Summary
Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.
Abstract
Heterogene celpopulaties, afkomstig van gezonde en kwaadaardige weefsels, kan een celpopulatie gekenmerkt door een differentiële vermogen om de DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342. Deze "side population" cellen uitstroming bevatten kunnen worden geïdentificeerd met behulp flowcytometrische werkwijzen na de Hoechst 33342 kleurstof wordt geëxciteerd door een ultraviolet (UV) laser. De side population van vele soorten cellen bevat stam- of voorlopercellen-achtige cellen. Echter, niet alle celtypen hebben een identificeerbare side population. Danio rerio, zebravis, hebben een robuust in vivo model van T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL), maar of deze zebravis T lekbakken hebben een side population is onbekend. De hier beschreven methode beschreven hoe opzij populatie cellen in de zebravis T-ALL isoleren. Om te beginnen, wordt de T-ALL in de zebravis gegenereerd via microinjectie van tol2 plasmiden in een cel embryo's. Zodra de tumoren gegroeid tot een stadium waarin zij breiden tot meer dan de helft van de animal lichaam, kan de T-ALL-cellen worden geoogst. De cellen worden vervolgens gekleurd met Hoechst 33342 en onderzocht met behulp van flow cytometrie side population cellen. Deze methode heeft brede toepassingen in de zebravis T-ALL onderzoek. Hoewel er geen bekende celoppervlak markers in de zebravis die bevestigen of deze bijwerkingen populatie cellen kankercellen zijn stamcelachtige in vivo transplantatie functionele assays mogelijk. Bovendien kan eencellig transcriptomics worden toegepast op de genetische kenmerken van deze bijwerkingen populatie cellen te identificeren.
Introduction
De zijpopulatie analyse maakt gebruik van het verbeterde vermogen van bepaalde cellen in een weefsel om de DNA bindende kleurstof Hoechst 33342 uit te vloeien als gevolg van hoge niveaus van de ATP bindende cassette (ABC) transporteur eiwitten op het celmembraan. De cellen die de Hoechst 33342-kleurstof uitstromen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van dual-wavelengte-cytometrische analyse nadat de kleurstof opgewonden is door een UV-laser. Deze test werd eerst gebruikt om muizen hematopoietische stamcellen (HSCs) 1 te identificeren, maar is sindsdien gebruikt om stam- / stamcellenpopulaties in veel weefsels en kanker te identificeren (in referentie 2 onderzocht). Echter, niet alle populaties van cellen hebben een zijpopulatie, en niet alle zijpopulaties zijn verrijkt voor stam- / stamcellen.
De zebravis is een krachtig vertebrat genetisch model systeem voor het bestuderen van menselijke kanker 3 , 4 , met een aantal voordelen boven de traditionele murine moDelen van kanker. Zebravis embryo's zijn extern bevrucht en zijn optisch duidelijk, het faciliteren van transgenese en de in vivo waarneming van pathologische processen, waaronder kankerinitiatie en progressie. Tot op heden is de zijkampbevestiging om potentiële stam- of stamcellen te detecteren alleen toegepast op de niermerg in zebravis om HSC's te identificeren, en niet voor zebraviskankermodellen 5 , 6 .
Het zebravismodel van T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) is morfologisch en genetisch vergelijkbaar met de menselijke T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL is een agressieve maligniteit die bij mensen 10-15% van de pediatrische en 25% van de volwassen ALLE gevallen 9 vertegenwoordigt. Terwijl de behandeling van T-ALL is verbeterd, is de terugval nog steeds gebruikelijk en wordt er gepaard gegaan met een slechte prognose. T-ALL tumoren zijn heterogeenOus en bevatten veel verschillende tumorcel subpopulaties, waaronder leukemie initiatiefcellen (LIC's). LIC's worden gedefinieerd door hun vermogen om de gehele tumor van een enkele cel te hergroeien en de frequentie van LIC's binnen een tumorcelpopulatie kan worden berekend door verschillende celdoses in recipiënten te transplanteren via een limietverdunningstransplantatie-analyse (LDA). Terwijl LDA-experimenten zijn uitgevoerd in zebravis om de frequentie van LICs 8 , 10 , 11 te berekenen, wordt deze bepaling achteraf gemaakt en staat de toekomstige isolatie van LIC's niet toe. Daarom ontbreekt een methode voor het prospectief isoleren van een populatie verrijkt voor kankercellen. Het identificeren en isoleren van bevolkingscellen van zebravis T-ALL's is de eerste stap om deze tekort aan te pakken.
