Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri
Summary
Detta protokoll tillhandahåller en analys av makrofag-subpopulationerna i det centrala nervsystemet hos vuxna mus genom flödescytometri och är till hjälp för studier av multipla markörer som uttrycks av dessa celler.
Abstract
Många studier har visat rollen som immunceller, i synnerhet makrofager, i centrala nervsystemet (CNS) patologier. Det finns två huvudsakliga makrofagpopulationer i CNS: (i) microgliaen, som är de centrala makrofagerna i CNS och härrör från äggstocksförfödare under embryogenes, och (ii) de monocyt-härledda makrofagerna (MDM) som kan infiltrera CNS under sjukdomen och härrör från benmärgsförstorare. Rollerna hos varje makrofag-subpopulation varierar beroende på den patologi som studeras. Vidare finns det ingen överens om de histologiska markörerna eller de särskiljande kriterierna som används för dessa makrofagpopulationer. Analysen av expressionsprofilerna för CD11b- och CD45-markörerna med flödescytometri tillåter oss emellertid att särskilja microglia (CD11b + CD45 med ) från MDM (CD11b + CD45 hög ). I detta protokoll visar vi att densitetsgradientcentrifugeringenOch flödescytometrianalysen kan användas för att karakterisera dessa CNS-makrofag-subpopuleringar och för att studera flera intressemarkörer uttryckta av dessa celler som vi nyligen publicerade. Således kan denna teknik öka vår förståelse av makrofagens roll i musmodeller av neurologiska sjukdomar och kan också användas för att utvärdera läkemedelseffekter på dessa celler.
Introduction
Mikroglia är de parenkymala vävnadsboende makrofagerna i centrala nervsystemet (CNS). De spelar två viktiga funktionella roller: immunförsvar och underhåll av CNS homeostas. I motsats till MDM, som förnyas kontinuerligt från de hematopoietiska stamcellerna i benmärgen, skiljer sig mikroglcellerna från primitiva hematopoietiska stamceller som härrör från äggulaen (YS) som koloniserar hjärnan under embryonisk utveckling 1 , 2 , 3 . I gnagare spelar transkriptionsfaktorn Myb en avgörande roll i utvecklingen av alla benmärgsmessiga härledda monocyter och makrofager, men för YS-härledd mikroglia är denna faktor dispensibel och differentiering är fortfarande beroende av transkriptionsfaktorn PU.1 4 .
I det friska CNS är microglia dynamiska celler som ständigt provar sin miljö, scaNning och mätning för invaderande patogener eller vävnadsskada 5 . Detekteringen av sådana signaler initierar en väg för att lösa skadan. Mikroglia växlar snabbt från en ramifierad morfologi till en amoeboid, som följs av fagocytos och frisättning av olika mediatorer, såsom pro- eller antiinflammatoriska cytokiner. Således, beroende på deras mikromiljö, kan aktiverat mikroglia förvärva ett spektrum av olika primära tillstånd 6 .
Mikroglia påverkar djupt utvecklingen och utvecklingen av många neurologiska störningar. I gnagermodellerna av Alzheimers sjukdom (AD) 7 , Amyotrofisk lateralskleros (ALS) 8 , Multipelskleros (MS) 9 eller Parkinsons sjukdom (PD) 10 , visas mikrogliana att spela en dubbel roll, antingen inducerande skadlig neurotoxicitet eller agerande På ett neuroprotektivt sätt, vilket är beroende oN den specifika sjukdomen, sjukdomsstadiet och huruvida sjukdomen påverkades av det systemiska immunfacket 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De flesta av de CNS-lesioner som observerats i ovan nämnda sjukdomar innehåller en heterogen population av myeloidceller, innefattande inte bara parenkymal microglia, men också perivaskulära och meningeal-makrofager, såväl som CNS-infiltrerande MDM. Dessa celltyper kan differentiellt bidra till de patofysiologiska mekanismerna relaterade till skada och reparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nuvarande utmaningen för utredare som studerar dessa sjukdomsmodeller är att fastställa huruvida de perifera monocyterna och makrofagerna infiltrerar CNS och i så fall distanseraInguish den residenta microglia från dessa celler. Faktum är att mikroglcellerna är mycket plastiska; När de aktiveras, uttrycker mikrogliaen igen markörer som vanligtvis uttrycks av perifera monocyter och makrofager. Frågan är därför beroende av att identifiera markörer som kan skilja den residenta mikroglia från de infiltrerande monocyterna och makrofagerna.
Diskrimineringen av dessa populationer på hjärnskivor genom immunohistologiska tillämpningar är begränsad på grund av bristen på specifika antikroppar. Flödescytometrianalys är emellertid en effektiv teknik för att bedöma uttrycket av flera markörer och att skilja cellpopulationer (t ex lymfocyter, makrofager / MDM CD11b + CD45- höga och microglia CD11b + CD45 med ) liksom celldelpopulationer 16 , 17 , 18 . Detta protokoll beskriver procedurer för att isoleraMononukleära celler från mus-CNS i neurologiska sjukdomsmodeller genom användning av en optimerad enzymatisk vävnadsdissociation och en densitetsgradientcentrifugering; Såväl som en metod för differentiering av mikroglia- och MDM-populationerna i CNS genom att använda flödescytometri.
Ett annat tillvägagångssätt är att eliminera myelin och rena cellerna genom användning av magnetiska pärlor konjugerade till specifika antikroppar 19 , 20 , 21 . Myelinavlägsnande med användning av anti-myelinmagnetiska pärlor är dyrare och påverkar livskraften och utbytet av isolerade celler 22 . Detta steg och följande immunomagnetiska separering av mikrogliaen begränsar ytterligare studier av specifika immuncellpopulationer 21 , 22 .
Dessa förfaranden ger ett enkelt sätt att studera makrofagens subpopulationer vid sjukdomsutveckling ochFör att bestämma läkemedelseffekterna eller genmodifieringarna på makrofagfenotyper och aktiveringstillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har visats att microglia och MDM har olika funktioner och fenotyper i CNS, och således är identifiering och analys av dessa makrofagpopulationer avgörande för att bättre förstå neurologiska sjukdomar 9 , 18 , 25 . Flödescytometrianalys med användning av två markörer (CD11b och CD45) möjliggör distinktionen mellan varje subpopulation ( Figur 3C ). Denna strategi validerades tidigare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Agence National pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer och Bpifrance. Vårt laboratorium stöds också av Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie och programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vill tacka hjälpen från CELIS-cellkulturens kärnanläggning.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
