Summary
ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。
Abstract
異種細胞集団は、健常又は悪性のいずれかの組織から、DNA結合色素を流出する差動能力によって特徴づけられる細胞の集団を含んでいてもよいヘキスト33342細胞のこの「サイドポピュレーション」は、ヘキスト33342の後にフローサイトメトリー法を用いて同定することができます染料は、紫外線（UV）レーザによって励起されます。多くの細胞型のサイドポピュレーションは、ステムまたは前駆細胞様細胞が含まれています。しかし、全ての細胞型は、識別可能なサイドの人口を持っていません。 ゼブラフィッシュ 、ゼブラフィッシュは、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL） のin vivoモデルで堅牢なを持っているが、これらのゼブラフィッシュT-オールズは、サイドポピュレーションを持っているかどうかは不明です。ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュのT-ALLにおけるサイドポピュレーション細胞を単離する方法について説明します。開始するには、ゼブラフィッシュにおけるT-ALLは1細胞期胚にTOL2プラスミドのマイクロインジェクションを介して生成されます。腫瘍は、彼らがより多くのANIの半分以上に拡大した段階まで成長したらT-ALL細胞を回収することができる。次いで、細胞をHoechst 33342で染色し、側面集団細胞についてフローサイトメトリーにより検査する。この方法は、ゼブラフィッシュのT-ALL研究において幅広い用途を有する。ゼブラフィッシュには、これらの側方集団細胞が癌幹細胞様であるかどうかを確認する既知の細胞表面マーカーは存在しないが、 in vivo機能性移植アッセイが可能である。さらに、これらの側方集団細胞の遺伝的特徴を同定するために、単一細胞トランスクリプトミクスを適用することができる。
Introduction
側方集団アッセイは、細胞膜上の高レベルのATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質のために、DNA結合色素Hoechst 33342を流出させる組織内の特定の細胞の増強された能力を利用する。 Hoechst 33342色素を流出する細胞は、色素がUVレーザーによって励起された後、二波長フローサイトメトリー分析を用いて同定することができる。このアッセイは、マウス造血幹細胞（HSC） 1を同定するために最初に用いられたが、その後、多くの組織および癌において幹/前駆細胞集団を同定するために使用されている（参考文献2で検討されている）。しかし、細胞の集団のすべてに側面集団があるわけではなく、すべての側面集団が幹/前駆細胞に対して富化されているわけではありません。
ゼブラフィッシュは、ヒトの癌を研究するための強力な脊椎動物遺伝モデルシステムです3,4、伝統的なマウスよりも多くの利点がありますがんのうずき。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精され、光学的に透明であり、遺伝子導入および癌開始および進行を含む病理学的プロセスのインビボでの観察を促進する。今日まで、可能性のある幹細胞または前駆細胞を検出するための側方集団検定は、ゼブラフィッシュの腎臓骨髄にのみ適用され、HSCを同定したが、ゼブラフィッシュ癌モデルではなかった 5,6 。
T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルは、形態学的および遺伝的にヒトT-ALL 7,8,11に類似している。 T-ALLは、ヒトでは小児の10-15％、成人ALLの25％を占める攻撃的悪性腫瘍である9 。 T-ALLの治療が改善されたが、再発は依然として一般的であり、予後不良と関連している。 T-ALL腫瘍は異種遺伝子であるOUとは、白血病開始細胞（低所得国）を含む多くの異なる腫瘍細胞の亜集団を含みます。低所得国は、単一細胞から腫瘍全体を再成長する能力によって定義され、腫瘍細胞集団内で低所得国の周波数は、限界希釈移植アッセイ（LDA）を介して、レシピエントに変化する細胞用量を移植することにより算出することができます。 LDAの実験は低所得国8、10、11の周波数を計算するためにゼブラフィッシュで行われているが、この決意は、後知恵で作られており、低所得国の将来の分離を可能にしません。そのため、プロスペクティブにがん幹細胞活性のために濃縮された集団を分離する方法が欠けています。ゼブラフィッシュT-オールズからサイドポピュレーション細胞を同定および単離することは、この欠点に対処する第一歩です。
