Summary
Her beskriver vi en teknikk for å isolere de sidepopulasjonsceller fra en sebrafisk modell av myc-indusert T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL). Denne side befolkning analysen er meget følsom, og er beskrevet for sebrafisk T-ALL, men det kan anvendes på andre maligne og ikke-maligne celletyper sebrafisk.
Abstract
Heterogene cellepopulasjoner, fra enten sunt eller ondartet vev, kan inneholde en populasjon av celler karakterisert ved en differensiell evne til å utflyte det DNA-bindende fargestoffet Hoechst 33342. Denne "sidepopulationen" av celler kan identifiseres ved hjelp av strømningscytometriske metoder etter Hoechst 33342 Fargestoff er begeistret av en ultrafiolett (UV) laser. Sidepopulasjonen av mange celletyper inneholder stam- eller stamcellerlignende celler. Ikke alle celletyper har imidlertid en identifiserbar sidepopulasjon. Danio rerio , zebrafish, har en robust in vivo modell av T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL), men om disse Zebrafish T-ALLene har en sidepopulasjon, er det ikke kjent. Metoden som beskrives her, beskriver hvordan man isolerer sidepopulasjonscellene i zebrafisk T-ALL. For å starte, genereres T-ALL i sebrafisk via mikroinjeksjon av tol2 plasmider i embryoer med en celle-fase. Når svulstene har vokst til et stadium hvor de utvides til mer enn halvparten av aniMal's kropp, kan T-ALL-cellene høstes. Cellene blir deretter farget med Hoechst 33342 og undersøkt ved hjelp av flytcytometri for sidepopulasjonsceller. Denne metoden har brede anvendelser i Zebrafish T-ALL forskning. Selv om det ikke finnes noen kjente celleoverflate markører i sebrafisk som bekrefter om disse sidestamceller er cancercellestamulignende, er in vivo funksjonelle transplantasjonsanalyser mulig. Videre kan enkeltcelletranscriptomikk brukes for å identifisere de genetiske egenskapene til disse sidebevolkscellene.
Introduction
Sidepopulasjonsassayet kapitaliserer på den forbedrede evne til visse celler i et vev for å utstrømme DNA-bindingsfargen Hoechst 33342 på grunn av høye nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) transportørproteiner på cellemembranen. Cellene som utstrømmer Hoechst 33342-fargestoffet kan identifiseres ved bruk av dobbeltbølgelengde-strømningscytometrisk analyse etter at fargestoffet er opphisset av en UV-laser. Denne analysen ble først brukt til å identifisere murine hematopoietiske stamceller (HSCs) 1 , men det har siden blitt brukt til å identifisere stamceller / stamcellepopulasjoner i mange vev og kreft (vurdert i referanse 2). Imidlertid har ikke alle populasjoner av celler en sidepopulasjon, og ikke alle sidepopulasjoner er beriket for stamme / stamceller.
Zebrafish er et kraftig vertebrat genetisk modell system for å studere menneske kreft 3 , 4 , med en rekke fordeler over tradisjonelle murine moDel av kreft. Sebrafiskembryoer er eksternt befruktet og er optisk klare, letter transgenese og in vivo observasjon av patologiske prosesser, inkludert kreftinitiering og progresjon. Hittil har sidebestemmelsesanalysen for å oppdage potensielle stamceller eller stamceller kun blitt brukt på nyremarven i sebrafisk for å identifisere HSCs, og ikke til noen sebrafisk kreftmodeller 5 , 6 .
Zebrafish-modellen av T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL) er morfologisk og genetisk lik human T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL er en aggressiv malignitet som i mennesker står for 10-15% av barn og 25% av voksne ALL-tilfeller 9 . Mens behandlingen av T-ALL har forbedret, er tilbakefall fortsatt vanlig og er forbundet med en dårlig prognose. T-ALL-svulster er heterogeneous og inneholder mange forskjellige tumorcellepopulasjoner, inkludert leukemi-initierende celler (Lics). Lics er definert ved deres evne til å vokse hele svulsten fra en enkelt celle, og frekvensen av Lics innenfor en tumorcellepopulasjon kan beregnes ved å transplantere forskjellige celle doser til mottakere via en begrensende fortynning transplantasjon assay (LDA). Mens LDA eksperimenter er blitt utført i sebrafisk for å beregne hyppigheten av Lics 8, 10, 11, er denne bestemmelse laget i ettertid, og gir ikke rom for den potensielle isolering av Lics. Derfor kan en metode for å isolere en populasjon prospektivt anriket for kreftstamcelle aktivitet mangler. Identifisering og isolering av sidepopulasjonsceller fra sebrafisk T-alls er det første skritt i retning av å ta opp denne mangel.
