Summary
Здесь мы описываем методику выделения боковых популяционных клеток из модели данио-рыбки, индуцированной микозом острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), вызванной myc. Этот популяционный анализ популяции очень чувствителен и описан для данио T-ALL, но он может быть применим и к другим злокачественным и злокачественным типам клеток данио.
Abstract
Гетерогенные клеточные популяции из здоровых или злокачественных тканей могут содержать популяцию клеток, характеризующуюся дифференциальной способностью к оттоку ДНК-связывающего красителя Hoechst 33342. Эту «боковую популяцию» клеток можно идентифицировать с использованием проточных цитометрических методов после Hoechst 33342 Краситель возбуждается ультрафиолетовым (УФ) лазером. Боковая популяция многих типов клеток содержит стволовые или подобные предшественникам клетки. Однако не все типы клеток имеют идентифицируемую боковую популяцию. Данио рерио , данио, имеет прочную in vivo модель Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), но есть ли у этих T-ALLs рыбок данио, боковая популяция неизвестна. Описанный здесь метод описывает, как выделить боковые популяционные клетки у рыбок данио T-ALL. Для начала, T-ALL у рыбок данио формируется посредством микроинъекции tol2-плазмид в одноклеточные стадии эмбрионов. Как только опухоли выросли до стадии, на которой они расширяются до более половинытело Мал, в клетки Т-ОЛЛ могут быть собраны. Клетки затем окрашивают Hoechst 33342 и исследовали с помощью проточной цитометрии для клеток со стороны населения. Этот метод имеет широкое применение в данио Т-ОЛЛ исследования. Хотя нет никаких известных маркеров клеточной поверхности в данио , которые подтверждают эти клетки со стороны населения , являются ли стволовые клетками рака, как в естественных условиях функциональной трансплантации анализы возможны. Кроме того, одноклеточная транскриптомика может быть применена для идентификации генетических особенностей этих клеток со стороны населения.
Introduction
Анализ популяции боковой популяции основан на усиленной способности некоторых клеток в ткани выводить ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342 из-за высоких уровней транспортерных белков-переносчиков АТФ (АВС) на клеточной мембране. Клетки, которые выделяют краситель Hoechst 33342, могут быть идентифицированы с использованием двухволнового проточного цитометрического анализа после того, как краситель возбужден УФ-лазером. Этот анализ был впервые использован для идентификации мышиных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 1 , но с тех пор он использовался для идентификации популяций стволовых клеток / клеток-предшественников во многих тканях и раках (см. Ссылку 2). Однако не все популяции клеток имеют боковую популяцию, и не все боковые популяции обогащены клетками стволовых клеток-предшественников.
Данио является мощной генетической модельной системой позвоночных для изучения рака человека 3 , 4 , обладающей рядом преимуществ перед традиционным мышиным moРак. Зародыши данио рыбу внешне оплодотворяются и оптически прозрачны, что способствует трансгенезу и наблюдению in vivo патологических процессов, включая инициирование и прогрессирование рака. На сегодняшний день анализ боковой популяции для выявления потенциальных стволовых клеток или клеток-предшественников был применен только в почковом костном мозге у данио-данио для идентификации HSCs, а не для любых раковых моделей 5 , 6 данио.
Модель данио-острой Т-клеточной острой лимфобластной лейкемии (T-ALL) морфологически и генетически похожа на T-ALL 7 , 8 , 11 человека . T-ALL - агрессивное злокачественное заболевание, которое на людях составляет 10-15% педиатрических и 25% взрослых случаев ALL 9 . Хотя лечение T-ALL улучшилось, рецидив все еще распространен и связан с плохим прогнозом. Опухоли T-ALL гетерогенныеИ содержат много разных субпопуляций опухолевых клеток, включая лейкемические инициирующие клетки (LIC). LIC определяются их способностью восстанавливать всю опухоль из одной клетки, а частоту LIC в популяции опухолевых клеток можно рассчитать путем трансплантации различных доз клеток в реципиентов с помощью анализа трансплантации с предельным разбавлением (LDA). Хотя эксперименты LDA были проведены у рыбок данио для вычисления частоты LICs 8 , 10 , 11 , это определение сделано задним числом и не позволяет предполагаемую изоляцию LIC. Таким образом, отсутствует метод для потенциальной изоляции популяции, обогащенной активностью раковых стволовых клеток. Выявление и выделение боковых популяционных клеток из T-ALLs рыбок данио является первым шагом на пути устранения этого недостатка.
