Summary

Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

Le giunzioni intercellulari sono requisiti per le funzioni specifiche e lo sviluppo delle ghiandole mammarie. Questo manuale fornisce un protocollo dettagliato per lo studio delle interazioni proteico-proteiche (PPIs) e la co-localizzazione usando le ghiandole mammarie murine. Queste tecniche consentono l'analisi della dinamica dell'associazione fisica tra giunzioni intercellulari a differenti fasi di sviluppo.

Abstract

Le interazioni delle cellule cellulari svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'integrità dei tessuti e la barriera tra i diversi compartimenti della ghiandola mammaria. Queste interazioni sono fornite da proteine ​​junctional che formano nexus tra cellule adiacenti. La misloalizzazione della proteina giunzionale e la riduzione delle associazioni fisiche con i loro partner di legame possono provocare la perdita di funzione e, di conseguenza, la disfunzione dell'organismo. Quindi, identificare la localizzazione proteica e le interazioni proteine-proteine ​​(PPI) nei tessuti normali e legati alla malattia è essenziale per trovare nuove evidenze e meccanismi che conducano alla progressione di malattie o alterazioni nello stato di sviluppo. Questo manuale presenta un metodo in due fasi per valutare i PPI in ghiandole mammarie murine. Nella sezione 1 del protocollo, è descritto un metodo per eseguire co-immunofluorescenza (co-IF) usando anticorpi sollevati contro le proteine ​​di interesse, seguite da anticorpi secondari etichettati con fluorochromi. Anche se co-IF tuttiPer la dimostrazione della vicinanza delle proteine, rende possibile studiare le loro interazioni fisiche. Di conseguenza, un protocollo dettagliato per la co-immunoprecipitazione (co-IP) è fornito nella sezione del protocollo 2. Questo metodo è utilizzato per determinare le interazioni fisiche tra le proteine, senza confermare se queste interazioni sono dirette o indirette. Negli ultimi anni, le tecniche co-IF e co-IP hanno dimostrato che alcuni componenti delle giunzioni intercellulari co-localizzano e interagiscono insieme, creando nexus giunzionali dipendenti da fase che variano durante lo sviluppo della ghiandola mammaria.

Introduction

La crescita e lo sviluppo delle ghiandole mammarie si verificano principalmente dopo la nascita. Questo organo si rinnova costantemente per tutta la vita riproduttiva di un mammifero1. L'epitelio adulte della ghiandola mammaria è composto da uno strato interno di cellule epiteliali luminali e da uno strato esterno di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteleali, circondate da una membrana basale 2 . Per una buona revisione della struttura e dello sviluppo delle ghiandole mammarie, il lettore può fare riferimento a Sternlicht 1 . Le interazioni delle cellule cellulari attraverso il divario (GJ), i giunti stretti (TJ) e gli aderenti (AJ) sono necessari per lo sviluppo normale e la funzione della ghiandola 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Le principali componenti di queste giunzioni nella ghiandola mammaria murina sono Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-cadherina, P-cadherina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . I livelli di espressione di queste diverse proteine ​​junzionali variano in modo dipendente dalla fase durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, suggerendo requisiti di interazione cellulare-cellule differenziali 9 . GJ, TJ e AJ sono collegati strutturalmente e funzionalmente e collegano altre proteine ​​strutturali o regolamentari ai siti vicini di cellule adiacenti, creando così un collegamento giunzionale 10 . La composizione del nesso giunzionale può influenzare il ponte con il citoscheletro sottostante, nonché la permeabilità e la stabilità del nesso e può quindi influenzare la funzione della ghiandola 8 , 9 , 10 , 11 . I componenti delle giunzioni intercellulari che risiedono in nexus giunzionali o interagiscono tra di loro a diffLe fasi di sviluppo progressive dello sviluppo delle ghiandole mammarie sono state recentemente analizzate utilizzando co-immunofluorescenza (co-IF) e co-immunoprecipitazione (co-IP) 9 . Mentre altre tecniche consentono la valutazione dell'associazione funzionale tra proteine, questi metodi non sono presentati in questo manoscritto.

