Summary

Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

Les jonctions inter-cellulaires sont indispensables pour les fonctions et le développement de la glande mammaire. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour l'étude des interactions protéines-protéines (IPP) et la co-localisation à l'aide de glandes mammaires murines. Ces techniques permettent d'étudier la dynamique de l'association physique entre les jonctions intercellulaires à différents stades de développement.

Abstract

Les interactions cellule-cellule jouent un rôle central dans la préservation de l'intégrité tissulaire et la barrière entre les différents compartiments de la glande mammaire. Ces interactions sont fournies par des protéines de jonction qui forment des liens entre des cellules adjacentes. La délocalisation des protéines jonctionnelles et la réduction des associations physiques avec leurs partenaires de liaison peuvent entraîner une perte de fonction et, par conséquent, une dysfonction organique. Ainsi, l'identification de la localisation des protéines et des interactions protéines-protéines (IPP) dans les tissus normaux et liés à la maladie est essentielle pour trouver de nouvelles preuves et des mécanismes conduisant à la progression des maladies ou des altérations du statut de développement. Ce manuscrit présente une méthode en deux étapes pour évaluer les IPP dans les glandes mammaires murines. Dans la section de protocole 1, on décrit un procédé pour effectuer une co-immunofluorescence (co-IF) en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt, suivi d'anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes. Bien que co-IF tousPour la démonstration de la proximité des protéines, il permet d'étudier leurs interactions physiques. Par conséquent, un protocole détaillé pour la co-immunoprécipitation (co-IP) est fourni dans la section de protocole 2. Cette méthode est utilisée pour déterminer les interactions physiques entre les protéines, sans confirmer si ces interactions sont directes ou indirectes. Au cours des dernières années, les techniques de co-IF et co-IP ont démontré que certaines composantes des jonctions intercellulaires co-localisent et interagissent ensemble, créant des liens de jonction dépendant de la scène qui varient au cours du développement de la glande mammaire.

Introduction

La croissance et le développement des glande mammaire surviennent principalement après la naissance. Cet organe se remodèle constamment tout au long de la vie reproductive d'un mammifère 1 . L'épithélium de la glande mammaire adulte est constitué d'une couche interne de cellules épithéliales luminescentes et d'une couche externe de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, entourée d'une membrane basale 2 . Pour une bonne évaluation de la structure et du développement des glandes mammaires, le lecteur peut se référer à Sternlicht 1 . Les interactions cellule-cellule via l'intervalle (GJ), les contraintes (TJ) et les adhérences (AJ) sont nécessaires pour le développement normal et le fonctionnement de la glande 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les principaux composants de ces jonctions dans la glande mammaire murine sont Cx26, Cx30, Cx32 et Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 et -7 etZO-1 (TJ); Et E-cadhérine, P-cadhérine et β-caténine (AJ) 7 , 8 . Les niveaux d'expression de ces différentes protéines de jonction varient d'une manière dépendant de la phase pendant le développement de la glande mammaire, suggérant des besoins différentiels d'interaction cellule-cellule 9 . GJ, TJ et AJ sont liés structurellement et fonctionnellement et attachent d'autres protéines structurales ou réglementaires aux sites voisins des cellules adjacentes, créant ainsi un lien de jonction 10 . La composition du lien de jonction peut influer sur le pontage avec le cytosquelette sous-jacent, ainsi que sur la perméabilité et la stabilité du nexus et peut influencer la fonction de la glande 8 , 9 , 10 , 11 . Les composants des jonctions intercellulaires résidant dans les nexus de jonction ou interagissent les uns avec les autres à la différenceDes stades de développement importants du développement de la glande mammaire ont été analysés récemment en utilisant une co-immunofluorescence (co-IF) et une co-immunoprécipitation (co-IP) 9 . Bien que d'autres techniques permettent d'évaluer l'association fonctionnelle entre les protéines, ces méthodes ne sont pas présentées dans ce manuscrit.