Het hier beschreven protocol beschrijft hoe T-ALL tumoren efficiënt kunnen worden genereerd in zebrVerdovende gebruik maken van tol2-gemedieerde transgenese, oogst de T-ALL tumorencellen, en vlek ze met Hoechst 33342 om de zijbevolking van cellen te identificeren. Toekomstige in vivo experimenten met zebravis T-ALL kunnen omvatten of de zijbevolkingscellen verrijkt zijn voor LIC's of andere stam- of stamvaderachtige eigenschappen hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met zebravis zijn goedgekeurd door het Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Chicago. De Universiteit van Chicago is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Het genereren en isoleren van fluorescerend gelabelde T-ALL cellen in Zebrafish
- Microinjectie in syngeneuze zebravis embryo's
- Gebruik commercieel verkrijgbare kits, isoleer circulaire rag2 : c-myc en rag2 : groen fluorescent eiwit ( rag2 : GFP) plasmide DNA dat omgekeerde terminale herhalingen herkent door tol2 transposase (zie de tabel van materialen voor bron van plasmide DNA) 12 en eluteer het DNA In steriel water.
OPMERKING: GFP wordt gebruikt in deze studie, maar elk fluorescerend eiwit zal werken. - Bereid pCS2-transposase (tol2) RNA op
- Isoleer tol2 plasmide DNA met gebruik van commercieel verkrijgbare kits (zie tHij Tabel van Materialen voor de bron van plasmide DNA) 12 en eluteer het DNA in steriel water.
- Incubeer 1 μg tol2 DNA bij 37 ° C gedurende 1 uur met 5 eenheden NotI-restrictie-enzym in de geschikte buffer om het plasmide te lineariseren. Hitte-inactiveren de NotI bij 20 ° C gedurende 20 minuten.
- Transcripteer het tol2 RNA met SP6 RNA polymerase van het gelineariseerde DNA onder gebruikmaking van een in de handel verkrijgbare RNA transcriptie kit 13 . Bewaar het RNA bij eenmalig gebruik bij -80 ° C.
- Bereid de injectiemengsel op ijs door 250 ng rag2 : c-myc plasmide DNA, 250 ng rag2 : GFP plasmide DNA, 150 ng tol2 RNA en 0,5 μl fenol rood toe te voegen. Pas het volume aan op 10 μL met nuclease-vrij water.
- Injecteer ~ 1 nl injectiemengsel in de cel van een zenfeneuze zebravis embryo van een celcilinder met behulp van een microinjector en naald getrokken uit een glazen capillaire buis, in navolging van eerder estabGepaste methoden 8 , 14 .
OPMERKING: Syngeneuze zebravis die door parthenogenese 15 wordt gegenereerd, worden hier gebruikt om genetische heterogeniteit en immuunafstoting na transplantatie te elimineren. Echter, wildtype zebravis of enige gewenste stam kan ook worden gebruikt. - Verwijder dode, onderontwikkelde of misvormde embryo's bij 24 uur en 48 uur na injectie 16 .
- Plaats de geïnjecteerde vis op het vissysteem op 6 dagen na de injectie en verhoog ze volgens standaardprotocol 6 .
- Gebruik commercieel verkrijgbare kits, isoleer circulaire rag2 : c-myc en rag2 : groen fluorescent eiwit ( rag2 : GFP) plasmide DNA dat omgekeerde terminale herhalingen herkent door tol2 transposase (zie de tabel van materialen voor bron van plasmide DNA) 12 en eluteer het DNA In steriel water.
- Screening geïnjecteerde zebravis en het volgen van tumorgroei
- Plaats op 21 dagen na de injectie een enkele injecteerde larve in een druppel embryo-medium op een Petri-schotel en scherm voor GFP-fluorescentie met behulp van een epifluorescerende microscoop (excitatiebandpas: 470/40, emissie bandpas: 525/50) 8 .
