Summary
Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.
Abstract
Hem sağlıklı hem de habis dokudan heterojen hücre popülasyonları, DNA bağlama boyası Hoechst 33342'yi dışarı atma yeteneği ile karakterize bir hücre popülasyonu içerebilir. Hücrelerin bu "yan popülasyonu", Hoechst 33342'den sonra akış sitometrik yöntemleri kullanılarak tanımlanabilir Boya ultraviyole (UV) lazerle uyarılır. Birçok hücre tipinin yan popülasyonu stem veya progenitor benzeri hücreler içerir. Bununla birlikte, tüm hücre tiplerinin tanımlanabilir yan popülasyonu yoktur. Danio rerio , zebrafish, T hücreli akut lenfoblastik löseminin (T-ALL) sağlam bir in vivo modeline sahip ancak bu zebra bağı T-ALL'lerin bir yan popülasyonu olup olmadığı bilinmiyor. Burada açıklanan yöntem, zebra balığı T-ALL'deki yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edilebileceğini açıklamaktadır. Başlamak için, zebra balığı içindeki T-ALL, tol2 plazmidlerinin bir hücre evresi embriyolarına mikroenjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörler aniden yarısından fazlasına genişlediği bir aşamaya geldiğindeMalın vücudu, T-ALL hücreleri hasat edilebilir. Hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile lekelenir ve yan popülasyon hücreleri için akış sitometrisi ile muayene edilir. Bu yöntem, zebra balığı T-ALL araştırmasında geniş uygulamalara sahiptir. Zebra balığı içinde bu yan popülasyon hücrelerinin kanserli kök hücre benzeri olup olmadığını teyit eden bilinen bir hücre yüzeyi belirteçleri bulunmamakla birlikte, in vivo fonksiyonel transplantasyon testleri mümkündür. Ayrıca, bu yan popülasyon hücrelerinin genetik özelliklerini tanımlamak için tek hücreli transkriptomikler uygulanabilir.
Introduction
Yan nüfus tahlili hücre zarı ATP bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı proteinler, yüksek düzeyde bir DNA bağlanma boya Hoechst 33342 akıttığı bir doku içinde belli hücrelerinin gelişmiş yetenek istifade. Hoechst 33342 boya dışa akımı, hücreler boya UV lazeri tarafından uyarılır sonra dual dalga boyu akış sitometrik analizi kullanılarak tespit edilebilir. Bu deney, ilk olarak fare hematopoietik kök hücreler (HSC), 1 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak güne kadar bir çok doku ve kanser kök / progenitör hücre popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır (referans 2 de incelenmiştir). Ancak, bütün hücre popülasyonları bir yan nüfusu ve tüm yan popülasyonları kök / progenitör hücreler açısından zenginleştirilmiş olan değil.
Zebra balığı, geleneksel fare mo üzerinde avantaj sayı ile insan kanseri 3, 4 çalışmak için güçlü bir omurgalı genetik model sistemKanserin DELS. Balığı embriyolar harici transgenesis ve kanser başlangıcında ve ilerlemesinde de dahil olmak üzere patolojik süreçlerin, in vivo gözlem kolaylaştıran döllenir ve optik açıdan berrak olan edilir. Bugüne kadar, yan nüfus tahlil potansiyel kök veya progenitör hücreler sadece HKH'lerin tespit etmek zebrabalıkları böbrek iliği uygulanır ve herhangi bir Zebra balığı kanser modelleri 5, 6 olmuştur algılamak için.
