Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55722
Automatic Translation
2, 1, 3, 1
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Summary

Vi presenterer en protokoll for å generere en kondrogen linje fra humant perifert blod (PB) via induserte pluripotente stamceller (iPSCs) ved hjelp av en integrasjonsfri metode, som inkluderer embryoid kropps (EB) dannelse, utvidelse av fibroblastiske celler og kondrogen induksjon.

Abstract

I denne studien brukte vi perifere blodceller (PBC) som frøceller til å produsere kondrocytter via induserte pluripotente stamceller (iPSCs) i en integrasjonsfri metode. Etter dannelse av embryoidkropp (EB) og fibroblastisk celleutvidelse, induseres iPSCs for kondrogen differensiering i 21 dager under serumfrie og xenofrie forhold. Etter kondrocyt-induksjon evalueres cellens fenotyper ved morfologiske, immunhistokjemiske og biokjemiske analyser, samt ved kvantitativ sanntids-PCR-undersøkelse av kondrogen-differensieringsmarkører. Kondrogenpellets viser positiv alcianblå og toluidinblå flekker. Immunohistokjemien for kollagen II og X-farging er også positiv. Den sulfaterte glukosamin-glukanoid-(sGAG) innholdet og chondrogen differensieringsmarkører KOLLAGEN 2 (COL2), kollagen 10 (COL10), blir SOX9, og aggrecan signifikant oppregulert i chondRogeniske pellets sammenlignet med hiPSC og fibroblastiske celler. Disse resultatene antyder at PBC kan brukes som frøceller for å generere iPSCs for bruskreparasjon, som er pasientspesifikk og kostnadseffektiv.

Introduction

Bruskvev har en svært dårlig kapasitet til selvreparasjon og regenerering. Ulike kirurgiske inngrep og biologiske behandlinger brukes til å gjenopprette brusk og leddfunksjon, med utilfredsstillende resultater. Den siste utviklingen av stamcelleteknologi kan forandre hele brusk reparasjonsfeltet 1 . Ulike stamceller har blitt studert som frøceller, men menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) synes å være det mest lovende valget, da de kan gi mange typer pasientspesifikke celler uten å forårsake avvisningsreaksjoner 2 . Videre kan de overvinne voksne cellers begrensede proliferative natur og opprettholde selvfornyelse og pluripotente evner. Videre kan genmålretting brukes til å endre genotypen for å oppnå spesifikke typer kondrocytter.

Fibroblaster har vært mye brukt til å generere iPSCs fordi deres omprogrammeringspotensialer også har blitt godt studert.Imidlertid er det fortsatt noen begrensninger som må overvinnes, for eksempel smertefull biopsi fra pasienter og behovet for in vitro ekspansjon av fibroblaster, noe som kan resultere i genmutasjoner 3 . Nylig ble PBCer funnet å være fordelaktige for omprogrammering 4 ; Dessuten ble de vanligvis brukt og rikelig lagret. Det er mulig at de kan omdirigere studiefokus fra huden. Men, så langt vi vet, er det få rapporter om PBC omprogrammering etterfulgt av differensiering i kondrocytter.

I den nåværende studien benytter vi PBC som en alternativ kilde ved å omprogrammere dem til iPSCs og deretter skille iPSCene inn i kondrogen linjen gjennom et pellets kultursystem for å etterligne kondrocytdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for generering av hiPSCs fra PBCs finner du i vår tidligere studie 5 . Studien ble godkjent av Institutional Review Board av vår institusjon.