Protokollen presenteres her beskriver hvordan du effektivt generere T-ALL svulster i zebrafish utnytte tol2-mediert transgenesis, høste T-ALL-celler svulster, og beis dem med Hoechst 33342 for å identifisere den side populasjon av celler. Future in vivo eksperimenter med sebrafisk T-ALL kan omfatte om side befolknings cellene er beriket for Lics eller har andre stem- eller progenitor-lignende egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer med sebrafisk er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Chicago. University of Chicago er akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Generering og isolering av fluorescensmerkede T-ALL-celler i sebrafisk
- Mikroinjeksjon i syngene sebrafiskembryoer
- Bruk kommersielt tilgjengelige kits, isoler sirkulært rag2 : c-myc og rag2 : grønt fluorescerende protein ( rag2 : GFP) plasmid DNA som inneholder inverterte terminale gjentagelser anerkjent av tol2 transposase (se Materialetabell for kilde til plasmid DNA) 12 og eluere DNA I sterilt vann.
MERK: GFP brukes i denne studien, men noe fluorescerende protein vil fungere. - Forbered pCS2-transposase (tol2) RNA
- Isoler tol2 plasmid DNA ved bruk av kommersielt tilgjengelige kits (se than Tabell over Materialer for kilden til plasmid-DNA) 12 og eluere DNA i sterilt vann.
- Inkuber 1 ug tol2 DNA ved 37 ° C i 1 time med 5 enheter av restriksjonsenzym NotI i den passende buffer for å linearisere plasmidet. Varme-inaktivering av Notl ved 65 ° C i 20 min.
- Transkriberer RNA tol2 med SP6 RNA-polymerase fra det lineariserte DNA ved bruk av et kommersielt tilgjengelig kit RNA-transkripsjon 13. Oppbevar RNA i engangs alikvoter ved -80 ° C.
- Tilbered injeksjonsblandingen på is ved tilsetning av 250 ng av rag2: c-myc-plasmid-DNA, 250 ng av rag2: GFP plasmid-DNA, 150 ng tol2 RNA, og 0,5 ul av fenolrødt. Juster volumet til 10 ul med nuklease-fri vann.
- Injiser ~ 1 nL av injeksjonsblandingen inn i cellen fra en ett-cellestadiet syngen sebrafisk embryoet ved hjelp av en microinjector og nål trekkes fra et kapillært glassrør, følgende tidligere Establiserte metoder 8, 14.
MERK: syngene sebrafisk som genereres av parthenogenesis 15 er her brukt for å eliminere genetisk heterogen og immun avstøtning etter transplantering. Imidlertid kan villtypesebrafisk eller en hvilken som helst ønsket belastning også anvendes. - Fjerne døde, underutviklede, eller misdannede embryoer ved 24 timer og 48 timer etter injeksjonen 16.
- Plasser det injiserte fisk på fiskesystemet på 6 dager etter injeksjonen, og løfte dem i henhold til standard protokoll 6.
- Bruk kommersielt tilgjengelige kits, isoler sirkulært rag2 : c-myc og rag2 : grønt fluorescerende protein ( rag2 : GFP) plasmid DNA som inneholder inverterte terminale gjentagelser anerkjent av tol2 transposase (se Materialetabell for kilde til plasmid DNA) 12 og eluere DNA I sterilt vann.
- Screening injisert sebrafisk og registrering av tumorvekst
- Ved 21 dager etter injeksjon, plassere en enkelt injiseres larve i en dråpe av embryo medium på en petriskål og skjerm for GFP fluorescens ved hjelp av en epifluorescensmikroskop (eksitasjon båndpass: 470/40, emisjon båndpass: 525/50) 8.