T-hücresi akut lenfoblastik lösemi zebra balığı modeli (T-ALL) morfolojik ve insan T-ALL 7, 8, 11 arasındaki genetik olarak benzer. T-ALL, insanlarda, pediatrik% 10-15'ini ve TÜM vakaların 9 yetişkin% 25'i oluşturuyor saldırgan kanseridir. T-ALL tedavisi geliştirilmiş olsa da, nüks hala yaygındır ve kötü prognoz ile ilişkilidir. T-ALL tümörler Heterojen olanLösemi başlatan hücreler (LIC'ler dahil olmak üzere birçok farklı tümör hücresi alt popülasyonu içerir. LIC'ler tek bir hücreden tüm tümörü yeniden başlatma kabiliyetleri ile tanımlanır ve bir tümör hücre popülasyonu içerisindeki LIC'lerin sıklığı, sınırlayıcı bir seyreltme transplantasyon testi (LDA) aracılığıyla çeşitli hücre dozlarını alıcılara naklederek hesaplanabilir. LICs 8 , 10 , 11 frekansını hesaplamak için zebrafish'de LDA deneyleri yapılırken, bu belirleme gezinme sırasında yapılır ve LIC'lerin prospektif izolasyonuna izin vermez. Bu nedenle, kanserli kök hücre aktivitesi için zenginleştirilmiş bir popülasyonu prospektif olarak izole etmek için bir yöntem bulunmamaktadır. Zebra balığı T-ALL'lerinden yan popülasyon hücrelerinin belirlenmesi ve izole edilmesi bu eksikliği gidermeye yönelik ilk adımdır.
Burada sunulan protokol, Zebr'de T-ALL tümörlerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini açıklamaktadırafish tol2 aracılı transgenesis kullanan T-ALL tümörler hücreleri hasat ve hücrelerin yan popülasyonu tespit Hoechst 33342 ile boyanır. Zebra balığı, T-ALL in vivo deney gelecek yan popülasyonu, hücrelerin Lics için zenginleştirilmiş ya da diğer stem- veya projenitör benzeri özelliklere sahip olup olmadığı içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Chicago Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chicago Üniversitesi, Laboratuar Hayvan Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Birliği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir.
1. Floresanla Etiketli T-ALL Hücrelerini Zebra bağı ile Üretme ve İzole etme
- Eşzamanlı zebrabalık embriyolarına mikroenjeksiyon
- Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak, tol2 transposaz (plazmid DNA kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız) tarafından tanınan ters terminal tekrarlarını içeren plazmid DNA'yı izole edin ve DNA'yı elute edin Steril su içinde.
NOT: Bu çalışmada GFP kullanılır, ancak herhangi bir flüoresan proteini işe yarayacaktır. - PCS2-transposaz (tol2) RNA hazırlayın
- Ticari olarak temin edilebilir kitleri kullanarak tol2 plazmid DNA'yı izole edin (bakınız tPlazmid DNA kaynağı için Tablo Malzemesi) 12 ve steril suda DNA'yı elute edin.
- Plazmid doğrusallaştırmak için uygun tampon 5 birim NotI kısıtlama enzimi ile 1 saat 37 ° C'de 1 μg tol2 DNA inkübe edin. NotI'yi 65 ° C'de 20 dakika ısı ile inaktive edin.
- Ticari olarak mevcut bir RNA transkripsiyon kiti 13 kullanarak doğrusallaştırılmış DNA'dan tol2 RNA'sını SP6 RNA polimeraz ile kopyalayın 13 . RNA'yı -80 ° C'de tek kullanımlık bölümler halinde saklayın.
- 250 ng rag2 : c-myc plazmid DNA, 250 ng rag2 : GFP plazmid DNA, 150 ng tol2 RNA ve 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyerek buz üzerine enjeksiyon karışımını hazırlayın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 μL'ye ayarlayın.
- ~ 1 nL enjeksiyon karışımını, tek hücreli bir evre syngeneic zebra balığı embriyonunun hücresine enjekte edin, daha önce kurulmuş bir cam kılcal borudan çekilen bir mikroenjektör ve iğne kullanarakBitmiş Yöntemler 8 , 14 .
NOT: Transgenik süreç 15 ile üretilen sinsinik zebrafish, transplantasyondan sonra genetik heterojenliği ve bağışıklık reddini ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, vahşi tip zebra bifiş veya herhangi bir istenen suş da kullanılabilir. - Enjeksiyondan 24 saat 48 saat sonra ölü, az gelişmiş veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın.
- Enjekte edilen balıkları enjeksiyondan 6 gün sonra balık sistemine yerleştirin ve standart protokole göre yükseltin 6 .
- Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak, tol2 transposaz (plazmid DNA kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız) tarafından tanınan ters terminal tekrarlarını içeren plazmid DNA'yı izole edin ve DNA'yı elute edin Steril su içinde.
- Tarama enjekte edilen zebra balığı ve tümör büyümesinin izlenmesi
- Enjeksiyondan 21 gün sonra, bir epifluorescent mikroskop (uyarılma band pass: 470/40, emisyon bandpass: 525/50) kullanarak bir Petri kabı ve ekran GFP floresan embriyo orta bir damla tek bir enjekte larva yerleştirin.
NOT: Zebra balığı larvaları oHem rag2 : c-myc hem de rag2'yi entegre etmiştir : GFP, yeşil bir flüoresan timusa (pozitif balık) sahip olacak ve timüsün ötesinde habis yeşil fluoresan hücrelerinin genişlemesi gösterebilir. Bir GFP + timüslü tüm balıklar, bir GFP + T-ALL geliştirmeye devam edecektir. Plazmitlerin entegrasyonunu göstermeyen larvalar, herhangi bir yeşil floresan hücresi (negatif balık) içermezler. - Negatif balı (flüoresans eksikliğine bağlı olarak) ayrı bir tüp içine yerleştirin ve enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra balıkları tekrar izleyin. Enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra, balıkları taramadan önce balık sistemi suyunda% 0.02 tamponlu trikain (MS-222) ile anestezi altına alınız.
- Bir floresan etiketli timüs veya floresan etiketli bir tümör için pozitif olan her bir zebra balığı larva'yı, haftada üç kez tümör büyümesini izlemek için tek bir tanka yerleştirin.
- Enjeksiyondan 21 gün sonra, bir epifluorescent mikroskop (uyarılma band pass: 470/40, emisyon bandpass: 525/50) kullanarak bir Petri kabı ve ekran GFP floresan embriyo orta bir damla tek bir enjekte larva yerleştirin.
- Primer tümör balıklarından floresan etiketli T-ALL hücrelerinin toplanması
- 0.9x fosfat tamponlu salin (FBS / PBS) içinde en az 20 mL% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetüs sığır serumu hazırlayın.
- Bir şişe heparin sodyum tuzu (300 ünite) 1 mL FBS / PBS ekleyin.
- Vücudun% 50'sinden fazlasındaki balık içeren tümörleri veya yeme veya yüzme konusunda zorluk çeken balıkları seçin. Balıkları tricaine ile aşırı dozda kurutun veya buzlu suyla daldırın. Solunum hareketleri ve kalp atışlarından yoksun olarak ölümü onaylayın.
- Balık başını çıkarmak için traş bıçağı kullanın.
- Aşırı kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için balık kavitesini heparin solüsyonu ile yıkayın.
- Bir pipet kullanarak, balıkların vücut boşluğuna 100 mcL heparin solüsyonu (adım 1.3.2'de hazırlanmıştır) enjekte edin. Dışa akan tüm sıvıları (kan hücreleri içerecektir) çıkarın ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
- Vücudunu tekrar yıkamak için yeni bir pipet kullanın. En az üç kez yıkayın ya da dökülen sıvı berrak hale gelinceye kadarood.
- Daha sonraki analizlerde kullanılmayacağı için, 1.3.5.1 ve 1.3.5.2 adımlarında yıkamalardaki tüm sıvıyı atın.
- Lösemi hücrelerini toplayın.
- Balıkların vücut boşluğuna 100 μL FBS / PBS enjekte edin.
- Tüm hücreleri sıkmak / itmek için pipetin ucuyla balık gövdesinin dışına nazik bir basınç uygulayın.
NOT: Eğer bu adım bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak gerçekleştirilirse, vücut boşluğundan dökülen tümör hücreleri belirgindir. - Her bir yıkamadan 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne sıvı ve hücreler toplayın.
- Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar (genellikle 5-10 defa) adım 1.3.6.1-1.3.6.3'ü tekrarlayın. Tüm tümör hücrelerini aynı 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne alın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
- Adım 1.3.6'daki toplanan tümör hücrelerini, hücrelerin yığınlarını ayırmak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücre süspansiyonunu 4'ten0 um gözenekli filtre. Filtre 1-2 kez 100 uL FBS / PBS ile yıkanır. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
- Yeni bir tüpte tripan mavisinin (0.4%, seyreltilmiş 1:10 ve filtrelenmiş) 18 μL'lik hücre süspansiyonunun 2 μL'sini karıştırın. Bir hemositometre üzerine 10 mcL yükleyin ve izole edilmiş tümör hücrelerinin sayısını hesaplamak için canlı (mavi olmayan) floresan hücrelerinin sayısını hesaplayın.
NOT: Mavi olmayan GFP negatif hücreler büyük olasılıkla normal, kötü huylu olmayan T hücreleridir ve sayılmamalıdır. Hoechst 33342 ile hücrelerin lekelenmesi için en az 2 x 106 hücre gereklidir.
2. Florokimyasal olarak Etiketli T-ALL Hücrelerini, Hoechst 33342 ile Boyanarak Yan Populasyonu Belirleyin
- 1 mg / mL çalışma konsantrasyonunu oluşturmak için Hoechst 33342 1:10 'ı nükleaz içermeyen H20 ile seyreltin. Boya 4 ° C'de ve karanlıkta saklanmalıdır.
- 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 49.1 mg eriterek bir 100 mM verapamil solüsyonu hazırlayın.
NOT: Verapamil, ABC taşıyıcılarının bir inhibitörüdür ve yan popülasyon deneyleri için önemli bir kontroltür. Numunelere verapamil ilavesi, ABC taşıyıcılarının Hoechst 33342 boyasını atma kabiliyetini engelleyecektir. Dolayısıyla, verapamil numuneye eklendiğinde doğru bir yan nüfus kaybolur. - 28 ° C'ye kadar su banyosu yapın.
- Floresansla aktive hücre ayırıcı (FACS) tüplerine hücre ve solüsyon ekleyerek örnekleri ve kontrolleri karanlıkta hazırlayın.
- Numuneleri, bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL DMSO ilave ederek hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
- Bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 uL 100 mM verapamil ilave ederek kontrolleri hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
NOT: Minimum 10 6 hücre / numune önerilir, ancak özellikle yan populatİyon hücreleri daha ileri analiz için sıralanacaktır. 10 6 hücre / mL'yi aşmayın ve Hoechst 33342 konsantrasyonunu 15 μg / mL'de tutun. 10 x 10 6 hücre lekelenirse, toplam reaksiyon hacmi 10 mL'dir.
- Karanlıkta 120 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri hemen buz üzerine koyun ve karanlıkta tutun.
- Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika 300 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika 300 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS'de hücreleri tekrar süspanse edin.
- Hücrenin sınıflandırılıncaya kadar 4 ° C'de tutun.
- Hücre ayırmadan 15 dakika önce, her bir 1 mL FBS / PBS (son konsantrasyon: 2 ug / mL) 2 μL propidyum iyodür (PI) stokunu (1 mg / mL) ekleyin. İyice karıştırın.
3. Floresanla Etiketlenmiş T-ALL Hücre Popülasyonunda Yan Popülasyonu Bulmak için FACS kullanın
- canlı için bir kapı belirleyin, GFP + T-ALL hücreleri.
- kapı üzerinden çöp Kullanım İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) alan.
NOT: FSC hücre boyutunu ayırt etmek için kullanılır ve SSC hücresinin ayrıntı düzeyini ayırt etmek için kullanılır. - çiftleri ayırt FSC ve SSC genişliği kullanım.
NOT: Alan, boy ve genişlik: detektörleri akış sitometresi ile tanımlanan üç bileşeni vardır. Konum tipik olarak hücrenin floresan ölçmek için kullanılır. Genişliği uçuş süresini ölçen ve iki hücre yığılmaz ve sanki iki kat geniştir. - Canlı tümör hücreleri için uygun dedektörleri kullanarak PI için GFP için pozitif ve negatif hücrelerin etrafındaki bir kapı çizin (örneğin GFP ve PI için PerCP Cy5-5 için FITC).