Представленный здесь протокол описывает, как эффективно генерировать опухоли T-ALL в zebrАфиши, используя tol2-опосредованный трансгенез, собирают клетки опухолей T-ALL и окрашивают их Hoechst 33342 для идентификации боковой популяции клеток. Будущие эксперименты in vivo с данио-рыбой T-ALL могут включать в себя, обогащены ли боковые популяционные клетки для LIC или имеют другие свойства, подобные стволовым или предшественникам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с данио были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных при Университете Чикаго. Чикагский университет аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC).
1. Генерация и выделение флуоресцентно меченых клеток T-ALL у данио
- Микроинъекция в сингенные эмбрионы рыбок данио
- Используя коммерчески доступные наборы, изолируйте плазмидную ДНК rag2 : c-myc и rag2 : green fluorescent protein ( rag2 : GFP), содержащие инвертированные концевые повторы, распознаваемые tol2-транспосазой (см. Таблицу материалов для источника плазмидной ДНК) 12 и элюируйте ДНК В стерильной воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP используется в этом исследовании, но любой флуоресцентный белок будет работать. - Подготовка рСS2-транспозазы (tol2) РНК
- Выделите плазмидную ДНК tol2, используя коммерчески доступные наборы (см. Tон Таблица материалов для источника плазмидной ДНК) 12 и элюции ДНК в стерильной воде.
- Инкубируют 1 мкг ДНК tol2 при 37 ° С в течение 1 ч с 5 единицами NotI фермента рестрикции в соответствующем буфере для линеаризации плазмиды. Тепло-инактивировать NotI при 65 ° С в течение 20 мин.
- Транскрибировать tol2 РНК с SP6 РНК - полимеразы из линеаризованной ДНК с использованием коммерчески доступного набора РНК - транскрипции 13. Хранить РНК в одноразовых аликвотах при -80 ° C.
- Подготовьте инъекции смеси на льду добавлением 250 нг RAG2: C-Myc плазмидной ДНК, 250 нг RAG2: GFP плазмидной ДНК, 150 нг tol2 РНК, и 0,5 мкл фенола красного. Настройка громкости до 10 мкл с нуклеазы без воды.
- Вводит ~ 1 нл впрыск смеси в ячейку стадии одной клетки сингенного данио эмбрион с использованием microinjector и иглу извлекается из стеклянных капиллярной трубки, следуя ранее EstabМетоды 8 , 14 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Сингенные рыбки данио, полученные с помощью партеногенеза 15, используются здесь для устранения генетической гетерогенности и иммунного отторжения после трансплантации. Однако можно также использовать диких рыбок данио или любой желаемый штамм. - Удалите мертвые, недоразвитые или уродливые эмбрионы при 24 и 48 часах после инъекции 16 .
- Поместите впрыснутую рыбу в рыбную систему через 6 дней после инъекции и поднимите ее в соответствии со стандартным протоколом 6 .
- Используя коммерчески доступные наборы, изолируйте плазмидную ДНК rag2 : c-myc и rag2 : green fluorescent protein ( rag2 : GFP), содержащие инвертированные концевые повторы, распознаваемые tol2-транспосазой (см. Таблицу материалов для источника плазмидной ДНК) 12 и элюируйте ДНК В стерильной воде.
