABC-transportører til udstrømning Hoechst 33342 farvestof. Derfor vil en ægte side befolkning forsvinder, når verapamil føjes til prøven. - Indstil et vandbad til 28 ° C.
- Forberede prøver og kontroller i mørke ved at tilføje celler og løsninger til fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) rør.
- Forberede prøverne ved tilsætning af 10 6 celler, 15 pi 1 mg / mL Hoechst 33342 og 2,5 pi DMSO til en FACS rør. Justere lydstyrken til 1 ml med FBS / PBS.
- Forberede kontrollerne ved tilsætning af 10 6 celler, 15 pi 1 mg / mL Hoechst 33342 og 2,5 pi 100 mM verapamil til en FACS rør. Justere lydstyrken til 1 ml med FBS / PBS.
BEMÆRK: Mindst 10 6 celler / prøve anbefales, men farvning flere celler foretrækkes, især hvis side population-celler vil blive sorteret til yderligere analyse. Ikke overstige 10 6 celler / ml, og vedligeholde Hoechst 33342 koncentration på 15 ug / ml. Hvis 10 x 10 6 celler farves, det totale reaktionsvolumen er 10 ml.
- Inkuber i et 28 ° C vandbad i mørke i 120 min.
- Efter inkubationen straks placere cellerne på is og holde dem i mørke.
- Pelletere cellerne ved 4 ° C i 6 min ved 300 x g. Fjern supernatanten. Vask med 1 ml FBS / PBS.
- Pelletere cellerne ved 4 ° C i 6 min ved 300 x g. Fjern supernatanten. Resuspendere cellerne i 1 ml FBS / PBS.
- Hold ved 4 ° C indtil cellesortering.
- 15 min før cellesortering, tilsættes 2 pi propidiumiodid (PI) lager (1 mg / ml) til hver 1 ml FBS / PBS (slutkoncentration: 2 pg / ml). Bland godt.
3. Brug FACS at finde den Side Befolkning i fluorescerende mærkede T-ALL cellepopulation
- Bestem en port for de levende, GFP + T-ALL-celler.
- Brug fremad scatter (FSC) og side scatter (SSC) område til at slukke for affald.
BEMÆRK: FSC bruges til at skelne mellem cellestørrelse og SSC bruges til at skelne mellem granulariteten af cellen. - Brug FSC og SSC bredde til at diskriminere dubletter.
BEMÆRK: Der er tre komponenter identificeret af flowcytometerdetektorerne: område, højde og bredde. Område bruges typisk til at måle fluorescensen af cellen. Bredden måler tidspunktet for flyvningen og er dobbelt så bred, hvis to celler klumpes sammen. - For levende tumorceller tegnes en port omkring cellerne positive for GFP og negativ for PI ved brug af de relevante detektorer ( fx FITC for GFP og PerCP Cy5-5 for PI).
- Brug fremad scatter (FSC) og side scatter (SSC) område til at slukke for affald.
- Hvis sortering af side population celler til yderligere eksperimenter, bruge den store dysespids (100 um) og opsamle cellerne i en FACS-rør indeholdende 3 ml 100% FBS. Bruge en større dysespids (100 um) i stedet for den mindre spids (70 um) for at forbedre cellernes levedygtighed efter sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til effektivt at generere fluorescerende myc-induceret T-ALL tumorer i zebrafisk, cirkulære DNA-konstruktioner flankeret af tol2 transposasesekvenser sites kan co-injiceret med tol2 RNA. Tidligere undersøgelser fra injektionen af lineariseret DNA i zebrafiskembryoer rapportere en 5% transgenese rate 8. Med protokollen justeret til at omfatte tol2-transgenese kan transgenese i området fra 10-44% observeres (tabel 1).