ここで紹介するプロトコルは、効率的にzebrでT-ALL腫瘍を生成する方法について説明しますT-ALL腫瘍細胞を採取し、Hoechst 33342でそれらを染色して、細胞の側面集団を同定する。ゼブラフィッシュT-ALLを用いた将来のin vivo実験には、側方集団細胞がLICに対して富化されているか、または他の幹または前駆体様の特性を有するかどうかが含まれ得る。
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Protocol
ゼブラフィッシュのすべての手順は、シカゴ大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の承認を受けています。シカゴ大学は、実験動物管理（AAALAC）の評価と認定協会の認定を受けています。
1.ゼブラフィッシュにおける蛍光標識T-ALL細胞の生成および単離
- 同系ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション
- 市販のキットを使用して、tol2トランスポゼース（プラスミドDNAの供給源については表を参照） 12によって認識される逆方向末端反復を含む環状rag2 ：c-mycおよびrag2 ：緑色蛍光タンパク質（ rag2 ：GFP）プラスミドDNAを単離し、滅菌水で洗浄した。
注：この研究ではGFPを使用していますが、蛍光タンパク質があれば動作します。 - pCS2-トランスポゼース（tol2）RNAを調製する
- 市販のキットを用いてtol2プラスミドDNAを単離する（tプラスミドDNAの供給源の材料表） 12を用いて滅菌水でDNAを溶出させる。
- 適切なバッファーに5単位のNotI制限酵素を加えて37℃で1時間、1μgのtol2 DNAをインキュベートしてプラスミドを線状化する。 NotIを65℃で20分間加熱失活させる。
- 市販のRNA転写キット13を使用して、直鎖状DNAからSP6 RNAポリメラーゼでtol2 RNAを転写する。 -80°Cで1回分のアリコートにRNAを保存します。
- 250ngのrag2 ：c-mycプラスミドDNA、250ngのrag2 ：GFPプラスミドDNA、150ngのtol2 RNA、および0.5μLのフェノールレッドを添加することによって、氷上で注入混合物を調製する。ヌクレアーゼフリーの水で10μLに調整する。
- 先に確立された、ガラス毛細管から引き出されたマイクロインジェクターおよび針を使用して、1細胞段階の同系ゼブラフィッシュ胚の細胞に〜1nLの注射混合物を注入する。方法8,14を磨いた。
注：単為生殖により生成された同系ゼブラフィッシュは、移植後の遺伝的異種性および免疫拒絶を排除するためにここで使用される。しかし、野生型ゼブラフィッシュまたは任意の所望の株も使用することができる。 - 注射後24時間および48時間で、死亡、発育不良、または不正な形式の胚を取り除く16 。
- 注射後6日目に魚系に注射した魚を置き、標準プロトコールに従って魚を飼育する6 。
- 市販のキットを使用して、tol2トランスポゼース（プラスミドDNAの供給源については表を参照） 12によって認識される逆方向末端反復を含む環状rag2 ：c-mycおよびrag2 ：緑色蛍光タンパク質（ rag2 ：GFP）プラスミドDNAを単離し、滅菌水で洗浄した。
- ゼブラフィッシュを注射し、腫瘍増殖をモニターする
- 注入後21日目に、ペトリ皿上の胚培地の液滴中に単一注入幼虫を置き、エピ蛍光顕微鏡（励起バンドパス：470/40、放出バンドパス：525/50）を用いてGFP蛍光についてスクリーニングする。
注：ゼブラフィッシュの幼虫はhaveはrag2 ：c-mycとrag2 ：GFPの両方を統合し、緑色の蛍光胸腺（陽性魚）を有し、胸腺を越えて悪性緑色蛍光細胞の拡大をすでに示している可能性がある。 GFP +胸腺を有する全ての魚は、GFP + T-ALLを発症する。プラスミドの組込みを示さない幼虫は、緑色蛍光細胞（陰性魚）を有さない。 - 陰性の魚（蛍光の欠如に基づいて）を別のタンクに分け、注射後28および35日に再び魚をモニターする。注射後28および35日目に、スクリーニング前に魚系水中の0.02％緩衝化トリカイン（MS-222）で魚を麻酔する。