OPMERKING: Zebravis larven die hAve geïntegreerde zowel rag2 : c-myc en rag2 : GFP zal een groene fluorescerende thymus (positieve vis) hebben en kan de uitbreiding van kwaadaardige groene fluorescerende cellen verder vertonen dan de thymus. Alle vis met een GFP + thymus zullen verder gaan met het ontwikkelen van een GFP + T-ALL. De larven die de integratie van de plasmiden niet aantonen, zullen geen groene fluorescerende cellen hebben (negatieve vis). - Scheep de negatieve vis (gebaseerd op een gebrek aan fluorescentie) in een andere tank en controleer de vis nog eens op 28 en 35 dagen na de injectie. Bij 28 en 35 dagen na de injectie verdovken de vis met 0,02% gebufferde tricaïne (MS-222) in viswaterwater voorafgaand aan het screenen.
- Plaats elke zebravis larve die positief is voor een fluorescent gelijmde thymus of een fluorescent gelabelde tumor in een individuele tank om drie keer per week tumorgroei te monitoren.
- Plaats op 21 dagen na de injectie een enkele injecteerde larve in een druppel embryo-medium op een Petri-schotel en scherm voor GFP-fluorescentie met behulp van een epifluorescerende microscoop (excitatiebandpas: 470/40, emissie bandpas: 525/50) 8 .
- Inzameling van fluorescent gelabeld T-ALL cellen van de primaire tumor vis
- Bereid ten minste 20 ml 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runder serum in 0,9x fosfaat gebufferde zoutoplossing (FBS / PBS).
- Voeg 1 ml FBS / PBS toe aan één injectieflacon heparine natriumzout (300 eenheden).
- Selecteer visdraag tumoren in meer dan 50% van het lichaam, of die vissen hebben moeite met eten of zwemmen. Offer de vis door ze te overdrijven met trica of door ijswater onderdompeling. Bevestig de dood door een gebrek aan beweging en hartslag.
- Gebruik een scheermesje om het hoofd van de vis te verwijderen.
- Was de holte van de vis met de heparineoplossing om overtollige rode bloedcellen te verwijderen.
- Gebruik een pipet, injecteer 100 μl heparine oplossing (bereid in stap 1.3.2) in de lichaamsholte van de vis. Verwijder alle vloeistof die uitmondt (het bevat bloedcellen) en pipet het in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Gebruik een verse pipettip om het lichaam weer te wassen. Voer ten minste drie wasjes uit, of tot de vloeistof die uitspoelt, verschijnt vrij van blood.
- Verwijder alle vloeistof uit de was in stappen 1.3.5.1 en 1.3.5.2, aangezien deze niet in verdere analyses wordt gebruikt.
- Verzamel de leukemacellen.
- Spuit 100 μL FBS / PBS in de lichaamsholte van de vis.
- Breng zachte druk aan de buitenkant van het lichaam van de vis met de pipettip om de tumorcellen te drukken / uit te drukken.
OPMERKING: Als deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een dissectiemicroscoop, zullen de tumorcellen die uit de lichaamsholte vallen, duidelijk zijn. - Verzamel de vloeistof en cellen van elke was in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Herhaal stappen 1.3.6.1-1.3.6.3 tot de meeste tumorcellen worden verzameld (meestal 5-10 keer). Verzamel alle tumorcellen in dezelfde 1,5 ml microcentrifugebuis. Houd de cellen bij kamertemperatuur.
- Meng de verzamelde tumorcellen van stap 1.3.6 door ze zachtjes te pipetteren om de klompen cellen te dissociëren. Filter de cel suspensie door een 40-μm maasfilter. Was het filter 1-2 keer met 100 μL FBS / PBS. Houd de cellen bij kamertemperatuur.
- Meng 2 μL cel suspensie met 18 μl trypanblauw (0,4%, verdund 1:10 en gefiltreerd) in een nieuwe buis. Laad 10 μL op een hemocytometer en tel het aantal levende (niet-blauwe) fluorescerende cellen om het aantal geïsoleerde tumorcellen te berekenen.
OPMERKING: Niet-blauwe GFP-negatieve cellen zijn waarschijnlijk normale, niet-maligne T-cellen en mogen niet worden geteld. Er zijn minstens 2 x 106 cellen nodig om de cellen te vleken met Hoechst 33342.
2. De fluorescente gelabelde T-ALL cellen met Hoechst 33342 plakken om de zijbevolking te identificeren
- Verdun Hoechst 33342 1:10 met nuclease-vrije H20 om de werkzame concentratie van 1 mg / ml te maken. Bewaar de kleurstof bij 4 ° C en in het donker.
- Bereid een 100 mM oplossing van verapamil door 49,1 mg in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) op te lossen.