I den repræsentative eksempel blev en fisk med en GFP + T-ALL farvet med Hoechst 33342 for at bestemme procentdelen af celler i siden population. Figur 1 viser gating skema anvendes til at bestemme procentdelen af side population celler. Først under anvendelse FSC og SSC er de T-ALL-celler isoleret ved at udelukke affald (figur 1A) og efterfølgende selektion mod dubletter (figur 1B). Derefter isoleres alle levende celler ved gating celler, der er GFP + og negative for den døde celle diskriminator PI ( figur 1C ). Når de enkelte, levende T-ALL-celler er valgt, kan sidepopulationen findes i Hoechst 33342-profilen. I hovedcellepopulationen forbliver Hoechst 33342 i cellerne, og disse celler kan separeres i grupper ved hjælp af DNA-indhold. Cellepopulationen er imidlertid forskellig fra hovedcellepopulationen, da sidebefolkningscellerne udstrømmer farvestoffet som følge af højere antal ABC-transporters på cellemembranen. For at visualisere sidepopulationen anvendes Hoechst-profilen til at sammenligne to kanaler, Hoechst Blue og Hoechst Red. Sidepopulationen er den svage hale af celler, der strækker sig fra venstre side af hovedcellepopulationen mod Hoechst Blue-aksen ( Figur 1D ).
En ægte sidepopulation vil gå tabt, når cellerne behandles med en hæmmer of ABC-transportører, såsom verapamil. Figur 2 viser den side populationer i adskillige repræsentative T-ALL tumorer, samt når de tumorer behandles med verapamil under farvning med Hoechst 33342. For at sikre, at befolkningen i prøven er en sand side befolkning, skal de celler forsvinde i nærvær af inhibitoren, er som vist i figur 2.
| Lagernummer | Antal fisk Skærmet | Nummer Positiv | Sats for Transgenese |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabel 1: Transgenesatser ved anvendelse af Tol2 Transposase til Plasmid Mikroinjektion i Zebrafish Embryoer. De beregnede transgenesehastigheder er vist i 19 separate injektionsdage. Antalet fisk, der screenes, repræsenterer antallet af fisk, der forblev levende 21 dage efter injektion, og tallet Positivt repræsenterer antallet af fisk, som var positive for fluorescerende tumorer.
Figur 1: Sidebefolkning Gating Scheme. Et eksempel på gating-skemaet, der anvendes til at identificere sidepopulationen i en GFP + T-ALL i zebrafisk. ( A ) For det første er snavset udelukket ved hjælp af fremad scatter (FSC) ogSide scatter (SSC) område. ( B ) Derpå isoleres enkeltceller ved at diskriminere dubletter ved anvendelse af FSC- og SSC-breddeparametre. ( C ) Da dette eksempel var tumor, var GFP +, skal alle levende celler være GFP + og negative for den døde celle markør Propidium Iodide. ( D ) Sidepopulationen kan ses med Hoechst Red versus Hoechst Blue profilen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sidebefolkningen forsvinder, når den behandles med ABC Transporter Inhibitor, Verapamil. Porte til sidebefolkningen er vist. De øverste paneler viser fire forskellige tumorprøver. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle tumorer har den samme sidepopulation, og sidebefolkningen ca.n ser anderledes for hver testet tumor. De nederste paneler viser tumorprøver, der blev behandlet med verapamil under farvning med Hoechst 33342 for at blokere farvestof efflux. Mens den side befolkninger kan se anderledes ud for hver tumor, effekten af verapamil er det samme: den side befolkning forsvinder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den side befolkning analysen er meget følsomme; derfor kan små ændringer i protokollen resultere i en vanskeligt at opdage side population celler. Først er temperaturen under farvningen trin er specifik for hvert dyr / cellesystem. For mammale systemer er den side befolkning assayet udføres typisk ved 37 ° C 2. Når zebrafisk T-ALL-celler blev inkuberet ved 37 ° C, mange af cellerne døde, hvilket gjorde denne inkubationstemperatur uacceptabelt (data ikke vist). Når Kobayashi og kolleger (2008) dissekeret zebrafisk nyre marv til side befolkning assayet blev inkubationer udført ved 25 ° C 5. Denne inkubation temperatur ikke var tilstrækkeligt for zebrafisk T-ALL-celler, som det resulterede i en svag Hoechst 33342 profil (data ikke vist). I protokollen beskrevet her, en inkubationstemperatur på 28 ° C var optimal for at opretholde cellelevedygtighed og at opnå en stærk Hoechst 33342 profil.