- 蛍光標識された胸腺または蛍光標識された腫瘍について陽性である各ゼブラフィッシュの幼虫を、腫瘍増殖をモニターするための個々のタンクに1週間に3回配置する。
- 注入後21日目に、ペトリ皿上の胚培地の液滴中に単一注入幼虫を置き、エピ蛍光顕微鏡（励起バンドパス：470/40、放出バンドパス：525/50）を用いてGFP蛍光についてスクリーニングする。
- 一次腫瘍魚からの蛍光標識T-ALL細胞の収集
- 0.9Xのリン酸緩衝生理食塩水（FBS / PBS）中の10％熱不活性化ウシ胎児血清の少なくとも20ミリリットルを準備します。
- ヘパリンナトリウム塩（300単位）の1つのバイアルにFBS / PBSを1ml加えます。
- 選択した魚の体の50％以上で腫瘍を保有する、またはこれらの魚は困難食べたり水泳を持ちます。トリカインまたは氷水浸漬することによって、それらを過剰投与により、魚を生け贄に捧げます。鰓の動きや心拍の欠如aで死亡を確認。
- 魚の頭を削除するためにカミソリの刃を使用してください。
- 余分な赤血球を除去するためにヘパリン溶液で魚の空洞を洗います。
- ピペットを使用して、魚の体腔内に（ステップ1.3.2で調製した）ヘパリン溶液の100μLを注入します。こぼれ全ての液体を除去（これは血液細胞を含有する）および1.5mLのマイクロ遠心チューブにそれをピペット。
- 再び体を洗うために、新鮮なピペットチップを使用してください。少なくとも3回の洗浄を行い、またはこぼれた液体は、BLの自由が表示されるまでおお
- それ以上の分析には使用されないので、ステップ1.3.5.1および1.3.5.2の洗浄液からすべての液体を捨てる。
- 白血病細胞を収集する。
- 100μLのFBS / PBSを魚の体腔に注入する。
- ピペットチップで魚の体の外側に穏やかな圧力をかけて、腫瘍細胞を絞る/押し出す。
注：このステップが解剖顕微鏡を使用して実行される場合、体腔から流出する腫瘍細胞が明らかになります。 - 各洗浄液から1.5 mLのマイクロ遠心チューブに液体と細胞を集める。
- 大部分の腫瘍細胞が採取されるまで（通常5〜10回）、ステップ1.3.6.1〜1.3.6.3を繰り返す。すべての腫瘍細胞を同じ1.5mLマイクロ遠心チューブに集める。細胞を室温に保つ。
- 穏やかにピペッティングすることにより、収集した腫瘍細胞をステップ1.3.6から混合し、細胞の塊を解離させる。細胞懸濁液を4つの0μmメッシュフィルター。 100μLのFBS / PBSでフィルターを1〜2回洗浄する。細胞を室温に保つ。
- 2μLの細胞懸濁液を18μLのトリパンブルー（0.4％、1:10に希釈して濾過したもの）と新しいチューブで混合する。血球計算器に10μLをロードし、生存（非青色）蛍光細胞の数を数えて、単離した腫瘍細胞の数を計算する。
注：非青色のGFP陰性細胞は、正常で非悪性のT細胞である可能性が高く、計数すべきではありません。 Hoechst 33342で細胞を染色するためには、少なくとも2×10 6個の細胞が必要である。
Hoechst 33342を用いて蛍光標識したT-ALL細胞を染色し、側方集団を同定する。
- Hoechst 33342 1:10をヌクレアーゼフリーのH 2 Oで希釈して、1mg / mLの作業濃度にする。 4℃および暗所で色素を保存する。
- 1 mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に49.1 mgを溶解して、ベラパミルの100 mM溶液を調製する。
注：ベラパミルはABCトランスポーターの阻害剤であり、側方集団実験の重要なコントロールである。サンプルにベラパミルを添加すると、Hoechst 33342色素を流出させるABCトランスポーターの能力が阻害される。したがって、ベラパミルをサンプルに添加すると、真の人口は消滅します。 - 水浴を28℃に設定する。
- 蛍光活性化セルソーター（FACS）チューブに細胞と溶液を加えることによって、暗所でサンプルとコントロールを準備します。
- FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、DMSO 2.5μLを加えてサンプルを調製します。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。
- FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、100 mMベラパミル2.5μLを加えてコントロールを調製する。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。
注：少なくとも10 6細胞/サンプルが推奨されますが、より多くの細胞を染色することが推奨されます。特に、イオンセルは、さらなる分析のためにソートされます。 10個の6細胞/ mLを超え、及び15μgの/ mLのヘキスト33342濃度を維持しません。 10×10 6個の細胞が染色される場合、総反応容量は10 mLです。
- 120分間、暗所で28℃の水浴中でインキュベートします。
- インキュベーション後、直ちに氷上に細胞を配置し、暗所に保管してください。
- 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLで洗浄します。
- 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLに細胞を再懸濁。
- 細胞選別まで4℃で保管してください。
- 15分前に、ソーティング、細胞FBS / PBS（最終濃度を2μg/ ml）を各1 mLのヨウ化プロピジウム（PI）ストック（1mg / ml）の2μLを追加します。よく混ぜます。
3. FACS蛍光標識T-ALL細胞集団内のサイドポピュレーションを検索します
- 生きたGFP + T-ALL細胞のゲートを決定する。
- 破片をゲートアウトするには、前方散乱（FSC）およびサイド散乱（SSC）領域を使用します。
注記：FSCはセルサイズを区別するために使用され、SSCはセルの細分性を区別するために使用されます。 - 二重線を識別するためにFSCおよびSSC幅を使用する。
注：フローサイトメーターの検出器で識別される3つの成分、面積、高さ、幅があります。面積は、典型的には、細胞の蛍光を測定するために使用される。幅は飛行時間を測定し、2つの細胞が一緒に凝集する場合、幅は2倍になります。 - 生存腫瘍細胞については、適切な検出器（ 例えば 、GFPの場合はFITC、PIの場合はPerCP Cy5-5）を使用して、GFP陽性細胞およびPI陰性細胞の周囲にゲートを描く。
- 破片をゲートアウトするには、前方散乱（FSC）およびサイド散乱（SSC）領域を使用します。
- さらなる実験のために側方集団細胞を選別する場合は、大きなノズル先端（100μm）を使用し、3mLの100％FBSを含むFACSチューブに細胞を集める。選別後の細胞の生存率を向上させるには、より小さなチップ（70μm）ではなく、より大きなノズルチップ（100μm）を使用してください。
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Representative Results
ゼブラフィッシュで蛍光myc誘導T-ALL腫瘍を効率的に生成するために、tol2トランスポザーゼ部位に隣接する環状DNA構築物をtol2 RNAと同時注入することができる。線状化DNAのゼブラフィッシュ胚への注射からの以前の研究は、5％のトランスジェネシス速度を報告している8 。プロトコールをtol2媒介性の遺伝子導入を含むように調整することにより、10〜44％の範囲の遺伝子導入率が観察され得る（ 表1 ）。
代表例では、GFP + T-ALLを有する魚をHoechst 33342で染色し、側方集団における細胞の割合を決定した。 図1は、側方集団細胞のパーセンテージを決定するために使用されるゲーティングスキームを示す。まず、FSCおよびSSCを用いて、T-ALL細胞を破片（ 図1A ）を排除し、続いてダブレット（ 図1B ）に対して選択することによって単離する。次に、すべての生きた細胞は、GFP +である細胞をゲーティングすることによって単離され、死細胞弁別子PIについては陰性である（ 図1C ）。単一の生きたT-ALL細胞が選択されると、側方集団はHoechst 33342プロファイルに見出すことができる。主細胞集団では、Hoechst 33342が細胞内に残り、これらの細胞はDNA含量によってグループに分けることができる。しかし、細胞の側方集団は、細胞集団からより多くの数のABC輸送体のために側方集団細胞が色素を流出するので、主細胞集団と区別可能である。側方集団を視覚化するために、Hoechstプロファイルを用いて、2つのチャネル、Hoechst BlueおよびHoechst Redを比較する。側方集団は、主細胞集団の左側からHoechst Blue軸に向かって延びる細胞の薄い尾部である（ 図1D ）。