- Скрининг инъецированных данио и мониторинг роста опухоли
- Через 21 день после инъекции поместите одну инъецированную личинку в каплю среды эмбриона на чашку Петри и проведите скрининг для флуоресценции GFP с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (полоса возбуждения: 470/40, полоса пропускания излучения: 525/50) 8 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки данио, которые hAve интегрированы как rag2 : c-myc, так и rag2 : GFP будет иметь зеленую флуоресцентную тимусу (положительная рыба) и может уже проявлять расширение злокачественных зеленых флуоресцентных клеток за тимусом. Все рыбы с GFP + тимусом продолжат разработку GFP + T-ALL. Личинки, которые не демонстрируют интеграцию плазмид, не будут иметь никаких зеленых флуоресцентных клеток (отрицательная рыба). - Отделите отрицательную рыбу (в зависимости от отсутствия флуоресценции) в другой резервуар и следите за рыбой снова через 28 и 35 дней после инъекции. Через 28 и 35 дней после инъекции обезболивают рыбу с 0,02% буферным трикаином (MS-222) в воде рыбной системы перед скринингом.
- Поместите каждую личинку рыбок данио, которая положительна для флуоресцентно меченной тимуса или флуоресцентно меченной опухоли в отдельном резервуаре для контроля роста опухоли три раза в неделю.
- Через 21 день после инъекции поместите одну инъецированную личинку в каплю среды эмбриона на чашку Петри и проведите скрининг для флуоресценции GFP с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (полоса возбуждения: 470/40, полоса пропускания излучения: 525/50) 8 .
- Сбор флуоресцентно меченых клеток T-ALL из первичной опухолевой рыбы
- Приготовьте по крайней мере 20 мл 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки в 0,9х фосфатном буферном растворе (FBS / PBS).
- Добавить 1 мл FBS / PBS в один флакон натриевой соли гепарина (300 единиц).
- Выберите рыбу с опухолями в более чем 50% тела, или те рыбы, испытывающие трудности с едой или плаванием. Пожертвуйте рыбу, передозировав их трикаином или погружением в воду со льдом. Подтвердите смерть отсутствием движения жабры и сердцебиения.
- Используйте лезвие для удаления головы рыбы.
- Вымойте полость рыбы раствором гепарина, чтобы удалить излишки красных кровяных телец.
- Используя пипетку, впрысните 100 мкл раствора гепарина (приготовленного на этапе 1.3.2) в полость тела рыбы. Удалите всю жидкость, которая выливается (она будет содержать клетки крови) и вставьте ее в микроцентрифужную пробирку емкостью 1,5 мл.
- Используйте новый наконечник пипетки, чтобы вымыть тело снова. Выполните не менее трех промывок или пока жидкость, которая выливается, не будет очищенаООД.
- Выбросьте всю жидкость из смыва на этапах 1.3.5.1 и 1.3.5.2, так как он не будет использоваться в дальнейших анализах.
- Сбор клеток лейкемии.
- Вводят 100 мкл FBS / PBS в полость тела рыбы.
- Нанесите мягкое давление на внешней стороне тела рыбы с кончиком пипетки, чтобы сжать / вытолкнуть опухолевые клетки.
Примечание: Если этот шаг выполняются с использованием рассекает микроскоп, опухолевые клетки, разлив из полости тела будут очевидны. - Накопление жидкости и клетки из каждой стирки в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Повторите шаги 1.3.6.1-1.3.6.3, пока большинство опухолевых клеток не собираются (обычно 5-10 раз). Собрать все опухолевые клетки в ту же пробирку микроцентрифужной 1,5 мл. Держите клетки при комнатной температуре.
- Смешайте собранные опухолевые клетки из стадии 1.3.6, осторожно пипетки их диссоциируют скопление клеток. Фильтр суспензии клеток через 40-мкм сетчатый фильтр. Промыть фильтр 1-2 раза 100 мкл FBS / PBS. Держите клетки при комнатной температуре.
- Смешайте 2 мкл клеточной суспензии с 18 мкл трипанового синего (0,4%, разбавленный 1:10 и отфильтрованный) в новой пробирке. Загрузите 10 мкл на гемоцитометр и подсчитайте количество живых (несиних) флуоресцентных клеток для расчета количества изолированных опухолевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не-голубые GFP-отрицательные клетки, скорее всего, являются нормальными, незлокачественными Т-клетками и не должны учитываться. Для окрашивания клеток Hoechst 33342 требуется по меньшей мере 2 x 10 6 клеток.
2. Окрашивание флуоресцентно маркированных клеток T-ALL с помощью Hoechst 33342 для идентификации бокового населения
- Развести Hoechst 33342 1:10 без нуклеазы без H 2 O, чтобы рабочая концентрация 1 мг / мл. Храните краску при температуре 4 ° C и в темноте.