1. Embryoid Body (EB) Formasjon

  1. Lag 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 15% knockout serum erstatning (KSR), 5% føtalt bovint serum (FBS), 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 55 μM 2-merkaptoetanol, 2 mM L -glutamin og 8 ng / ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF).
  2. Lag 50 ml EB formasjonsmedium: DMEM tilsatt 15% KSR, 5% FBS, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 55 μM 2-merkaptoetanol og 2 mM L-glutamin.
  3. Lag 50 ml basal dyrkningsmedium: DMEM tilsatt 20% FBS, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 55 μM 2-merkaptoetanol og 2 mM L-glutamin.
  4. Tilbered 10 ml dispase-løsning, 1 mg / ml i knockout DMEM.
  5. CultuRe hiPSCs på 60 mm vevskulturrater med føderceller ( dvs. et monolag av bestrålede musembryoniske fibroblastceller). Når cellene er 80-90% konfluente, demonterer cellene med dispase og passerer hiPSCs 1: 3 hver 4-5 dag. Plasser cellene inn i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
  6. Disseksér de utifferentiated hiPSC koloniene i mindre stykker (ca. 50-100 μm i diameter) ved hjelp av en brannstegnet glassnål når iPSCs er 80-90% sammenflyttende. Bruk vanligvis hiPSC kolonier i en 60 mm tallerken for å generere EB i en 100 mm petriskål.
    1. Kultur mindre enn 100 små biter av kolonier i en 100 mm, ikke-adherent petriskål som inneholder 10 ml EB formasjonsmedium. Plasser retter inn i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
  7. Bytt ca. 25% av det opprinnelige mediet med en lik mengde av det basale dyrkningsmediet hver 2. dag. Kant opp parabolen for å la EB'erne bosette seg. Fjern forsiktig 3 mlAv øvre medium og tilsett 4 ml frisk basalt dyrkningsmedium. Ikke forstyrr EBs.
    MERK: EB-ene er morfologisk preget av stykkene av kolonier, og tar et rundt utseende med glatte grenser under mikroskopet.
  8. Etter 10 dager med kulturen i den ikke-adherente petriskålen, belegge en ny 100 mm vevskulturskål med 4 ml 0,1% gelatin i 30 minutter ved 37 ° C før bruk.
  9. Overfør mediet pluss EBs fra en 100 mm, ikke-adherent petriskål til et 15 ml konisk rør. La EBs sedimentet i 4-5 min. Aspirer supernatanten forsiktig og la mindre enn 0,5 ml medium pluss EBs
  10. Frø mindre enn 100 EBs på en 100 mm, gelatine-belagt vevskulturskål med 10 ml basal dyrkningsmedium. Plasser retter inn i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator.

2. Cell Pellet Formasjon og Chondrocyt Differensiering

  1. Lag 10 ml 0,25% trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Lag 80 ml basAlkulturmedium: DMEM tilsatt 20% FBS, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 55 uM 2-merkaptoetanol og 2 mM L-glutamin.
  2. Lag 10 ml kondrogen differensieringsmedium: DMEM (høy glukose) supplert med 10% insulin-transferrin-selenløsning (ITS), 0,1 μM dexametason, 1 mM askorbinsyre, 1% natriumpyruvat og 10 ng / ml transformerende vekstfaktor- Beta 1 (TGF-β1).
  3. Oppdater mediet med 10 ml basal dyrkningsmedium etter 48 timer. Deretter oppfrisk mediet hver tredje dag med 10 ml basal dyrkningsmedium.
    MERK: Etter 10 dager i kultur, bør fibroblastiske celleutvokstene ha utvidet seg fra EBs.
    1. Coat 100 mm-fatene med 4 ml 0,1% gelatin i 30 minutter ved 37 ° C før bruk. Kast cellens supernatant og vask cellene med Dulbeccos fosfatbuffert saltløsning (DPBS) en gang.
    2. Fordel cellene med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 minutter og nøytraliser med 4 mL av basalkulturmedium.
  4. Dissociate cellene i enkle celler ved å pipettere opp og ned 5-10 ganger og passere dem gjennom et 70 μm nylonnett. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 xg i 5 minutter. Senk cellene på en ny 100 mm, gelatinekstrakt vevskulturskål med 10 ml basal dyrkningsmedium.
  5. Oppdater mediet med 10 ml basal dyrkningsmedium etter 48 timer. Deretter oppfrisk mediet hver tredje dag med 10 ml basal dyrkningsmedium.
    MERK: Cellene erverver en homogen, fibroblast-lignende morfologi.
  6. Når ~ 90-100% sammenløp er nådd ( dvs. ca. 5-7 dager), høst cellene med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 minutter. Nøytraliser med 4 ml basal dyrkningsmedium. Dissociate cellene i enkeltceller ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Bruk et hemocytometer til å telle celle nummeret.
    1. Plasser 3 x 10 5 celler i et 15 ml polypropylenrør. Sentrifuger ved 200 xgI 5 minutter ved romtemperatur (RT). Suspensere cellene i 1 ml kondrogen differensieringsmedium.
  7. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 3 minutter og opprettholder cellene i liten pelletform. Sette røret inn i 37 ° C og 5% CO2-inkubator i 21 dager. Ikke skru lokket på tett og la gassutvekslingen.
  8. Erstatt 3/4 av dyrkingsmediet hver tredje dag med fersk kondrogenisk differensieringsmedium.
    MERK: Etter 21 dager i kultur, skulle hiPSC-kondrogen pellets (hiPSC-Chon) ha dannet seg. Human mesenkymale stamceller (MSCs), som en positiv kontroll, blir også samlet og dyrket i det kondrogeniske differensieringsmediet i 21 dager for å danne kondrogenpellets (hMSC-Chon).