真の細胞集団は、細胞が阻害剤で処置されたときに失われるfベラパミルなどのABC輸送体。 図2は、いくつかの代表的なT-ALL腫瘍における側方集団ならびにHoechst 3334での染色中にベラパミルでこれらの腫瘍を治療する場合を示しています。サンプルに含まれる集団が真の人口であることを確実にするには、 図2に示すように、インヒビターの存在下でインキュベートする。
| 在庫番号 | ナンバーフィッシュスクリーニング | Number Positive | トランスジェニックの割合 |
| 930 | 21 | 3 | 14.3％ |
| 934 | 12 | 4 | 33.3％ |
| 950 | 12 | 5 | 41.7％ |
| 951 | 19 | 3 | 15.8％ |
| 960 | 3 </ td> | 1 | 33.3％ |
| 983 | 9 | 4 | 44.4％ |
| 1004 | 30 | 3 | 10.0％ |
| 1013 | 4 | 1 | 25.0％ |
| 1025 | 35 | 5 | 14.3％ |
| 1029 | 10 | 2 | 20.0％ |
| 1065 | 5 | 1 | 20.0％ |
| 1070 | 6 | 1 | 16.7％ |
| 1073 | 19 | 8 | 42.1％ |
| 1079 | 8 | 1 | 12.5％ |
| 1105 | 38 | 7 | 18.4％ |
| 1193年 | 30 | 8 | 26.7％ |
| 1215 | 9 | 1 | 11.1％ |
| 1229 | 10 | 2 | 20.0％ |
| 1314年 | 6 | 1 | 16.7％ |
表1：ゼブラフィッシュ胚へのプラスミドマイクロインジェクションのためのtol2トランスポザーゼを用いる場合の導入遺伝子導入率。計算されたトランスジェネシス速度は、19の別々の注射日に示されている。スクリーニングされた魚の数は、注射後21日に生存していた魚の数を表し、数陽性は、蛍光腫瘍について陽性であった魚の数を表す。
図1：サイドポピュレーションゲーティングスキーム。ゼブラフィッシュのGFP + T-ALLにおける側方集団を同定するために用いられるゲーティングスキームの一例。 （ A ）まず、前方散乱（FSC）を用いてデブリを排除し、サイド散乱（SSC）領域である。 （ B ）次に、FSCおよびSSC幅パラメータを用いて二重線を識別することによって単一細胞を単離する。 （ C ）この例の腫瘍はGFP +であったため、死細胞マーカーであるPropidium Iodideではすべての生細胞がGFP +で陰性でなければならない。 （ D ）側面集団は、Hoechst Red対Hoechst Blueプロファイルで見ることができる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：ABCトランスポーターインヒビター、ベラパミルで処置した場合、側方集団が消失する。サイドポピュレーションのゲートが表示されます。上のパネルは、4つの異なる腫瘍サンプルを示す。すべての腫瘍が同じ側方集団パーセントを有するわけではなく、側方集団canは、検査された各腫瘍について異なって見える。下のパネルは、色素流出を阻止するためにHoechst 33342で染色する間にベラパミルで処理された腫瘍サンプルを示す。側方集団は腫瘍ごとに異なって見えるかもしれないが、ベラパミルの効果は同じであり、側方集団は消滅する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
側方集団検定は非常に感度が高い。したがって、プロトコールのわずかな変更は、側方集団細胞を検出することを困難にする可能性がある。第1に、染色工程中の温度は、各動物/細胞系に特異的である。哺乳動物系では、側方集団検定は典型的には37℃で実施される 。ゼブラフィッシュT-ALL細胞を37℃でインキュベートすると、多くの細胞が死んだため、このインキュベーション温度は許容できませんでした（データは示さず）。 Kobayashiら（2008）が側方集団検定のためにゼブラフィッシュ腎臓骨髄を切開したとき、25℃でインキュベーションを行った5 。このインキュベーション温度は、弱いHoechst 33342プロファイル（データ示さず）を生じたので、ゼブラフィッシュT-ALL細胞には十分ではなかった。ここに記載されたプロトコールでは、細胞生存率を維持し、強いHoechst 33342プロファイルを達成するために、28℃のインキュベーション温度が最適であった。