MERK: Sebrafisk larver som have integrert både rag2: c-myc og rag2: GFP vil ha en grønn fluorescerende thymus (positiv fisk) og kan allerede oppviser en utvidelse av ondartede grønne fluorescerende celler utenfor thymus. All fisk med en GFP + thymus vil gå på å utvikle en GFP + T-ALL. Larvene som ikke demonstrerer integrasjon av plasmidene vil ikke ha noen grønne fluorescerende celler (negativ fisk). - Separer den negative fisk (basert på en mangel av fluorescens) inn i en annen tank og overvåke fisken igjen etter 28 og 35 dager etter injeksjon. Ved 28 og 35 dager etter injeksjon, bedøve fisk med 0,02% bufret trikain (MS-222) hos fisk system vann før screening.
- Plasser hver sebrafisk larve som er positiv for et fluorescensmerket thymus eller en fluorescerende merket tumor i et individ tank for registrering av tumorvekst tre ganger i uken.
- Ved 21 dager etter injeksjon, plassere en enkelt injiseres larve i en dråpe av embryo medium på en petriskål og skjerm for GFP fluorescens ved hjelp av en epifluorescensmikroskop (eksitasjon båndpass: 470/40, emisjon båndpass: 525/50) 8.
- Innsamling av fluorescensmerkede T-ALL-celler fra den primære tumor fisk
- Tilbered minst 20 ml 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum i 0,9x fosfatbuffet saltvann (FBS / PBS).
- Tilsett 1 ml FBS / PBS til ett hetteglass med heparinnatriumsalt (300 enheter).
- Velg fiskebærende svulster i mer enn 50% av kroppen, eller de fiskene som har problemer med å spise eller svømme. Offer fisken ved å overdose dem med trica eller ved isvann nedsenking. Bekreft døden ved mangel på gillbevegelse og hjerteslag.
- Bruk et knivblad for å fjerne fiskens hode.
- Vask hule av fisken med heparinoppløsningen for å fjerne overflødig røde blodlegemer.
- Bruk en pipette til å injisere 100 μl heparinoppløsning (forberedt i trinn 1.3.2) inn i kroppens hulrom. Fjern all væske som spylles ut (det vil inneholde blodceller) og pipetteres i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Bruk et nytt pipettespiss for å vaske kroppen igjen. Utfør minst tre vasker, eller til væsken som spylles ut, vises uten blood.
- Kast all væske fra vasken i trinn 1.3.5.1 og 1.3.5.2, da den ikke vil bli brukt i videre analyser.
- Samle leukemiceller.
- Injiser 100 μL FBS / PBS i kroppens hulrom av fisken.
- Påfør forsiktig trykk på utsiden av fiskens kropp med pipettespissen for å klemme / skyve ut tumorceller.
MERK: Hvis dette trinnet utføres ved hjelp av et dissekeringsmikroskop, vil tumorceller som spretter ut av kroppshulen bli tydelige. - Samle væsken og cellene fra hver vask i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Gjenta trinn 1.3.6.1-1.3.6.3 til de fleste svulstceller er samlet (vanligvis 5-10 ganger). Samle alle svulstceller inn i samme 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold cellene ved romtemperatur.
- Bland de samlede tumorcellene fra trinn 1.3.6 ved forsiktig å pipettere dem for å dissociere klumper av celler. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40-um mesh filter. Vask filter 1-2 ganger med 100 ul av FBS / PBS. Hold cellene ved romtemperatur.
- Bland 2 mL av cellesuspensjonen med 18 ul av trypan blått (0,4%, fortynnet 1:10 og filtrert) i et nytt rør. Belastning 10 ul på et hemocytometer og telle antall levende (ikke-fluorescerende blå) celler for å beregne antall isolerte tumorceller.
MERK: Ikke-blå GFP-negative celler er sannsynlig normale, ikke-maligne T-celler og skal ikke telles. Minst 2 x 10 6 celler er nødvendig for å farge cellene med Hoechst 33342.