3. Analyse av kondrogenisk differensiering

  1. Tilbered 10 ml 10% nøytralbufret formalin.
  2. Tilbered 50 ml 0,1% alcianblue reagens og 50 ml 1% toluidinblått reagens.
  3. PrEpare 1 ml av de primære antistoffene: kaninpolyklonale antistoffer mot kollagen II (1:50) eller musmonoklonale antistoffer mot kollagen X (1:50). Forbered også anti-kanin eller mus sekundære antistoffer.
  4. Lag 1 ml papainoppløsning: 10 U / mL i PBS med 0,1 M natriumacetat, 2,4 mM EDTA og 5 mM L-cystein.
  5. Lag 100 ml dimetylmetylenblå (DMMB) fargestoffløsning: 100 μl 16 mg / l 1,9-dimetylmetylenblå, 40 mM glycin, 40 mM NaCl og 9,5 mM HC1; PH 3,0.
  6. Vurder chondrogen differensiering ved alcianblå og toluidinblå flekker av pelletseksjonene.
    1. Fest en hiPSC-Chon pellet eller hMSC-Chon pellet i 1 ml 10% nøytralbufret formalin i 24 timer.
    2. Overfør pelleten til 1 ml av 70% etanol i H2O dehydrere pellet med 1 ml av en gradert etanolserie (dvs. 25, 50, 75, 90, 95, 100, og 100%, 3 minutter hver).
    3. Forklar pelleten i 1 ml 100% xylen tre ganger. InfiltratE pelleten med paraffin i 1 time i en 65 ° C ovn. Legg pelleten i parafinblokker med en 7 x 7 x 5 mm 3 baseform, etter rutinemessige histologiske prosedyrer 6 .
    4. Lag tilstøtende seksjoner med mikrotome med en tykkelse på ca. 4 μm 7 . Fest delene på glassglassene.
    5. Tør lysbildene i 2 timer ved 60 ° C i en ovn. Deparaffiniser seksjonene i tre sykluser (3 min hver) ved å bruke 100% xylen.
    6. Bruke en avtagende alkoholserie for rehydrering (dvs. 100, 100, 95, 95, 70, 50, og 25% i H 2 O, 3 minutter hver), og deretter utføre en avsluttende skylling med avionisert vann i 5 min.
    7. Farg seksjonene med 0,1% alcianblue reagens eller 1% toluidinblå flekker i 4-5 timer og skyll dem deretter med destillert vann.
    8. Dehydreres med en gradert etanol-serie ( dvs. 25, 50, 75, 90, 95, 100 og 100%, 3 minutter hver) etterfulgt av tre påfølgende stEps for avklaring i 100% xylen. Monter lysbildene og visualiser dem under et mikroskop.
  7. Utfør immunhistokjemi.
    MERK: Ytterligere pelletseksjoner vurderes ytterligere ved immunhistokjemi.
    1. Etter deparaffinisering og rehydrering, ta lysbildene i koker i 1 mM EDTA, pH 8,0 (vanntett i vann kokt av autoklav). La dem sitte i 8 minutter ved en underkokingstemperatur og la lysbildene avkjøles ved RT.
    2. Skyll lysbildene med deionisert vann 3 ganger. Inkuber seksjonene i 3% H 2 O 2-løsning i metanol ved romtemperatur i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet.
    3. Skyll lysbildene med deionisert vann og fordyp dem i DPBS i 5 minutter. Påfør 50-100 μl egnet fortynnet (1:50) primært antistoff til delene på lysbildene og inkuber dem deretter i et fuktig kammer ved romtemperatur i 1 time.
    4. Vask lysbildene 3 ganger (5 min hver) med DPBS. Inkubere saMples med tilhørende sekundære antistoffer ( dvs. anti-kanin eller mus) i 15 min ved RT.
    5. Vask lysbildene 3 ganger (i 5 min hver) med DPBS. Utfør DAB-deteksjon under et mikroskop.