- Приготовить 100 мМ раствор верапамила растворением 49,1 мг в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
Примечание: Верапамил является ингибитором ABC транспортеров и является важным управлением для экспериментов со стороны населения. Добавление верапамило к образцам будет ингибировать способность ABC транспортеров к оттоку в компании Hoechst 33342 красителя. Таким образом, истинная сторона популяция исчезнет, когда верапамил добавляют к образцу. - Установите на водяной бане до 28 ° С.
- Подготовка проб и контроля в темноте при добавлении клеток и решения флуоресценции активированных клеток сортировщика (FACS) трубы.
- Подготовка образцов путем добавления 10 6 клеток, 15 мкл 1 мг / Мл Хочст 33342, и 2,5 мкл ДМСО в пробирку FACS. Настройка громкости до 1 мл FBS / PBS.
- Подготовьте элементы управления путем добавления 10 6 клеток, 15 мкл 1 мг / Мл Хочст 33342, и 2,5 мкл 100 мМ верапамил в трубку FACS. Настройка громкости до 1 мл FBS / PBS.
Примечание: Минимум 10 6 клеток / образец рекомендуется, но окрашивания больше клеток является предпочтительным, особенно если сторона populatИонные ячейки будут отсортированы для дальнейшего анализа. Не превышайте 10 6 клеток / мл и поддерживайте концентрацию Hoechst 33342 на уровне 15 мкг / мл. Если 10 × 106 клеток окрашены, общий объем реакции составляет 10 мл.
- Инкубируйте в водяной бане с температурой 28 ° С в темноте в течение 120 мин.
- После инкубации поместите клетки сразу на лед и держите их в темноте.
- Гранулировать клетки при 4 ° С в течение 6 мин при 300 х g. Удалить супернатант. Промыть 1 мл FBS / PBS.
- Гранулировать клетки при 4 ° С в течение 6 мин при 300 х g. Удалить супернатант. Ресуспендируют клетки в 1 мл FBS / PBS.
- Хранить при температуре 4 ° C до сортировки клеток.
- За 15 минут до сортировки клеток добавьте 2 мл пропидиума йодида (PI) (1 мг / мл) в каждый 1 мл FBS / PBS (конечная концентрация: 2 мкг / мл). Хорошо перемешать.
3. Используйте FACS для поиска популяции боковых популяций во флуоресцентно меченном T-ALL клеточном населении
- Определите ворота для живых, GFP + T-ALL ячеек.
- Используйте зону прямого рассеяния (FSC) и бокового разброса (SSC), чтобы вывести завалы.
ПРИМЕЧАНИЕ. FSC используется для различения размера ячейки, а SSC используется для различения степени детализации ячейки. - Используйте FSC и SSC ширину, чтобы различать дублеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть три компонента, идентифицированные детекторами проточного цитометра: площадь, высота и ширина. Область обычно используется для измерения флуоресценции клетки. Ширина измеряет время пролета и вдвое больше, если две ячейки сгруппированы вместе. - Для живых опухолевых клеток проведите ворота вокруг клеток, положительных для GFP, и отрицательных для PI, используя соответствующие детекторы ( например , FITC для GFP и PerCP Cy5-5 для PI).
- Используйте зону прямого рассеяния (FSC) и бокового разброса (SSC), чтобы вывести завалы.
- Если сортировать боковые популяционные клетки для дальнейших экспериментов, используйте большой наконечник сопла (100 мкм) и соберите клетки в пробирку FACS, содержащую 3 мл 100% FBS. Используйте более крупный наконечник сопла (100 мкм) вместо меньшего наконечника (70 мкм), чтобы улучшить жизнеспособность клеток после сортировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы эффективно генерировать флуоресцентные myc-индуцированные опухоли T-ALL у рыбок данио, кольцевые ДНК-конструкции, фланкированные сайтами tol2-транспозазы, могут быть совместно инъецированы с tol2-РНК. Предыдущие исследования по инъекции линеаризованной ДНК в эмбрионы данио сообщают о 5% скорости трансгенеза 8 . С протоколом, скорректированным для включения tol2-опосредованного трансгенеза, можно наблюдать скорости трансгенеза от 10-44% ( таблица 1 ).