2. flekker fluorescensmerkes T-alle cellene med Hoechst 33342 for å identifisere Side Befolknings
- Fortynn Hoechst 33342 1:10 med nuklease-fri H2O for å gjøre den 1 mg / mL arbeidskonsentrasjon. Oppbevar fargestoff ved 4 ° C og i mørket.
- Fremstill en 100 mM løsning av verapamil ved å oppløse 49,1 mg i 1 mL dimetylsulfoksyd (DMSO).
MERK: Verapamil er en hemmer av ABC-transportører og er en viktig kontroll for sidepopulasjonsforsøk. Tilsetning av verapamil til prøver vil hemme ABC-transportørens evne til å utløve Hoechst 33342-fargestoffet. Derfor vil en sann sidepopulasjon forsvinne når verapamil blir lagt til prøven. - Sett et vannbad til 28 ° C.
- Klargjør prøver og kontroller i mørket ved å legge til celler og løsninger til fluorescensaktiverte celle sorteringsrør (FACS).
- Klargjør prøvene ved å tilsette 10 6 celler, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 og 2,5 μl DMSO til et FACS-rør. Juster volumet til 1 ml med FBS / PBS.
- Forbered kontrollene ved å legge til 10 6 celler, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 og 2,5 μl 100 mM verapamil til et FACS-rør. Juster volumet til 1 ml med FBS / PBS.
MERK: Det anbefales minst 10 6 celler / prøve, men flekker flere celler er foretrukket, spesielt hvis siden befolker segIonceller vil bli sortert for videre analyse. Ikke overskride 10 6 celler / ml, og opprettholde Hoechst 33342 konsentrasjonen ved 15 μg / mL. Hvis 10 x 106 celler blir farget, er det totale reaksjonsvolumet 10 ml.
- Inkubér i et 28 ° C vannbad i mørket i 120 minutter.
- Etter inkuberingen, plasser cellene umiddelbart på is og hold dem i mørket.
- Pellet cellene ved 4 ° C i 6 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten. Vask med 1 ml FBS / PBS.
- Pellet cellene ved 4 ° C i 6 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml FBS / PBS.
- Hold ved 4 ° C til celle sortering.
- 15 min før cellesortering, legg til 2 μl propidiumjodid (PI) lager (1 mg / ml) til hver 1 ml FBS / PBS (sluttkonsentrasjon: 2 μg / ml). Bland godt.
3. Bruk FACS til å finne sidebefolkningen innenfor den fluorescensmerkede T-ALL-cellenes befolkning
- Bestem en gate for de levende, GFP + T-ALL-cellene.
- Bruk fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC) -området for å skille ut rusk.
MERK: FSC brukes til å skille celle størrelse og SSC brukes til å skille mellom granulariteten til cellen. - Bruk FSC og SSC bredde for å diskriminere dubletter.
MERK: Det er tre komponenter identifisert av strømningscytometerdetektorer: område, høyde og bredde. Området brukes vanligvis til å måle fluorescensen av cellen. Bredden måler tidspunktet for flyturen og er dobbelt så bred hvis to celler er klumpet sammen. - For levende tumorceller tegner du en gate rundt cellene som er positive for GFP og negativ for PI ved hjelp av de riktige detektorer ( f.eks . FITC for GFP og PerCP Cy5-5 for PI).
- Bruk fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC) -området for å skille ut rusk.
- Hvis du sorterer sidepopulasjonsceller for videre forsøk, bruk den store dysespissen (100 μm) og saml cellene inn i et FACS-rør som inneholder 3 ml 100% FBS. Bruk en større dysespiss (100 μm) i stedet for den mindre spissen (70 μm) for å forbedre cellens levedyktighet etter sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til effektivt å generere fluorescerende myc-induserte T-ALL-tumorer i zebrafisk, sirkulære DNA-konstruksjoner flankert av transposase tol2 områder kan ko-injisert med tol2 RNA. Tidligere studier fra injeksjon av linearisert DNA i sebrafisk embryo rapportere en 5% transgenesis sats 8. Med protokollen justert for å inkludere tol2-mediert transgenesis, kan transgenesis priser som strekker seg 10 til 44% observeres (tabell 1).