- kapı üzerinden çöp Kullanım İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) alan.
- başka deneyler için yan nüfus hücreleri sıralama durumunda, büyük meme ucu (100 um) kullanmak ve% 100 FBS 3 mL içeren bir FACS tüpü içine hücreleri toplamak. sıralama sonra hücre canlılığı artırmak için daha büyük bir meme ucu (100 um) yerine daha küçük bir uç (70 um) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebra balığı içinde fluoresan myc kaynaklı T-ALL tümörleri verimli bir şekilde üretmek için, tol2 transposaz bölgeleri ile çevrili dairesel DNA yapıları tol2 RNA ile birlikte enjekte edilebilir. Doğrusallaştırılmış DNA'nın zebrafish embriyolarına enjeksiyonundan önceki çalışmalar,% 5 transgenesis oranı 8 bildirmektedir. Protokol, tol2 aracılıklı transgenezi içerecek şekilde ayarlandığında,% 10-44 arasında değişen transgenez oranları gözlemlenebilir ( Tablo 1 ).
Temsili örnekte, yan popülasyondaki hücrelerin yüzdesini belirlemek için GFP + T-ALL'li bir balık Hoechst 33342 ile boyandı. Şekil 1 , yan popülasyon hücrelerinin yüzdesini belirlemek için kullanılan kapılama şemasını göstermektedir. Birincisi, FSC ve SSC'yi kullanarak, T-ALL hücreleri, enkaz hariç tutularak ( Şekil 1A ) izole edilir ve daha sonra çiftleşmelere karşı seçilir ( Şekil 1B ). Daha sonra, tüm canlı hücreler, GFP + olan hücre dolaşımı ve ölü hücre ayırıcı PI için negatif olarak izole edilir ( Şekil 1C ). Tek canlı T-ALL hücreleri seçildikten sonra yan popülasyon Hoechst 33342 profilinde bulunabilir. Ana hücre popülasyonunda Hoechst 33342 hücrelerde kalır ve bu hücreler DNA içeriği ile gruplara ayrılabilir. Bununla birlikte, yan popülasyon hücreleri, hücre zarı üzerindeki ABC taşıyıcılarının daha yüksek sayılarına bağlı olarak boya çıktıklarından, hücrelerin yan popülasyonu ana hücre popülasyonundan ayırdedilebilir. Yan popülasyonu görselleştirmek için, Hoechst profili iki kanal, Hoechst Blue ve Hoechst Red'i karşılaştırmak için kullanılır. Yan popülasyon, ana hücre popülasyonunun sol tarafından Hoechst Blue eksenine doğru uzanan küçücük kuyruk hücresidir ( Şekil 1D ).
Hücreler bir inhibitör ile muamele edildiğinde gerçek bir yan popülasyon kaybolacaktır.Verapamil gibi ABC taşıyıcıları. Şekil 2 , birkaç temsilci T-ALL tümöründeki yan popülasyonları ve bu tümörler Hoechst 33342 ile boyama sırasında verapamille tedavi edildiğinde gösterir. Numunede bulunan popülasyonun gerçek bir yan popülasyon olduğundan emin olmak için, bu hücreler ortadan kaybolmalıdır Inhibitör varlığında, Şekil 2'de gösterildiği gibi.
| Stok numarası | Taranan Balık Sayısı | Pozitif Olmayan Numara | Transgenezis Oranı |
| 930 | 21 | 3 | % 14.3 |
| 934 | 12 | 4 | % 33.3 |
| 950 | 12 | 5 | % 41.7 |
| 951 | 19 | 3 | % 15.8 |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | % 33.3 |
| 983 | 9 | 4 | % 44.4 |
| 1004 | 30 | 3 | % 10.0 |
| 1013 | 4 | 1 | % 25.0 |
| 1025 | 35 | 5 | % 14.3 |
| 1029 | 10 | 2 | % 20.0 |
| 1065 | 5 | 1 | % 20.0 |
| 1070 | 6 | 1 | % 16.7 |
| 1073 | 19 | 8 | % 42.1 |
| 1079 | 8 | 1 | % 12.5 |
| 1105 | 38 | 7 | % 18.4 |
| 1193 | 30 | 8 | % 26.7 |
| 1215 | 9 | 1 | % 11.1 |
| 1229 | 10 | 2 | % 20.0 |
| 1314 | 6 | 1 | % 16.7 |
Tablo 1: Zebra balığı Embriyolarına Plasmid Mikroenjeksiyonu için tol2 Transposazı Kullanıldığında Transgenesis Oranları. Transgenezin hesaplanan oranları ondokuz ayrı enjeksiyon günü için gösterilir. Taranan Balık Sayısı, enjeksiyondan 21 gün sonra canlı kalan balık sayısını ve Sayı Olumlu, flüoresan tümörleri için pozitif olan balık sayısını temsil eder.
Şekil 1: Yan Populasyon Geçiş Şeması. Zebra bif'te bir GFP + T-ALL'deki yan popülasyonu tanımlamak için kullanılan kapılama şemasına örnek. ( A ) Önce, öne saçılma (FSC) kullanılarak enkaz atılır veYan dağılım (SSC) alanı. ( B ) Daha sonra, tek hücreler FSC ve SSC genişlik parametrelerini kullanarak çiftlere karşı ayırt edilerek izole edilir. ( C ) Bu örnek tümör GFP + olduğundan, tüm canlı hücreler ölü hücre markörü Propidium Iodide için GFP + ve negatif olmalıdır. ( D ) Yan popülasyon Hoechst Kırmızı karşı Hoechst Blue profili ile görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: ABC Taşıyıcı İnhibitörü Verapamil ile Tedavi Edildiğinde Yan Nüfus Yok Oluyor. Yan nüfus için kapılar gösterilir. Üst paneller dört farklı tümör örneğini göstermektedir. Tüm tümörlerin aynı yan nüfus yüzdesine sahip olmadığını ve yan nüfusunN test edilen her tümör için farklı görünür. Alt paneller, boya akışı engellemek için Hoechst 33342 ile boyama sırasında verapamil ile tedavi edilen tümör örneklerini göstermektedir. Yan popülasyonlar her tümör için farklı görünse de, verapamil'in etkisi aynı: yan popülasyon kaybolur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yan popülasyon tahlili oldukça duyarlıdır; Bu nedenle, protokoldeki küçük değişiklikler, yan popülasyon hücrelerinin saptanmasında zorluklara neden olabilir. İlk olarak, boyama aşamasındaki sıcaklık, her bir hayvan / hücre sistemine özeldir. Memeli sistemleri için yan popülasyon tahlili tipik olarak 37 ° C'de yapılır. Zebra balığı T-ALL hücreleri 37 ° C'de inkübe edildiğinde, çoğu hücre öldü ve bu inkübasyon sıcaklığını kabul edilemez duruma getirdi (veriler gösterilmedi). Kobayashi ve meslektaşları (2008), yan popülasyon tahlili için zebra balığı böbrek iliğini parçaladığında inkübasyonlar 25 ° C'de gerçekleştirildi. Bu inkübasyon sıcaklığı zebrafish T-ALL hücreleri için zayıftı, zira zayıf bir Hoechst 33342 profili oluşturdu (veriler gösterilmemiştir). Burada açıklanan protokolde, 28 ° C'lik inkübasyon sıcaklığı, hücre yaşayabilirliğini korumak ve güçlü bir Hoechst 33342 profili elde etmek için optimaldi.