OPMERKING: Verapamil is een remmer van ABC transporters en is een belangrijke controle voor side population experimenten. verapamil toevoegen aan monsters van het vermogen van de ABC-transporters om de Hoechst 33342 kleurstof uitstromen te remmen. Daarom zal een echte side population verdwijnen wanneer verapamil wordt toegevoegd aan het monster. - Stel een waterbad tot 28 ° C.
- Bereid monsters en controles in het donker door het toevoegen van cellen en oplossingen voor fluorescentie geactiveerde celsorteerder (FACS) buizen.
- Bereid de monsters door 10 6 cellen, 15 pl 1 mg / mL Hoechst 33342 en 2,5 pl van DMSO tot een FACS buis. Stel het volume met 1 ml FBS / PBS.
- Bereid de controles door 10 6 cellen, 15 pl 1 mg / mL Hoechst 33342 en 2,5 pl 100 mM verapamil een FACS buis. Stel het volume met 1 ml FBS / PBS.
OPMERKING: Minimaal 10 6 cellen / monster wordt aanbevolen, maar kleuren meer cellen de voorkeur, vooral als de zijde populatIonencellen worden gesorteerd voor verdere analyse. Niet meer dan 10 6 cellen / ml, en behoud de Hoechst 33342 concentratie bij 15 μg / ml. Als 10 x 106 cellen worden gekleurd, is het totale reactievolume 10 ml.
- Incubeer in een 28 ° C waterbad in het donker gedurende 120 minuten.
- Na de incubatie plaats de cellen onmiddellijk op ijs en houd ze in het donker.
- Pellet de cellen bij 4 ° C gedurende 6 min bij 300 x g. Verwijder de supernatant. Was met 1 ml FBS / PBS.
- Pellet de cellen bij 4 ° C gedurende 6 min bij 300 x g. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml FBS / PBS.
- Blijf bij 4 ° C tot cel sorteren.
- 15 minuten voorafgaand aan celsortering, voeg 2 μL propidiumjodide (PI) -voorraad (1 mg / ml) toe aan elke 1 ml FBS / PBS (uiteindelijke concentratie: 2 μg / ml). Goed mengen.
3. Gebruik FACS om de zijbevolking te vinden binnen de Fluorescently Labeled T-ALL Cell Population
- Bepaal een poort voor de live, GFP + T-ALL-cellen.
- Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) vlak voor de poort puin.
LET OP: FSC wordt gebruikt om celgrootte te onderscheiden en SSC wordt gebruikt om de granulariteit van de cel te onderscheiden. - Gebruik FSC en SSC breedte doubletten discrimineren.
OPMERKING: Er zijn drie componenten die door de stromingscytometer detectoren: gebied, hoogte en breedte. De omgeving wordt meestal gebruikt om de fluorescentie van de cel te meten. Breedte meet de vluchttijd en tweemaal zo groot als twee cellen elkaar zijn samengeklonterd. - Voor levende tumorcellen, trek een hek rondom de cellen positief voor GFP en negatief voor PI met de juiste detectoren (bijvoorbeeld FITC voor GFP en PerCP Cy5-5 PI).
- Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) vlak voor de poort puin.
- Wanneer het sorteren van de kant populatie cellen voor verdere experimenten gebruikt grote mondstukpunt (100 pm) en het verzamelen van de cellen in een FACS buis met 3 ml 100% FBS. Met een grotere mondstukpunt (100 um) in plaats van het kleinere uiteinde (70 urn) tot cellevensvatbaarheid after sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efficiënt genereren van fluorescentie-myc-geïnduceerde T-ALL tumoren in zebravis, circulaire DNA-constructen geflankeerd door tol2 transposase sites kunnen gelijktijdig worden geïnjecteerd met tol2 RNA. Eerdere studies uit de injectie van gelineariseerd DNA in zebravis embryo's verslag van een 5% transgenese tarief 8. Het protocol aangepast tol2-gemedieerde transgenese omvatten, kunnen transgenese variërend 10-44% worden waargenomen (tabel 1).