В представительном примере рыба с GFP + T-ALL была окрашена Hoechst 33342 для определения процента клеток в популяции боковых. На рисунке 1 показана схема стробирования, используемая для определения процента боковых популяционных клеток. Сначала, используя FSC и SSC, клетки T-ALL выделяют, исключая обломки ( рисунок 1A ) и затем отбирая дублеты ( рис. 1B ), Затем все живые клетки выделяются стробирующими клетками, которые являются GFP + и отрицательными для дискриминатора мертвых клеток PI ( фиг.1С ). После выбора одиночных живых клеток T-ALL боковая совокупность может быть найдена в профиле Hoechst 33342. В основной клеточной популяции Hoechst 33342 остается в клетках, и эти клетки могут быть разделены на группы по содержанию ДНК. Однако боковая популяция клеток отличается от популяции основных клеток, поскольку боковые популяционные клетки выделяют краситель из-за большего числа транспортеров АВС на клеточной мембране. Для визуализации боковой популяции профиль Hoechst используется для сравнения двух каналов - Hoechst Blue и Hoechst Red. Боковая популяция представляет собой тусклый хвост клеток, простирающийся от левой стороны популяции основных клеток к оси Хехст-Синий ( рис. 1D ).
Истинная боковая популяция будет потеряна, когда клетки будут обработаны ингибитором oF ABC транспортеры, такие как верапамил. На рисунке 2 показаны боковые популяции в нескольких типичных опухолях T-ALL, а также при лечении этих опухолей верапамилом во время окрашивания с помощью Hoechst 33342. Чтобы гарантировать, что популяция, найденная в образце, является истинной популяцией, эти клетки должны исчезнуть В присутствии ингибитора, как показано на фиг. 2 .
| Инвентарный номер | Экранирование рыбы | Число положительное | Скорость трансгенеза |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| +934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| +951 | 19 | 3 | 15.8% |
| 960 | 3 </ TD> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Таблица 1: Скорости трансгенеза при использовании tol2-транспозазы для микроинъекции плазмиды в эмбрионах данио рерио. Рассчитанные скорости трансгенеза показаны для 19 отдельных дней инъекции. Количество проверенной рыбы представляет количество оставшихся в живых рыб через 21 день после инъекции, а число положительных - количество рыб, которые были положительными для флуоресцентных опухолей.
Рисунок 1: Схема бокового заселения. Пример схемы стробирования, используемой для идентификации боковой популяции в GFP + T-ALL у рыбок данио. ( A ) Во-первых, обломки исключаются с использованием прямого рассеяния (FSC) иБокового рассеяния (SSC). ( B ) Затем отдельные ячейки выделяют, различаясь по дублетам, используя параметры ширины FSC и SSC. ( C ) Поскольку этот примерный опухоль был GFP +, все живые клетки должны быть GFP + и отрицательными для маркера мертвых клеток Propidium Iodide. ( D ) Боковое население можно увидеть по профилю Hoechst Red по сравнению с Hoechst Blue. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Боковое популяция исчезает при лечении ингибитором транспортера ABC, Верапамилом. Показаны ворота для бокового населения. На верхних панелях показаны четыре различных образца опухоли. Важно отметить, что не все опухоли имеют одинаковый процент бокового населения, а боковая популяция caп выглядят по-разному для каждой испытанной опухоли. Нижние панели показывают образцы опухолей, которые были обработаны с верапамилом во время окрашивания с Hoechst 33342, чтобы блокировать вытекание красителя. В то время как боковые группы населения могут выглядеть по-разному для каждой опухоли, эффект верапамила та же: стороны населения исчезает. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ стороны населения обладает высокой чувствительностью; Таким образом, небольшие изменения в протокол могут привести к трудности в обнаружении клеток со стороны населения. Во-первых, температура во время стадии окрашивания является специфическим для каждой системы животных / клетку. Для систем млекопитающих, анализ со стороны населения обычно проводят при 37 ° С 2. Когда данио Т-ОЛЛ клетки инкубировали при 37 ° С, многие из клеток умерли, которые сделали эту температуру инкубации неприемлемыми (данные не показаны). Когда Кобаяси и его коллеги (2008) рассекали данио почки костный мозг для анализа со стороны населения, что инкубирование проводили при 25 ° C 5. Эта температура инкубации не была достаточной для данио Т-ОЛЛ клетки, поскольку это приводит к слабой Hoechst 33342 профиля (данные не показаны). В протоколе, описанный здесь, температура на инкубации 28 ° С была оптимальной для поддержания жизнеспособности клеток и для достижения сильного Hoechst 33342 профиля,