ヘキスト33342の濃度はできるサイドポピュレーションが表示されないことがあり、低すぎる、又は側集団表現型（色素流出能力）場合を考慮し、試験前が必要側集団アッセイのための第2の条件は、ヘキスト33342の濃度であります誤って2実際に存在するよりも多くのサイドポピュレーション細胞を同定する、増加させること。一方、ヘキスト33342の濃度が高すぎると、細胞に対して毒性であることができます。ゼブラフィッシュT-ALL細胞のために、120分間インキュベートした15μg/ ムル・ホエックスト 33342は最適な組み合わせです。ヘキスト33342の低い濃度は、ゼブラフィッシュT-ALL細胞のために試みたが、サイドポピュレーション（データは示していない）は、常に明らかではなかったです。 90分間の総インキュベーション時間は、サイドポピュレーションを検出するのに十分であったが、サイドポピュレーション細胞の最大数は、インキュベーション時間の120分後に見られました。
哺乳類のために以前に報告されているように ystemsではなく、すべての腫瘍は、検出側人口17、18、19を持っています。この方法を使用して、我々はT-オールズがテスト17の14でサイドポピュレーションを観察した（データは示さず）。 T-オールズから単離されたサイドポピュレーション細胞を有し、この方法は、他のゼブラフィッシュ腫瘍モデルへの応用が期待されています。
異種ゼブラフィッシュのT-ALL腫瘍、白血病開始細胞（低所得国）内の腫瘍成長を再開始することが可能であり、そのようなものとして癌の再発及び転移を担うと考えられています。現在、in vivoでの低所得国の将来の分離を可能にするゼブラフィッシュにおける方法がありません。 LICの周波数を計算すると、限界希釈8、10での腫瘍細胞の移植を必要とします。クローンゼブラフィッシュと以前に発表された研究は、低所得国が主要T-ALL細胞の0.1から1.4パーセントを占めることを確認しました"xref"> 10。ここでは、クローンゼブラフィッシュT-ALL由来の側方集団細胞（0.2〜1.0％）の頻度の同様の変動性が報告されている（ 図2 ）。側方集団がLICに富んでいるかどうかを判定するためにさらなる実験が必要である。しかし、これらのT-ALLにおけるLIC頻度の範囲と側方集団の割合との間の類似性はこの仮説を支持する。
側方集団検定は感度が高く、実行するのが必ずしも容易ではないが、このアッセイは、幹細胞または前駆細胞の特性を有するかもしれないゼブラフィッシュT-ALL中の稀な細胞集団を研究者が初めて分離することを可能にする。現在、幹細胞または前駆細胞様細胞を同定するためにゼブラフィッシュで利用可能な細胞表面マーカーは存在しない。従って、側方集団を単離する能力は非常に有望である。この方法の将来的な適用には、選別された側母集団T-ALL細胞の限外希釈移植実験が含まれ、Lの富化を評価するIC。加えて、この方法は、ゼブラフィッシュT-ALLにおける低所得国を支配する分子メカニズムを含む、低所得国を定義する特性を解明することを可能にします。これらの実験は、T-ALLのための新たな治療標的の発見のための出発点を提供することができます。
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Disclosures
著者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この研究はシカゴ大学女性委員会、ウェンディウィル症例基金、シカゴ大学総合がんセンター支援グラント（P30 CA014599）の支援を受けました。シカゴ大学のフローサイトメトリーコア（Flow Cytometry Core）に感謝したいと思います。この実験の設立には、ドゥ・ジョン研究所の他のメンバー、特にレスリー・ペドラザとショーン・マッコネルもお手伝いします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
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