En anden betingelse for sidebestemmelsesassayet, som kræver overvejelse og forudgående testning, er koncentrationen af Hoechst 33342. Hvis koncentrationen af Hoechst 33342 er for lav, kan sidepopulationen muligvis ikke være synlig, eller sidebefolkningens fænotype (farveudstrømningsevne) kan Blive forøget forøget, identificere flere sidebefolkningsceller end faktisk er til stede 2 . På den anden side kan for høj koncentration af Hoechst 33342 være giftig for cellerne. For zebrafisk-T-ALL-celler er 15 μg / ml Hoechst 33342 inkuberet i 120 minutter den optimale kombination. Lavere koncentrationer af Hoechst 33342 blev forsøgt for Zebrafish T-ALL-celler, men sidepopulationen var ikke altid tydelig (data ikke vist). En total inkubationstid på 90 minutter var tilstrækkelig til at detektere en sidepopulation, men det maksimale antal sidepopulationsceller blev set efter 120 min inkubationstid.
Som tidligere rapporteret for pattedyr s ystems, vil ikke hver tumor har en påviselig side befolkning 17, 18, 19. Anvendelse af denne fremgangsmåde, observerede vi en side befolkning i 14 af 17 T-Alls testet (data ikke vist). Under isoleret side population celler fra T-alls forventes denne metode at være anvendelig til andre zebrafisk tumormodeller.
Inden den heterogene zebrafisk T-ALL tumor, leukæmi initierende celler (LIC) er i stand ved at genoptage tumorvækst og som sådan menes ansvarlig for cancer tilbagefald og metastaser. I øjeblikket er der ingen metode i zebrafisk, der tillader den mulige isolation af LIC'er in vivo. Beregning af LIC frekvens kræver tumorcelle transplantation på en begrænsende fortynding 8, 10. Tidligere publicerede undersøgelser med klonal zebrafisk har identificeret at LIC'er udgør 0,1-1,4% af primære T-ALL celler"Xref"> 10. Her er der rapporteret lignende variation i hyppigheden af sidebefolkningsceller (0,2-1,0%) fra klonale zebrafisk T-ALL'er ( Figur 2 ). Yderligere eksperimenter er nødvendige for at bestemme, om sidepopulationen er beriget i LIC'er; Imidlertid understøtter ligheden mellem LIC-frekvenserne og procentdelen af sidepopulationceller i disse T-ALL'er denne hypotese.
Mens sidebestemmelsesassayet er følsomt og ikke altid let at udføre, tillader analysen for første gang at isolere en sjælden population af celler i zebrafisk T-ALL, som kan have stamme- eller stamcelleegenskaber. Der er i øjeblikket ingen celleoverflademarkører tilgængelige i zebrafisk for at identificere stam- eller stamcellerlignende celler; Dermed er evnen til at isolere sidebefolkningen meget lovende. Fremtidige anvendelser af denne metode indbefatter grænsevandsfortyndingstransplantationsforsøg af sorterede sidepopulation T-ALL-celler for at vurdere berigelsen af LIC'er. Desuden vil denne metode tillade karakteristika, der definerer LIC'er, der skal belyses, herunder de molekylære mekanismer, der styrer LIC'er i zebrafish T-ALL. Disse eksperimenter kunne give udgangspunkt for opdagelsen af nye terapeutiske mål for T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af University of Chicago Kvinders bestyrelsen, Wendy Will sag fond, og University of Chicago Omfattende Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). Vi vil gerne takke flowcytometri Core på University of Chicago for deres hjælp til opsætning dette eksperiment, og såvel som andre medlemmer af de Jong laboratorium, især Leslie Pedraza og Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