Второе условие для популяционного анализа боковой стороны, которое требует рассмотрения и предварительного тестирования, - это концентрация Hoechst 33342. Если концентрация Hoechst 33342 слишком низкая, боковая популяция может быть не видна или фенотип боковой популяции (способность оттока красителя) может Быть ложно увеличенным, идентифицируя больше популяционных клеток стороны, чем они фактически присутствуют 2 . С другой стороны, слишком высокая концентрация Hoechst 33342 может быть токсичной для клеток. Для клеток T-ALL данио, 15 мкг / мл Hoechst 33342, инкубированных в течение 120 мин, является оптимальной комбинацией. Более низкие концентрации Hoechst 33342 были опробованы для клеток T-ALL данио, но боковая популяция не всегда была очевидной (данные не показаны). Полное время инкубации в течение 90 мин было достаточным для выявления боковой популяции, но максимальное количество боковых популяционных клеток наблюдалось через 120 мин времени инкубации.
Как сообщалось ранее для млекопитающих ystems, не каждая опухоль будет иметь боковое обнаруживаемое население 17, 18, 19. С помощью этого метода мы наблюдали боковую популяцию в 14 из 17 Т-Alls тестируемых (данные не показаны). Выделив клетки со стороны населения от T-Alls, этот метод, как ожидается, будет применим к другим данио моделям опухолей.
В гетерогенной данио Т-ОЛЛ опухоль, лейкозы инициируя клетки (СНД) способны к повторному запуску роста опухоли и, как таковые, как полагают, ответственна за рецидив рака и метастазы. В настоящее время не существует метода , который позволяет данио для предполагаемой изоляции СНДА в естественных условиях. Расчет частоты LIC требует трансплантации опухолевых клеток при предельном разведении 8, 10. Ранее опубликованные исследования с клональным данио определили, что СНД составляет 0.1-1.4% первичного Т-ОЛЛА клетки"Xref"> 10. Здесь, похоже изменчивость частоты клеток населения боковых (0,2-1,0%) из клональной данио T-Alls сообщается (рисунок 2). Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы определить, является ли обогащен сторона населения в СНД; Однако сходство между диапазонами частот LIC и процентом клеток со стороны населения в этом Т-Alls поддерживает эту гипотезу.
В то время как анализ со стороны населения чувствителен и не всегда легко выполнить, анализ позволяет исследователям, впервые, чтобы изолировать редкую популяцию клеток в данио Т-ОЛЛ, которые могут иметь стволовые клетки или прародитель свойства. Там в настоящее время нет маркеров клеточной поверхности, доступных в данио, чтобы определить шпиндельные или прогениторных тип клетки; следовательно, способность изолировать на сторону населения является весьма перспективной. Будущие применения этого способа включают предельные трансплантации Разбавление эксперименты отсортированной стороны популяцию Т-клеток ALL, чтобы оценить обогащение LИС. Кроме того, этот метод позволит определить характеристики, которые определяют LIC, включая молекулярные механизмы, регулирующие LICs у рыбок данио T-ALL. Эти эксперименты могут послужить отправной точкой для открытия новых терапевтических целей для T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в Университете Чикаго Совета женщин, дело фонд Венди Уилла, и Университет Чикаго Comprehensive Cancer Center поддержка Гранта (P30 CA014599). Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии Сердечник в Университете Чикаго за помощь в создании этого эксперимента, а также других членов лаборатории де Йонг, в частности, Лесли Педрасы и Шон Макконнелл.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