    6. Vask lysbildene med DPBS 3 ganger (2 min hver). Motvirke cellekjernene ved å nedsenke lysbildene i hematoksylin i 1-2 minutter. Dehydratiseres med en gradert etanol-serie (25, 50, 75, 90, 95, 100 og 100%, 3 minutter hver) etterfulgt av tre påfølgende trinn med klaring med xylen. Til slutt monterer du lysbildene og visualiserer dem under mikroskopet.
  8. Oppdag sGAG innhold.
    1. Fordøye kondrogenpellets i papainoppløsning ved 60 ° C i 2 timer.
    2. Bestem DNA-innholdet ved hjelp av dsDNA-analysesettet og fluorometersystemet. Mål sGAG-innholdet ved å blande det med DMMB-fargestoffløsning under måleabsorbans ved 525 nm 8 .
    3. Beregn konsentrasjonen av sGAG mot en standardkurve påHai kondroitinsulfat.
  9. Utfør sanntids-PCR-analysen av de kondrogeniske differensieringsmarkørene i hiPSC-Chon-pellets.
    1. Harvest 3-4 av de samme kondrogenpelletsene ved å tilsette 500 μl iskaldt ekstraksjonsreagens til ett rør. Vortex grundig. Inkuber prøven i 5 min ved RT.
    2. Tilsett 0,1 ml kloroform. Vortex prøven i 15 s og inkuber den ved RT i 3 min. Sentrifuger prøven i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Overfør den øvre vandige fasen (ca. 250 μl) i et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Tilsett 25 μl natriumacetat og 1 μl glykogen til prøven. Nedfell RNA ved å blande den med 250 ul isopropylalkohol. Bland godt. Inkuber prøven ved romtemperatur i 10 minutter.
    4. Sentrifuger i 10 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Fjern supernatanten helt. Vask RNA-pellet to ganger med 500 μl 75% etanol.
    5. Sentrifuge i 5 minVed 7.500 xg og 4 ° C. Fjern alle rester av etanol og lufttør RNA-pellet i 5-10 minutter. Oppløs RNA i 10 μl nukleasefritt vann.
    6. Konverter RNA til cDNA ved hjelp av et revers transkriptasesystem. Behandle cDNA-prøvene til sanntids-PCR ved hjelp av qPCR kit-masterblanding (2x) og et sanntids PCR-system 9 .
      MERK: Primersekvensene er:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H- 3-ACTIN- F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H- 3-ACTIN- R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9- F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kondrogen Differensiering av hiPSCs:

EB-formasjonsmedium og basal dyrkningsmedium ble anvendt for å differensiere hiPSCene i mesenkym-linjen. En multi-trinns kulturmetode ble brukt ( figur 1 ). Først ble hiPSCene spontant differensiert via EB-dannelse i 10 dager (D10; Figur 2A ). For det andre utbrøt cellene fra EB-ene i ytterligere 10 dager (D10 + 10). Under disse to trinnene tapte iPSCs gradvis sine opprinnelige morfologier og oppnådde spindelformede morfologier ( Figur 2B ), som deretter endret seg til en fibroblastisk form etter passasje. For det tredje ble celler utvidet i monolag etter subkultur ( figur 2C ). Resterende utifferentierte celler ble ekskludert under dette trinnet. Da ble cellene utvidet og forpliktet til fibroblastisk-lignende celler etter5-7 dager i monolagskultur (D10 + 10 + 7). For det fjerde, da hiPSC-fibroblastisk-lignende celler (hiPSC-F) nådde ca. 90% sammenføyning, ble de indusert til å differensiere seg til kondrocytter via en 3D-pelletkultur ( figur 2D ) 10 .