In het representatieve voorbeeld, een vis met een GFP + T-ALL werd gekleurd met Hoechst 33342 om het percentage cellen in de side population bepalen. Figuur 1 toont de gating methode welke het percentage side populatie cellen te bepalen. Eerst worden op FSC en SSC, de T-ALL-cellen worden geïsoleerd door het uitsluiten vuil (Figuur 1A) en vervolgens het selecteren tegen doubletten (Figuur 1B). Vervolgens worden alle levende cellen geïsoleerd door gaten cellen die GFP + zijn en negatief voor de dode cel discriminator PI ( Figuur 1C ). Zodra de single, live T-ALL cellen zijn geselecteerd, kan de zijbevolking in het Hoechst 33342 profiel worden gevonden. In de hoofdcellenpopulatie blijft Hoechst 33342 in de cellen, en deze cellen kunnen door DNA-inhoud in groepen worden gescheiden. Echter, de zijkantbevolking van cellen onderscheidt zich van de hoofdcellenpopulatie, aangezien de zijbevolkingscellen de kleurstof uitstrekken door hogere aantallen ABC-transporters op het celmembraan. Om de zijpopulatie te visualiseren, wordt het Hoechst-profiel gebruikt om twee kanalen, Hoechst Blue en Hoechst Red te vergelijken. De zijbevolking is de dunne staart van cellen die zich uitstrekken van de linkerkant van de hoofdcellenpopulatie naar de Hoechst Blue-as ( Figuur 1D ).
Een ware zijbevolking zal verloren gaan als de cellen met een remmer worden behandeldF ABC-transporteurs, zoals verapamil. Figuur 2 toont de zijpopulaties in verscheidene representatieve T-ALL tumoren, alsook wanneer die tumoren met verapamil worden behandeld tijdens het vleken met Hoechst 33342. Om ervoor te zorgen dat de populatie in het monster een ware zijpopulatie is, moeten die cellen verdwijnen In aanwezigheid van de remmer, zoals is getoond in figuur 2 .
| Voorraadnummer | Aantal vis gescreend | Nummer Positief | Graad van Transgenese |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabel 1: Transgenese tarieven bij het gebruik van tol2 Transposase voor Plasmid micro-injectie in zebravis embryo's. De berekende tarieven van transgenese worden getoond voor negentien aparte injectie dagen. Het aantal vissen Afgeschermde staat voor het aantal vissen die in leven bleven 21 dagen na de injectie, en het getal positief staat voor het aantal vissen die positief voor fluorescerende tumoren waren.
Figuur 1: side population Gating Scheme. Een voorbeeld van de gating schema dat wordt gebruikt om de kant bevolking te identificeren in een GFP + T-ALL in de zebravis. (A) de eerste plaats, het puin wordt uitgesloten met behulp van voorwaartse verstrooiing (FSC) enSide Scatter (SSC) gebied. ( B ) Vervolgens worden afzonderlijke cellen geïsoleerd door middel van discriminatie tegen dubbelbladen met behulp van FSC- en SSC-breedteparameters. ( C ) Aangezien dit voorbeeld tumor GFP + was, moeten alle levende cellen GFP + zijn en negatief voor de dode celmerk Propidium Iodide. ( D ) De zijbevolking kan gezien worden met het Hoechst Red versus Hoechst Blue profiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zijbevolking verdwijnt wanneer behandeld met de ABC Transporter Inhibitor, Verapamil. Poorten voor de zijbevolking worden getoond. De bovenste panelen tonen vier verschillende tumormonsters. Het is belangrijk om op te merken dat niet alle tumoren hetzelfde zijbevolkingspercentage hebben en de zijbevolking can er anders voor elke geteste tumoren. De onderste panelen tonen tumormonsters die met verapamil werden behandeld tijdens de kleuring met Hoechst 33342 kleurstof om efflux blokkeren. Terwijl de kant populatie kan er anders uitzien voor elke tumor, het effect van de verapamil is hetzelfde: de kant bevolking verdwijnt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zijbevolkingsassay is zeer gevoelig; Daarom kunnen kleine wijzigingen in het protocol leiden tot problemen bij het detecteren van zijbevolkingscellen. Ten eerste is de temperatuur tijdens de kleuringstap specifiek voor elk dier / celsysteem. Voor zoogdier systemen wordt de zijkantbevolkingsassay typisch uitgevoerd bij 37 ° C2. Wanneer de zebravis T-ALL-cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C, sterven veel van de cellen, waardoor deze incubatietemperatuur onaanvaardbaar was (data niet getoond). Toen Kobayashi en collega's (2008) zebravisniermarges voor de zijbevolking analyseren, werden de incubaties uitgevoerd bij 25 ° C 5 . Deze incubatietemperatuur was niet voldoende voor zebravis T-ALL-cellen, aangezien het resulteerde in een zwak Hoechst 33342 profiel (data niet getoond). In het hier beschreven protocol was een incubatietemperatuur van 28 ° C optimaal om de levensvatbaarheid van de cel te handhaven en een sterk Hoechst 33342 profiel te behalen.