I den representativt eksempel, ble en fisk med et GFP + T-ALL farget med Hoechst 33342 for å bestemme prosentandelen av celler i populasjonen side. Figur 1 viser portstyringsskjema som brukes for å bestemme prosentandelen av sidepopulasjonsceller. Først, ved hjelp av FSC og SSC, blir T-ALL-celler ble isolert ved å utelukke rester (figur 1A), og deretter velger mot dubletter (figur 1B). Deretter isoleres alle levende celler ved å gate celler som er GFP + og negative for den døde celle diskriminatoren PI ( figur 1C ). Når de enkle, levende T-ALL-cellene er valgt, kan sidepopulasjonen finnes i Hoechst 33342-profilen. I hovedcellepopulasjonen forblir Hoechst 33342 i cellene, og disse cellene kan separeres i grupper med DNA-innhold. Sidenepopulationen av celler skiller seg imidlertid fra hovedcellepopulasjonen, da sidepopulasjonscellene utstrømmer fargestoffet på grunn av høyere antall ABC-transportører på cellemembranen. For å visualisere sidepopulasjonen brukes Hoechst-profilen til å sammenligne to kanaler, Hoechst Blue og Hoechst Red. Sidepopulasjonen er den svake halen av celler som strekker seg fra venstre side av hovedcellepopulasjonen mot Hoechst Blue-aksen ( Figur 1D ).
En sann sidepopulasjon vil gå tapt når cellene behandles med en inhibitor oF ABC-transportører, som verapamil. Figur 2 viser sidepopulasjonene i flere representative T-ALL-svulster, samt når disse svulstene behandles med verapamil under fargingen med Hoechst 33342. For å sikre at populasjonen som finnes i prøven er en sann sidepopulasjon, må disse cellene forsvinne I nærvær av inhibitoren, som vist i figur 2 .
| Lager nummer | Antall fiskene vist | Nummer Positiv | Grad av transgenesen |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabell 1: transgenesis priser ved bruk tol2 Transposase for Plasmid Mikroinjeksjon inn Sebrafisk embryoer. De beregnede tallene for transgenesis er vist i nitten forskjellige injeksjons dager. Antall fisk Filtrerte representerer antallet fisk som var i live 21 dager etter injeksjon, og antall positive representerer antallet fisk som var positive for fluoriserende tumorer.
Figur 1: Side Befolkning gating ordningen. Et eksempel på gating ordningen brukes til å identifisere siden befolkningen i en GFP + T-ALL i sebrafisk. (A) For det første avfallet er utelukket ved anvendelse av forover spredning (FSC) ogside scatter (SSC) område. (B) Deretter blir enkeltceller isolert ved å diskriminere dubletter ved hjelp FSC og SSC bredde parametere. (C) Etter dette eksemplet svulst var GFP +, alle levende celler, må være GFP + og negativ for den døde cellemarkøren propidium jodid. (D) Siden befolkningen kan sees med det Hoechst Red versus Hoechst blå profil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Side Befolkning forsvinner når Behandlet med ABC Transporter Sperre, Verapamil. Porter for siden befolkningen er vist. Toppfeltene viser fire forskjellige tumorprøver. Det er viktig å merke seg at ikke alle svulster har samme side befolkningen prosentandel, og siden befolkningen can se forskjellig for hver tumor ble testet. Bunnfeltene viser tumorprøver som ble behandlet med verapamil i løpet av farging med Hoechst 33342 for å blokkere fargestoff effluks. Mens side populasjoner kan se annerledes ut for hver svulst, er effekten av verapamil det samme: side befolkningen forsvinner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den side befolkning analysen er meget følsom; Derfor kan små endringer i protokollen resultere i vanskeligheter ved påvisning av sidepopulasjonsceller. For det første er den temperatur under fargingstrinn som er spesifikt for hvert dyr / cellesystem. For pattedyrsystemer, er side populasjonen analysen typisk utført ved 37 ° C 2. Når sebrafisk T-ALL-celler ble inkubert ved 37 ° C, mange av cellene døde, noe som gjorde denne inkubasjonstemperaturen uakseptabelt (data ikke vist). Når Kobayashi og kolleger (2008) dissekert sebrafisk nyre marg for side populasjonen analyse ble inkubasjonen utført ved 25 ° C 5. Denne inkubasjonstemperaturen var ikke tilstrekkelig for sebrafisk T-ALL-celler, som resulterte i en svak Hoechst 33342 profil (data ikke vist). I den protokoll som er beskrevet her, en inkubasjonstemperatur på 28 ° C var optimal for å opprettholde cellenes levedyktighet og for å oppnå en sterk Hoechst 33342-profil.