Dikkat edilmesi gereken ve önceden test edilmesi gereken yan popülasyon tahlilinin ikinci bir şartı, Hoechst 33342 konsantrasyonudur. Hoechst 33342 konsantrasyonu çok düşükse, yan popülasyon görünmeyebilir veya yan popülasyon fenotipi (boya atılabilme kabiliyeti) olabilir Fiilen mevcut olanlardan daha fazla yan nüfus hücresini belirleyerek, yanlışlıkla arttırılabilir 2 . Öte yandan, Hoechst 33342 konsantrasyonunun çok yüksek olması hücrelere toksik olabilir. Zebra balığı T-ALL hücreleri için 120 dakika inkübe edilen 15 ug / mL Hoechst 33342 en uygun kombinasyondur. Düşük konsantrasyonlarda Hoechst 33342, zebra balığı T-ALL hücreleri için denendi, ancak yan popülasyon her zaman belirgin değildi (veriler gösterilmemiştir). Bir yan popülasyonu saptamak için 90 dakika toplam inkübasyon süresi yeterliydi, ancak 120 dakika inkübasyon süresinden sonra yan popülasyon hücrelerinin maksimum sayısı görüldü.
Daha önce memeliler için bildirildiği gibi Ancak, her tümörün saptanabilir bir yan nüfusu olmayacak 17,18,19. Bu yöntemi kullanarak test edilen 17 T-ALLs'ten 14'ünde bir yan popülasyon gözlemledik (veriler gösterilmemiştir). T-ALL'lerden yan popülasyon hücrelerini izole eden bu yöntemin diğer zebra bağı tümör modellerine uygulanması beklenmektedir.
Heterojen zebra balığı T-ALL tümörü içinde, lösemi başlatan hücreler (LIC'ler) tümör büyümesini yeniden başlatma kabiliyetine sahiptir ve kanser tekrarlaması ve metastazından sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Şu anda, zebra balığı içerisinde LIC'lerin in vivo prospektif izolasyonuna izin veren bir yöntem yoktur. LIC frekansının hesaplanması, sınırlandırıcı bir seyreltmeyle tümör hücresi transplantasyonunu gerektirir 8 , 10 . Klonal zebra balığı ile daha önce yayınlanmış çalışmalar, LIC'lerin primer T-ALL hücrelerinin% 0.1-1.4'ünü oluşturduğunu tespit etmiştir"Xref"> 10. Burada, klonal zebra bağı T-ALL'lerinden yan popülasyon hücrelerinin sıklığında (% 0.2-1.0) benzer değişkenlik bildirilmektedir ( Şekil 2 ). Yan popülasyonun LIC'lerde zengin olup olmadığını belirlemek için başka deneyler gereklidir; Bununla birlikte, LIC sıklığının aralıkları ile bu T-ALL'lerdeki yan popülasyon hücrelerinin yüzdesi arasındaki benzerlik bu hipotezi desteklemektedir.
Yan popülasyon tahlili hassas ve her zaman gerçekleştirilmesi kolay olmasa da, tahlil, araştırmacıların, ilk kez, zebrafish T-ALL'de kök veya progenitör hücre özelliklerine sahip olabilen nadir bir hücre popülasyonunu izole etmelerini sağlar. Zebrafish'de kök veya progenitör benzeri hücreleri tanımlamak için şu anda hiçbir hücre yüzeyi markörü mevcut değildir; Dolayısıyla, yan nüfusu ayırma kabiliyeti çok umut vericidir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları arasında, sıralanan yan popülasyon T-ALL hücrelerinin limit seyreltme nakli deneyleri, L zenginleşmesini değerlendirmek içinIC. Buna ek olarak, bu yöntem, Zebrafish T-ALL'deki LIC'leri yöneten moleküler mekanizmalar da dahil olmak üzere, LIC'leri tanımlayan özelliklerin açıklanmasına izin verecektir. Bu deneyler, T-ALL için yeni terapötik hedeflerin bulunması için başlangıç noktaları sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Chicago Kadın Kurulu Üniversitesi Wendy Will Vaka Fonu ve Şikago Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibe Üniversitesi (P30 CA014599) tarafından desteklenmiştir. Bu deneme oluşturmayla katkılarından dolayı Chicago Üniversitesi'nde Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum ve iyi de Jong laboratuarında diğer üyeleri, özellikle Leslie Pedraza ve Sean McConnell olarak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