Karakterisering av hiPSC-Chon Pellets:

HiPSC-F ble dyrket i 15 ml polypropylenrør i pellet i 21 dager. Kondrogenceller kan samle in vitro og produsere en karakteristisk ekstracellulær matrise når det er i høy tetthetskultur. På slutten av kulturen kunne vi se et tett, brusklignende aggregat, hiPSC-Chon-pellet, som var opptil 2-3 mm langt og 3 mm tykt ( figur 2D ). Cellene var positive for alcianblått ( Figur 3A ) og toluidinblått ( Figur 3B ) farging, som indikerte suksessenUl kondrogen differensiering av hiPSC pellets. Immunohistokjemisk analyse for kollagen II ( Figur 3C ) og kollagen X ( Figur 3D ) viste videre at hiPSC-Chon-pellets hadde utviklet en kondrocytlignende fenotype. Negative kontroller av immunhistokjemi for kollagen II og kollagen X ble utført for bedre å bevise den positive fargingen (data ikke vist) 5 .

SGAG-analyse ble også utført etter kondrogen differensiering ( figur 3E ). SGAG innhold ble detektert i hiPSC-Chon pellets, hiPSC-F, EBs og de utifferentierte hiPSCs. SGAG innhold ble signifikant oppregulert i hiPSC-Chon pellets enn i de andre gruppene ( P <0,05). I den positive kontrollen av hMSC-Chon var også sGAG-innholdet betydelig oppregulert ( P <0,05) sammenlignet med hMSCs. Imidlertid sGAG innholdetMellom hMSC-pellets og hiPSC-Chon-pellets viste ingen forskjell ( P > 0,05).

Gene Expression of Chondrogen Differentiation Markers:

Genekspresjon av differensieringsmarkører for kondro-progenitor avstamning (SOX9 og COL2) og fulldifferensierte chondrocytter (aggrekan og COL10) ble anvendt for å karakterisere fenotypen av chondrogen pelletene (figur 4). I sammenligninger mellom hiPSCs, hiPSC-F, og hiPSC-Chon pellets, uttrykk for COL2, COL10, SOX9, og aggrecan var signifikant oppregulert i hiPSC-Chon enn i de andre gruppene (p <0,05). I den positive kontrollen av hMSC-Chon var uttrykket av disse markørene også betydelig oppregulert enn i hMSCs ( P <0,05). Imidlertid er genuttrykket mellom hMSC-pellets og hiPSC-Chon-pellets viste ingen forskjeller ( P > 0,05). I alt foreslår disse resultatene en vellykket kondrogene differensieringsprosess fra humane iPSCs.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over protokollen. En multi-trinns kulturmetode som brukes til å skille mellom humane iPSC'er i kondrocytter, inkludert : 1) spontan differensiering via EB-dannelse, 2) celleutvækst fra EBs, 3) monolagcellekultur etter subkultur, og 4) 3D-pelletkultur. Kondrocyt fenotypen er vurdert ved histologisk analyse, biokjemisk analyse og kondrogen genuttrykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