En andre betingelse for den siden populasjonen analysen som krever behandling og før testingen er konsentrasjonen av Hoechst 33342. Hvis konsentrasjonen av Hoechst 33342 er for lav, kan den siden populasjonen ikke være synlig, eller den side populasjonen fenotypen (fargestoff-utløpsevne) kan bli feilaktig økes, identifisere flere sidepopulasjonsceller enn det som faktisk er til stede to. På den annen side kan en for høy konsentrasjon av Hoechst 33342 være toksisk for cellene. For sebrafisk T-ALL-celler, 15 ug / mL Hoechst 33342 ble inkubert i 120 minutter er en optimal kombinasjon. Lavere konsentrasjoner av Hoechst 33342 ble forsøkt for sebrafisk T-ALL-celler, men den side populasjonen var ikke alltid tydelig (data ikke vist). En total inkubasjonstid på 90 min var tilstrekkelig til å påvise en side befolkningen, men det maksimale antall sidepopulasjonsceller ble observert etter 120 min inkubasjonstid.
Som rapportert tidligere for pattedyr s Ystems, ikke alle svulster vil ha en påvisbar sidepopulasjon 17 , 18 , 19 . Ved bruk av denne metoden observerte vi en sidepopulasjon i 14 av 17 T-ALL-testet (data ikke vist). Etter å ha isolerte sidestamceller fra T-ALL, forventes denne metoden å gjelde for andre sebrafisk-svulstmodeller.
Innenfor den heterogene sebrafisk-T-ALL-svulsten, er leukemi-initierende celler (LICs) i stand til å gjenopplive tumorvekst og som sådan antas å være ansvarlig for kreftrepetens og metastase. For tiden er det ingen metode i sebrafisk som muliggjør den potensielle isoleringen av LICs in vivo . Beregning av LIC-frekvensen krever tumorcelletransplantasjon ved en begrensende fortynning 8 , 10 . Tidligere publiserte studier med klonal sebrafisk har identifisert at LICer utgjør 0,1-1,4% primære T-ALL-celler"Xref"> 10. Her er det rapportert tilsvarende variasjon i hyppigheten av sidepopulasjonsceller (0,2-1,0%) fra klonale sebrafisk T-ALLs ( Figur 2 ). Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å bestemme om sidepopulasjonen er beriket i LICs; Likevel støtter likningen mellom områdene LIC-frekvens og prosentandelen av sidestamceller i disse T-ALLene denne hypotesen.
Selv om sidepopulasjonsanalysen er sensitiv og ikke alltid lett å utføre, tillater analysen for første gang å isolere en sjelden populasjon av celler i zebrafisk T-ALL som kan ha stamme- eller stamcelleegenskaper. Det finnes for tiden ingen celleoverflate markører tilgjengelig i sebrafisk for å identifisere stam- eller stamcellerlignende celler; Derfor er evnen til å isolere sidepopulasjonen svært lovende. Fremtidige anvendelser av denne metoden inkluderer grensefortynningstransplantasjonseksperimenter av T-ALL-celler med sortert sidepopulasjon for å vurdere anrikningen av LICs. I tillegg vil denne fremgangsmåte gi kjennetegn som definerer Lics å bli klarlagt, inkludert de molekylære mekanismer som styrer Lics i zebrafisk T-ALL. Disse eksperimentene kan gi utgangspunkt for oppdagelsen av nye terapeutiske mål for T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av University of Chicago kvinner styret, Wendy Will sak Fund, og University of Chicago Comprehensive Cancer Centre Support Grant (P30 CA014599). Vi ønsker å takke flowcytometrisystemer Kjerne ved University of Chicago for deres hjelp i å sette opp dette forsøket, og i tillegg til andre medlemmer av de Jong lab, særlig Leslie Pedraza og Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