Poiché le proteine ​​agiscono solo per funzionare, studiare le interazioni proteine-proteine ​​(PPI), quali trasduzione di segnali e cascate biochimiche, è essenziale per molti ricercatori e può fornire informazioni significative sulla funzione delle proteine. Co-IF e analisi microscopica aiutano a valutare alcune proteine ​​che condividono lo stesso spazio subcellulare. Tuttavia, il numero degli obiettivi è limitato dagli anticorpi che devono essere elevati in diversi animali e dall'accesso a un microscopio confocale dotato di diversi laser a lunghezza d'onda e di un rivelatore spettrale per il multiplexing. Co-IP conferma o rivela interazioni fisiche di elevata affinità tra i dueDue o più proteine ​​che risiedono all'interno di un complesso proteico. Nonostante lo sviluppo di nuove tecniche, come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) 12 e il test di legatura di prossimità (PLA) 13 , che possono contemporaneamente rilevare la localizzazione e le interazioni delle proteine, il co-IP rimane una tecnica appropriata e conveniente per studiare le interazioni tra Proteine ​​endogene.

Il metodo passo-passo descritto in questo manoscritto agevolerà lo studio della localizzazione proteica e dei PPI e segna le insidie ​​per evitare quando studia PPI endogeni nelle ghiandole mammarie. La metodologia inizia con la presentazione delle diverse procedure di conservazione dei tessuti necessari per ogni tecnica. La Parte 1 illustra come studiare la co-localizzazione proteica in tre fasi: i) la sezione delle ghiandole mammarie, ii) la doppia o tripla etichettatura di diverse proteine ​​usando la tecnica co-IF, e iii) l'imaging diLocalizzazione proteica. La seconda parte mostra come precipitare una proteina endogena e identificare le sue proteine ​​interagenti in tre fasi: i) preparazione di lysate, ii) immunoprecipitazione indiretta di proteine ​​e iii) identificazione del partner di legame mediante SDS-PAGE e Western blot. Ogni fase di questo protocollo è ottimizzata per i tessuti delle ghiandole mammarie di roditore e genera risultati di alta qualità, specifici e riproducibili. Questo protocollo può anche essere utilizzato come punto di partenza per gli studi PPI in altri tessuti o linee cellulari.

Protocol

Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato universitario di cura degli animali (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada). 1. Identificazione della co-localizzazione della proteina Dal tessuto alle diapositive microscopiche NOTA: I tessuti e le sezioni devono essere trattati su ghiaccio secco. Incisa le ghiandole mammarie da un animale (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferime…

Representative Results

Per determinare se i componenti GJ, AJ e TJ possono interagire insieme nella ghiandola mammaria, sono stati eseguiti primi test di co-IF. Cx26, una proteina GJ e una beta-Catenina, una proteina AJ, sono stati saggiati con anticorpi specifici e sono stati rivelati rispettivamente con gli anticorpi coniugati con fluoroforo (verde, pseudocolore) e capra-568 (rosso) ( figura 1B e C ) . I dati hanno dimostrato che essi co-localizzano alla membrana cellulare d…

Discussion

Le interazioni cellulare attraverso le giunzioni sono necessarie per la corretta funzione e lo sviluppo di molti organi, come la ghiandola mammaria. Gli studi hanno dimostrato che le proteine ​​giunzionali possono regolare la funzione e la stabilità dell'altro e attivare la trasduzione del segnale legandosi tra loro alla membrana cellulare 10 . I protocolli presentati nel manoscritto attuale hanno fornito interessanti risultati sull'espressione, la localizzazione e l'interazione …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IP è finanziato da una sovvenzione scientifica di scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC # 418233-2012); Un Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), un premio per la carriera di Cancer Breast Cancer di Quebec, e una sovvenzione di Leader Found della sovvenzione Canadian Foundation for Innovation. ED ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondation universitaire Armand-Frappier.

Materials

Mice strain and stage  St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10X (stock) 1)      Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.4 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
TBS 10X (stock) 1)      Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.5 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
Name Company Catalog Number Comments
Part 1-Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada  BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies  Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  Mentioned in Column D β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Name Company Catalog Number Comments
Part 2-Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0  1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 
2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml).
3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. 
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada Mentioned in coulmn D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl 
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)  1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin3  (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061  Clarity Western ECL Blotting Substrate 
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

References

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Cite This Article
Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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