"Figur Figur 2: Generering av kondrocyter fra hiPSCs. ( A ) EB-dannelse på D10. Skalbjelke = 100 μm. ( B ) Celleutvokst fra EB på D10 + 10. Skalbjelke = 100 μm. ( C ) Monolagcellekultur på D10 + 10 + 7. Skalbjelke = 100 μm. ( D ) 3D-pelletkultur. Denne figuren er endret fra vår tidligere studie 5 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Karakterisering av hiPSC-Chon-pellets. ( A ) Alcianblå flekker og ( B ) toluidinblå flekker av glykosaminoglykaner og proteoglykaner. Skalbjelke = 100 μm. ( C og D ) Immunohistokjemi for kollagen II og kollagen X. Skalbjelke = 100 μm. ( E ) Biokjemisk karakterisering av hiPSC-Chon pellets versus hiPSCs, EBs og hiPSC-F sammenlignet med hMSC-Chon versus hMSCs. SGAG per DNA. Linjen representerer gjennomsnittet ± SEM. N = 3, * P <0,05. Denne figuren er endret fra vår tidligere studie 5 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Gene Expression Analysis. RT-qPCR genekspresjon analyse av chondrogen differensieringsmarkører (COL2, COL10, SOX9, og aggrecan) i hiPSC-Chon versus hiPSCs og HIPSCF sammenlignet med hMSC-Chon versus hMSCs. Linjen representerer gjennomsnittet ± SEM. N = 3, * P <0,05. Denne figuren er endret fra vår tidligere studie 5 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en protokoll for å generere kondrocyter fra PBCer via iPSCs. Fordi PBC er mer vanlige og mye brukt i det kliniske feltet, presenteres de som et potensielt alternativ for omprogrammering. I denne studien ble episomale vektorer (EV) benyttet til å omprogrammere PBCer til iPSCs, etter metoden etablert av Zhang et al. 11 . Denne integrasjonsfrie tilnærmingen innebærer ikke integrering av virusassosiert genotoksisitet, som antas å ha en bred effekt i klinisk felt 12 , 13 . Omprogrammeringseffektiviteten for å generere integrasjonsfrie iPSC'er fra blodceller i denne studien var fornøyd. Mer enn 30 iPSCer kan produseres fra 2 ml perifert blod. Derfor har PBC potensial til å være frøcellene som brukes til å generere iPSCs for brusk og andre kliniske anvendelser.

De viktigste trinnene av kondrogen differeNtiation fra hiPSCs inkluderte: EB-dannelse, celleutvækst fra EBs, monolagskultur og 3D-pelletkultur. Uifferensierte hiPSC kolonier blir dissekert i mindre stykker ved hjelp av en brann-trukket glassnål. Den mekaniske metoden, selv om den er mer teknisk, er bedre enn enzymatisk fordøyelse (som f.eks. Dispase eller kollagenase) på grunn av redusert skade og den spesifikke størrelsen (50-100 μm i diameter) ved oppkjøpet. Videre kan mekanisk fordøyelse manuelt disponere materen celler, som vil undertrykke hiPSC differensiering. HiPSCs differensierer spontant for å danne EBs, som er karakterisert som de tredimensjonale, multicellulære aggregatene med glatte grenser. Flere EB'er kan klynge sammen for å danne uregelmessige former. For å opprettholde EB'ene under gode forhold dyrkes mindre enn 100 EB'er i en 100 mm, ikke-adherent petriskål, med 10 ml EB formasjonsmedium. Omtrent 50 EB i en 100 mm tallerken antas å være den beste konsentrasjonen. EBs blir så frøet på Til 10 cm, gelatinebelagte retter med basisk kulturmedium. Tettheten av fordelingen av EB er viktig for den tilstrekkelige utveksten av EB. Mindre enn 100 EB er dyrket på en 100 mm tallerken. Innen 10 dager etter kulturen, blir fibroblastiske celler gradvis utvokst og utvidet fra EBs. Monolagstrinnet utføres for å utelukke gjenværende, utifferentierte celler som er tilstede i EB-ene, samt å ekspandere celler begått til mesenkymalelinjen. 0,5-1 x 10 6 celler blir sådd ut i en 100 mm skål for monolagscellekultur. Ekspresjonen av celleoverflate markører på hiPSC-F ble analysert ved hjelp av flyt-cytometrisk analyse i vår tidligere studie 5 . Resultatene viste at majoriteten av hiPSC-F uttrykte CD73 (81,81 ± 2,05%) og CD105 (endoglin, 81,90 ± 1,61%), som er kjent for å være de positive humane mesenkymmarkører. Videre har seks forskjellige iPSCs og en human embryonale stamcelle (ESC) blitt brukt til å reprodusere disse metodene.