Een tweede voorwaarde voor de zijkantbevolkingsonderzoek die overweging en voorafgaande test vereist is, is de concentratie van Hoechst 33342. Als de concentratie van Hoechst 33342 te laag is, kan de zijpopulatie misschien niet zichtbaar zijn, of het zijbevolkt fenotype (kleurstofuitstromingsvermogen) kan Worden vals verhoogd, waarbij meer zijbevolkingscellen geïdentificeerd worden dan daadwerkelijk aanwezig zijn 2 . Aan de andere kant kan te hoge concentraties Hoechst 33342 giftig zijn voor de cellen. Voor zebravis T-ALL-cellen is 15 μg / ml Hoechst 33342 gedurende 120 minuten geïncubeerd, de optimale combinatie. Lagere concentraties Hoechst 33342 werden geprobeerd voor zebravis T-ALL-cellen, maar de zijbevolking was niet altijd duidelijk (data niet getoond). Een totale incubatietijd van 90 minuten was voldoende om een zijpopulatie te detecteren, maar het maximale aantal zijbevolkingscellen werd gezien na 120 minuten incubatietijd.
Zoals eerder gemeld voor zoogdieren s Ystems, niet elke tumor zal een detecteerbare zijbevolking hebben 17 , 18 , 19 . Met behulp van deze methode hebben we een zijpopulatie waargenomen in 14 van 17 geteste T-AL's (data niet getoond). Na geïsoleerde zijbevolkingscellen van T-ALL's, wordt deze methode verwacht van toepassing op andere zebravistumormodellen.
Binnen de heterogene zebravis T-ALL-tumor zijn leukemie-initiatiefcellen (LIC's) in staat om tumorgroei te herinitieren en worden ze als zodanig verantwoordelijk voor kankerherhaling en metastase. Momenteel is er geen methode in zebravis die de toekomstige isolatie van LIC's in vivo mogelijk maakt . Het berekenen van de LIC frequentie vereist tumorceltransplantatie bij een beperkte verdunning 8 , 10 . Eerder gepubliceerde studies met klonale zebravis hebben vastgesteld dat LIC's 0,1-1,4% van de primaire T-ALL-cellen vormen"Xref"> 10. Hier wordt gerapporteerd op soortgelijke variabiliteit in de frequentie van zijbevolkingscellen (0,2-1,0%) van clonale zebravis T-ALLs ( Figuur 2 ). Verdere experimenten zijn nodig om te bepalen of de zijbevolking verrijkt is in LICs; Echter, ondersteunt de gelijkenis tussen de intervallen van LIC frequentie en het percentage van de bevolkingscellen in deze T-ALL's deze hypothese.
Terwijl de zijbevolkingsassay gevoelig is en niet altijd makkelijk uit te voeren, kunnen de onderzoekers voor het eerst een zeldzame populatie cellen in zebravis T-ALL isoleren die stam- of stamcellen bezit. Er zijn momenteel geen celoppervlakmarkers beschikbaar in zebravis om stam- of voorloperachtige cellen te identificeren; Dus de mogelijkheid om de zijbevolking te isoleren is zeer veelbelovend. Toekomstige toepassingen van deze methode omvatten grensverdunningstransplantatie-experimenten van gesorteerde zijpopulatie T-ALL-cellen om de verrijking van L te beoordelenICs. Bovendien zal deze methode toestaan dat kenmerken die LIC's definiëren die moeten worden toegelicht, inclusief de moleculaire mechanismen die LIC's in zebravis T-ALL regelen. Deze experimenten kunnen uitgangspunten bieden voor het ontdekken van nieuwe therapeutische doelstellingen voor T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het College van Vrouwen van de Universiteit van Chicago, het Wendy Will Case Fund, en de Universiteit van Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). We willen de Flow Cytometry Core aan de Universiteit van Chicago bedanken voor hun hulp bij het opzetten van dit experiment, evenals andere leden van de de Jong Lab, met name Leslie Pedraza en Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