Comme les protéines fonctionnent simplement pour fonctionner, l'étude des interactions protéine-protéine (IPP), telles que les transductions de signaux et les cascades biochimiques, est essentielle pour de nombreux chercheurs et peut fournir des informations importantes sur la fonction des protéines. La co-IF et l'analyse microscopique permettent d'évaluer quelques protéines qui partagent le même espace sous-cellulaire. Cependant, le nombre de cibles est limité par les anticorps, qui doivent être élevés chez différents animaux et par l'accès à un microscope confocal équipé de différents lasers à longueurs d'onde et un détecteur spectral pour le multiplexage. Co-IP confirme ou révèle des interactions physiques à haute affinité entreDeux protéines ou plus résidant dans un complexe protéique. Malgré le développement de nouvelles techniques, telles que le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) 12 et le test de ligature de proximité (PLA) 13 , qui peuvent simultanément détecter la localisation et les interactions des protéines, la co-IP reste une technique appropriée et abordable pour étudier les interactions entre Protéines endogènes.

La méthode étape par étape décrite dans ce manuscrit facilitera l'étude de la localisation des protéines et des IPP et soulignera les pièges à éviter lors de l'étude des PPI endogènes dans les glandes mammaires. La méthodologie commence par la présentation des différentes procédures de conservation des tissus requis pour chaque technique. La partie 1 présente comment étudier la co-localisation des protéines en trois étapes: i) la section des glandes mammaires, ii) l'étiquetage double ou triple de différentes protéines utilisant la technique co-IF, et iii) l'imagerie deLocalisation des protéines. La partie 2 montre comment précipiter une protéine endogène et identifier ses protéines qui interagissent en trois étapes: i) préparation de lysat, ii) immunoprécipitation indirecte de protéines, et iii) identification de partenaire de liaison par SDS-PAGE et Western Blot. Chaque étape de ce protocole est optimisée pour les tissus de glandes mammaires des rongeurs et génère des résultats de haute qualité, spécifiques et reproductibles. Ce protocole peut également être utilisé comme point de départ pour les études de PPI dans d'autres tissus ou lignées cellulaires.

Protocol

Tous les protocoles d'animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité universitaire de soins animaux (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada). 1. Identification de la co-localisation des protéines Du tissu aux glissières microscopiques REMARQUE: Les tissus et les sections doivent être manipulés sur de la glace carbonique. Accepter les glandes mammaires d'un animal (pour une description complète de cette pr…

Representative Results

Pour déterminer si les composants GJ, AJ et TJ peuvent interagir ensemble dans la glande mammaire, les analyses de co-IF ont d'abord été effectuées. Cx26, une protéine GJ et une β-Catenine, une protéine AJ, ont été sondées avec des anticorps spécifiques et ont révélé des anticorps à base de souris fluorés-647 (vert, pseudocolor) et chèvre-568 (rouge) respectivement ( figure 1B et C ) . Les données ont montré qu'ils co-localisen…

Discussion

Les interactions cellule-cellule par des jonctions sont nécessaires pour la bonne fonction et le développement de nombreux organes, comme la glande mammaire. Des études ont montré que les protéines de jonction peuvent réguler la fonction et la stabilité l'une de l'autre et activer la transduction du signal en s'attachant mutuellement à la membrane 10 de la cellule. Les protocoles présentés dans le manuscrit actuel ont fourni des résultats intéressants sur l'expression,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La PI est financée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (NSERC n ° 418233-2012); Un Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS), une bourse de carrière de la Fondation du cancer du sein du Québec et une subvention Leader Founds de la subvention de la Fondation canadienne pour l'innovation. ED a reçu une bourse de la Fondation universitaire Armand-Frappier.

Materials

Mice strain and stage  St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10X (stock) 1)      Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.4 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
TBS 10X (stock) 1)      Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.5 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
Name Company Catalog Number Comments
Part 1-Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada  BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies  Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  Mentioned in Column D β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Name Company Catalog Number Comments
Part 2-Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0  1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 
2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml).
3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. 
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada Mentioned in coulmn D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl 
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)  1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin3  (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061  Clarity Western ECL Blotting Substrate 
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

References

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Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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