Ve_content "> Den induserte kronondrogen differensiering av pluripotente celler er også en kompleks nøkkelprosess. I lys av dette ble klassisk kondrogenisk medium benyttet for induksjon av kondrogenese fra hiPSCs. TGF-beta1 og dexametason er supplert i pellets kulturmedium. Har blitt vist å ha betydelig innflytelse på kondrogen potensielle evner 14. En annen forskjell fra andre protokoller var konsentrasjonen på 10% ITS, noe som er mye høyere enn den typisk rapporterte 1% ITS 15 , 16. 1% ITS pluss 10% FBS forbedret Bruskdannelse i andre metoder 17 , 18. ITS som en serum-substituent kan fremme kondrocytproliferasjon og dannelse og beholde de kondrogeniske fenotyper. For å erstatte dyrekomponenter av FBS, oppgradert vi konsentrasjonen av ITS til 10%, hvilket har blitt bevist Å effektivt promovereTe kondrocyt differensiering 7 .

En cellekultur med høy tetthet er en annen viktig faktor for kondrogen differensiering. Det er mange andre cellekulturmetoder som kan brukes til å indusere kondrogen differensiering, for eksempel mikromasskultur, samkultur med andre celler, biomaterialebasert kultur og genetisk manipulasjon 1 , 19 , 15 . 3D-pelletkulturen i vår studie, som resulterer i høy celletetthet og høy celle-celleinteraksjon, er lettere å utføre uten andre celler eller materialer. Siden det utføres i 15 ml sentrifugerør, er en begrensning at den bare kan brukes i en liten skala for kondrogenisk differensieringsanalyse. 96-brønnsplater med rundbunn kan imidlertid brukes som et lovende alternativ 7 . Derfor kan annen forbedring av kultimetodene fremme effektiviteten av kondrogenDifferensiering in vitro . I vår studie ble den kondrogeniske induksjonen i så lenge som 21 dager gjort under serumfri og xenofri tilstand, hvor alle animalske relaterte komponenter ble fjernet. Derfor er prosedyren i studien tilpassbar for fremtidige kliniske applikasjoner.

Det antas at autologe stamceller ville være det ideelle valget for brusk reparasjon, da de ikke bare kan redusere avstøt, men også oppnå vevregenerering ved å utnytte den naturlige forlengelsen av embryonal utvikling 20 , 21 . Imidlertid ble de funnet å ha begrenset proliferativ potensial in vitro 22 . Derfor kan en integrasjonsfri metode for å generere kondrocyter fra PBC via iPSCs være en mer lovende tilnærming til bruskvevsteknikk. Med vår metode kan 2 ml blod være nok til å indusere pasient-spesifikke kondrocytter som trengs for brusk defektts. Videre brukte vi også hMSCs som en positiv kontroll for å sammenligne med celler differensiert fra iPSCs, noe som antydet at iPSCs har gode kondondensive differensieringspotensialer.

Som konklusjon viste denne studien at PBC kan brukes som kandidater for kondrocytegenerasjon. Dette kan ytterligere reflektere en fremtidig retning for å generere frøceller for bruskreparasjon i en pasientspesifikk og kostnadseffektiv tilnærming til regenerativ medisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Xiaobin Zhang for sitt plasmid. Vi takker også Shaorong Gao og Qianfei Wang for deres hyggelige hjelp under forsøket. Denne studien støttes av National Natural Science Foundation of China (No.81101346, 81271963, 81100331), Beijing 215 høyt nivå talent prosjektet (No.2014-3-025) og Beijing Chao-Yang Hospital Fund (Nei . CYXX-2017-01) og Youth Innovation Promotion Association av kinesisk vitenskapsakademi (YL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen TMS-002-C An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
2-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 125 induserte pluripotente stamceller perifert blod differensiering embryoidlegeme fibroblastiske celler kondrocyt
Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T.… More

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter