Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması Published: June 3, 2017 doi: 10.3791/55836
Automatic Translation
1, 2
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

Summary

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

Abstract

Genom çapında protein-DNA etkileşim haritalama, gen regülasyonunu, kromatin yeniden şekillendirmeyi ve diğer kromatin yerleşik süreçleri anlamak için kritiktir. Genom biyolojisine birçok değerli bilgi kazandırmak için kromatin immüno çökeltme ve ardından yüksek verimli sekanslama (X-ChIP-seq) ile yapılan formaldehit çapraz bağlama işlemi kullanılmıştır. Bununla birlikte, X-ChIP-seq'in çapraz bağlama ve sonikasyon ile bağlantılı önemli sınırlamalar vardır. Yerli ChIP, bu dezavantajları çapraz bağlama yapılmadan çıkarmaktan kaçınır, ancak sıklıkla kromatin bağlı proteinlerin iyileşmesinde zayıflamaya neden olur. Buna ek olarak, tüm ChIP tabanlı yöntemler antikor kalitesi hususlarına tabidir. Protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için ilgi konusu bir proteinin bir DNA modifiye eden enzime kaynaştırılmasını içeren enzimatik yöntemler protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için de kullanılmıştır. Son zamanlarda ChEC-seq olarak yüksek verimli sekanslama ile böyle bir metot olan kromatin endojen bölünmeyi (ChEC) kombine ettik. ChEC-seq, bir kromatin-assokun kaynaşmasına dayanıyorCanlı hücrelerde kalsiyum varlığında hedeflenmiş DNA bölünmesi üretmek için mikrokakal nükleaz (MNase) ile ilgilidir. ChEC-seq, bağışıklık çökmesine dayalı değildir ve çapraz bağlama, sonikasyon, kromatin çözünürlüğü ve antikor kalitesi ile potansiyel endişeleri ortadan kaldırırken, minimum arka plan sinyali ile yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar. ChEC-seq'in ChIP için güçlü bir muadil olacağını ve ChIP-seq bulgularını doğrulamak ve genomik düzenlemeye yeni bakış açıları keşfetmek için bağımsız bir araç sağlayacağını düşünüyoruz.

Introduction

Transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler), kromatin yeniden biçimlendiricilerin ve diğer kromatin ile ilişkili düzenleyici faktörlerin bağlanma yerlerinin haritalandırılması, tüm kromatin esaslı işlemleri anlamak için anahtardır. Kromatin immüno çökeltme ve yüksek verimli sekanslama (ChIP-seq) yaklaşımları, genom biyolojisine ilişkin birçok önemli bilgiler edinmek için kullanılmış olsa da, önemli sınırlamalara sahiptir. Kısa süre önce, bu dezavantajları ortadan kaldırmak için kromatin endojen bölünme ve yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) 1 olarak adlandırılan alternatif bir yöntem sunduk.

ChIP-seq sıklıkla protein-DNA etkileşimlerini korumak için bir başlangıç ​​formaldehid çapraz bağlama basamağı (X-ChIP-seq) ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan bir dizi çalışma, X-ChIP-seq'in geçici veya nonspesifik protein-DNA etkileşimleri 2 , 3 , 4 , 5 <6 , 7 , 8 , yanlış pozitif bağlanma yerlerine neden olur. Ek olarak, X-ChIP-seq deneylerinde kromatin parçalanmak için yaygın olarak kullanılan sonikasyon, açık kromatin bölgelerini keser ve bu bölgelerdeki fragmanların önyargılı olarak geri kazanılmasına neden olur 9 , 10 . Sonikasyon ayrıca, bir eksonukleç sindirim adımı eklenmesiyle 11 , 12 çözünürlüğünü büyük ölçüde artırabilecek olsa da, sonuç olarak bağlanma yeri çözünürlüğünü sınırlayan bir parçacık uzunluğunun heterojen bir karışımını üretir. Afinite ile saflaştırılmış doğal olarak izole edilmiş kromatin (ORGANIC) 13 gen alanlarının işgal edilmiş bölgeleri gibi yerli ChIP yöntemleri, formaldehit çapraz bağlanma ve sonikasyon ile ilişkili potansiyel önyargıları hafifleterek mikrokakal nükleazla (MNase) çapraz bağlama ve fragman kromatin kullanmazlar. Ancak,Doğal kromatin ekstraksiyonu için gerekli nispeten ılımlı koşullardaki birçok kromatin bağlı proteininin çözünürlüğü zayıf olup, potansiyel olarak dinamik aralık ve / veya yanlış negatiflerin azalmasına neden olur14.

ChIP-seq'ün çeşitli yinelemeleri, genom çapında protein-DNA etkileşimlerinin haritalanması için en çok kullanılan yöntem olmasına rağmen, ilgilenilen proteinlerin çeşitli DNA modifıye eden enzimlere kaynaşmasına dayanan çeşitli haritalama teknikleri de uygulanmıştır. Bu tür bir yaklaşım DNA'nın adenine metiltransferaz tanımlaması (DamID) 15'dir, burada ilgilenilen bir kromatin-bağlayıcı protein Genetik olarak Baraja kaynaştırılır ve bu füzyon, hücrelerde veya hayvanlarda eksprese edilir ve böylece GATC dizilerinin protein için bağlanma bölgelerine yakın metillenmesine yol açar. DamID, immüno çökeltiye dayanmadığı ve dolayısıyla çapraz bağlanma, antikorlar veya kromatin çözünürlüğünden kaçınması bakımından avantajlıdır. Aynı zamanda in vivo da gerçekleştirilir. ancak, DamID'in çözünürlüğü kilobaz ölçeği ile sınırlıdır ve Baraj füzyon proteininin metilasyon aktivitesi yapıcıdır. Enzimatik füzyona dayanan ikinci bir yöntem Call-Card-seq 16'dır ; bu, bir transpozaza bir ilgi faktörünün füzyonunu uygular ve transposonların sahaya özgü entegrasyonunu yönlendirir. DamID gibi, Calling Card-seq, immüno çöktürmeye dayalı değildir ve dolayısıyla artan çözünürlüğün ilave yararı ile benzer avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, Calling Card-seq, transpozazların sekans yanlılıkları ile sınırlanabilir ve transposon ekleme bölgelerine yakın kısıtlama alanlarının varlığına da bağımlıdır.

Laemmli laboratuvarında geliştirilen üçüncü bir enzimatik füzyon yöntemi, kromatin endojen bölünme (ChEC) 17 dir . ChEC'de, bir kromatin ile ilişkili protein ve MNase arasındaki bir kaynaşma, hücrelerde eksprese edilir ve MNase'i aktive etmek için kalsiyum ilave edildikten sonra, DNA, etiketlenen bağlanma yerlerine proksimal olarak bölünürFaktörü ( Şekil 1 ). Güney blot ile bağlantılı olarak, ChEC maya 17 , 18'de bir dizi bireysel lokusta kromatin yapısını ve protein bağlanmasını karakterize etmek için kullanılmıştır ve nükleer gözenek bileşenlerinin maya ile etkileşimini araştırmak için düşük çözünürlüklü mikro-dizi analizi ile birleştirilmiştir Genom 19 . ChEC, DamID ve Calling Card-seq'ye benzer fayda sunar ve çözünürlüğü, primer uzantısı 19 ile analiz edildiğinde neredeyse tek-bazlı çifti oluşturmaktadır. ChEC de kontrol edilebilir: MNase tarafından sağlam DNA bölünmesi, canlı maya hücrelerinde gözlemlenen düşük serbest kalsiyum konsantrasyonlarında MNase'in inaktif olmasını sağlayan, milimolar kalsiyum ilavesi ile ilgilidir.

Daha önce, ChEC'yi yüksek verimli sıralama (ChEC-seq) ile birleştirmenin, TF bağlama alanlarının yüksek çözünürlüklü haritalarını sağlayacağını varsaydık. Nitekim ChEC-seq, genom boyunca tomurcuklanan maya genel düzenleyici faktörlerin (GRF'ler) Abf1, Rap1 ve Reb1'in yüksek çözünürlüklü haritalarını üretti. ChEC-seq'u, doğrudan DNA'ya temas etmeyen ve ChIP-seq ile eşlenmeyen megadalton-boyutlu komplekslere uygulanabilirliğini genişleten, korunmuş, önemli bir global transkripsiyonel koaktivatör 21 olan modüler Mediator kompleksine başarıyla uyguladık. Tabanlı yöntemler. ChEC-seq, ChIP-seq sonuçlarının bağımsız olarak doğrulanması ve kromatin yerleşik süreçlerin düzenlenmesine ilişkin yeni anlayışların oluşturulması için güçlü bir yöntemdir. Burada, mayalanma mayasında bu yöntemin uygulanması için bir adım adım protokol sunuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Maya Suşlarının Üretimi

  1. MNase ile işaretlenmiş ilgi faktörünü taşıyan bir maya suşu üretin.
    1. PCR belirtilen reaksiyon karışımını ( Tablo 2 ) ve bisiklet koşullarını ( Tablo 3 ) kullanarak MNase etiketleme kasetini istenen vektörden ( Tablo 1 ) yükseltin. 5 μL PCR reaksiyonu ve 1 μL 6X DNA yükleme boyası karıştırın. Her bir PCR alikotu,% 0.8 agaroz jeli üzerinde 120 V'de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 2.3 kb'dir.
    2. Standart lityum asetat dönüşümü 22 kullanarak amplifiye edilmiş etiketleme kasetini seçme suyuna dönüştürün ve seçim yapın.
    3. Etiketleme kasetinin koloni PCR ile doğru şekilde entegrasyonunu doğrulayın.
      1. Belirlenen reaksiyon karışımını ( Tablo 4 ), taranacak koloni sayısı için hazırlayın. Gerekirse buzda tutun.
      2. Her bir koloni için tes için bir parça seçinSteril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak bir PCR tüpünün altına yerleştirildi.
      3. Toplanan kolonileri 1 dakika yüksek güçte mikrodalga ile yıkayın.
      4. Mikro dalgalı koloni ve pipet her biri için 50 μL PCR karışımı ( Tablo 4 ) ekleyin ve karıştırın. Belirtilen döngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin ( Tablo 5 ).
      5. Her bir PCR tüpüne 50 μL PCR reaksiyonu ve 10 μL 6X DNA yükleme boya maddesi karıştırın. Her bir örnekten 10 uL,% 1 agaroz jeli üzerinde 120 V'de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 700 bp'dir.
        NOT: İstenirse, MNase füzyon proteininin uygun ekspresyonunu western blotting yoluyla doğrulayın. Etiketli proteinin moleküler ağırlığında ~ 20.6 kilodaltonluk bir kayma bekleniyor.
  2. İlgi geninin promotörünün pGZ136'ya (Tablo 1) homoloji bazlı klonlanması ve adım 1.1.2'deki gibi transformasyon ve seleksiyon yoluyla serbest bir MNase suşu üretin.
    1. AlternatiAyrıca ilgi geninin promotörünü ve 3xFLAG-MNase-SV40 NLS'yi bir plazmid vektörüne birleştirin, transformasyon yapın ve adım 1.1.2'de olduğu gibi seçin ve plazmanın idame ettirilmesi için uygun seçici durumda streyni büyütün.

2. ChEC

  1. ChEC deneyinden önceki günün öğleden sonra / akşamı, MNase etiketli faktörü taşıyan tek bir koloni bulunan 3 mL maya pepton-dekstroz (YPD) veya uygun seçici besiyerini aşılayın. Bu kültüre gece boyunca inkübe edin (180 RPM sallayarak, 30 ° C).
  2. ChEC deneyinin sabahı sabah, gece kültürü 50 mL ortam içine 600 nm'de (OD 600 ) 0,2-0,3 optik yoğunluğa kadar sulandırın. Bu kültürü kuluçkalayın (180 RPM sallayarak, 30 ° C), 0.5-0.7'lik bir OD 600'e ulaşıncaya kadar inkübe edin. Kültür uygun OD 600'e yaklaştıkça, ısı bloğu veya su banyosu 30 ° C'ye ayarlanır ve çözülmeye başlar Tampon A katkı maddeleri ( Ta6).
  3. Kültür başına 5 mL Tampon A artı katkı maddeleri ( Tablo 6 ) hazırlayın. Prosedür sırasında tampon A'yı RT olarak tutun.
  4. Toplanan her zaman noktası için 90 μL durdurma çözeltisi ( Tablo 7 ) ve 10 μL% 10 SDS içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 s, 30 s, 1 dak, 2.5 dak, 5 dak ve 10 dakıktaki örnekleri alın.
  5. 1 saat boyunca 1,500 xg ve oda sıcaklığında (RT) 50 mL konik tüp ve santrifüj içine boşaltılmış kültür.
  6. Hücreleri 1 mL Tampon A'ya iyice süspanse edin ve yeniden süspanse edilen hücreleri bir mikrofüzyon tüpüne aktarın. Pelet, hücreleri, 1.500 xg'de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge'de yeniden askıya aldı.
  7. Süpernatantı aspire edin ve yukarı ve aşağı pipetleme yapılarak hücreleri 1 mL Tampon A'ya iyice süspansiyon haline getirin. Pelet, hücreleri, 1.500 xg'de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge'de yeniden askıya aldı. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  8. Hücreleri, 570 μL Tampon A içinde iyice süspansiyon haline getirin. 30 μL% 2'lik digitonin ekleyin(% 0.1 son konsantrasyon) ilave edin ve karışımı tersine çevirin.
  9. Isı blokunda veya su banyosunda 30 ° C'de 5 dakika boyunca hücrelerin geçirgen hale getirilmesi.
  10. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için reaksiyonu yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Durma çözeltisi ve SDS (adım 2.4) içeren bir mikrofuze tüpüne negatif bir kontrol olarak geçirgen hale getirilmiş hücrelerin 100 uL'lik bir bölümünü çıkarın ve karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin.
  11. MNase'i aktive etmek için permeabilize hücrelere 1.1 uL 1 M CaCl 2 (2 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve birkaç kez çabucak ters çevirin veya karıştırmak için kısa sürede vorteksleyin. Karışık reaksiyonu hemen 30 ° C'ye getirin ve bir zamanlayıcı başlatın.
  12. Toplanacak her zaman noktada, hücrelerin eşit bir şekilde dağılımını sağlamak için tepkiyi pipetle aşağı ve yukarı doğru pipetleyin, daha sonra karışımı durdurmak için çözelti ve SDS ve vorteks içeren bir mikrofuge tüpüne 100μL'lik bir alıkon sıvı atın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 saniye (CaCI 2 eklenmemiştir), 30 saniye, 1 dakika, 2.5 dakika, 5 dakika ve 10 dakika zaman noktaları.
    NOT: 30 ° C'de DNA'yı hızla bölen faktörlere sahip ChEC deneyleri, MNase bölünme kinetiğini yavaşlatmak için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir.
  13. Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, her bir numuneye 4 mg'lik 20 mg / mL proteinaz K ilave edin, karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin ve 30 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe edin.
  14. Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, iyice karıştırmak için girdapla çalkalayın ve 5 dakika boyunca bir mikrofuzudaki maksimum hızda ve RT'de santrifüjleyin.
  15. Her sulu fazı (~ 150 mcL) yeni bir tüp haline getirin. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika boyunca veya çözelti viskoz olana kadar karıştırmak ve çökelmek için şiddetle girdaplayın.
  16. Pelet DNA'yı maksimum hızla ve 4 ° C'de bir mikrofüjde 10 dakika çöktürdü.
  17. Süzüntü süpernatantları ve 1 mL RT% 70 etanol ile yıkanır peletler.
  18. Kararsız etanol, geri kalan kısmınD kağıt havlu üzerindeki tüplere hafifçe vurarak. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk.
  19. Pelletler kuruyorken, her biri 10 mg / mL RNaz A'nın her biri pH 8,0 + 1 μL olan Tris 29 mcL'de kurutulmuş peletleri tekrar süspanse etmek için bir ana karışım hazırlayın. RNA'yı 37 ° C'de 20 dakika boyunca sindirin.
  20. Her bir örnekten 5 μL'lik 6X DNA yükleme boyası ile 1 μL karıştırın ve 40 dakika süreyle 120 V'de% 1.5 agaroz jeli üzerinde çalıştırın.

3. Boyut Seçimi

NOT: Boyut seçiminin amacı, çok kilobarlı genomik DNA fragmanlarını örneklenecek örnekten çıkarmak ve yaklaşık 150 bp (yaklaşık olarak nükleozomal DNA boyutu) veya daha küçük fragmanlarını zenginleştirmektir. Sıralama verisinde, <400 bp'lik fragmanlar, nükleozomal DNA boyutu (yaklaşık 150 bp) çevresinde belirgin bir zirve ve subnükleozomal fragmanların doruğa veya geniş dağılımı ile zenginleştirilmiştir.

<ol>
  • Her bir numuneye, bir polietilen glikol (PEG) çözeltisi içinde 75 μL katı faz reversible immobilizasyon (SPRI) boncuk ekleyin ve karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Boncuk: DNA karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  • SPRI boncuk inkübasyonu sırasında, her örnek için 96 uL 10 mM Tris, pH 8.0 ve 4 uL 5 M NaCl içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın.
  • Tüpün yan tarafında boncuklar toplamak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukların tüpün yan tarafında 2 dakika boyunca toplanmasına izin verin.
  • Her süpernatanı, Tris ve NaCl içeren yeni bir tüpe aktarın (adım 3.2).
  • Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için girdapla ve maksimum hızda santrifüjleyin ve 5 dakika boyunca bir mikrofüjde RT edin.
  • Her sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika veya çözelti viskoz olana kadar DNA'yı çöktürün.
  • Pellet preciKurutulmuş DNA en yüksek hızda ve 4 ° C mikrofüjde 10 dakika boyunca.
  • Süzüntü süpernatantları ve 1 mL% 70 etanol ile yıkanır peletler.
  • Çökmeyen etanol, kalanı ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerindeki tüplere yavaşça dokunarak çıkarın. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk.
  • Kurutulmuş pelletleri 25 μL Tris, pH 8.0 içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Yüksek hassasiyetli bir test kullanarak örnek konsantrasyonunu belirleyin. TF ChEC deneyleri için, boyut seçildikten sonra 10-100 ng DNA rutin olarak toparlanır.
  • Sıralama kütüphanelerini hazırlayın. Daha önce açıklandığı gibi, boyut seçimi özelliğine sahip olmayan kütüphane hazırlama protokolleri, geniş bir yelpazedeki parçacık boyutlarının sıralamasına (25-500 bp) izin vermek için arzu edilir.
  • Eşleştirilmiş bit modunda sıralama kitaplıkları. Her uçta en az 25 baz dizisi, yüksek kaliteli okuma için gereklidirharitalaması. 1 ila 2 milyon okuma, bir MEÖ örneği için yeterli kapsam sağlar.
    NOT: ChEC-seq verilerinin analizi karmaşık bir prosedürdür ve bu makalenin kapsamı dışındadır. Veri analizi ile ilgili ayrıntılı bilgi önceki yayın 1 , 21'de bulunabilir ve analiz için kullanılan özel komut dosyaları GitHub'da mevcuttur (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu), ChEC-seq verilerinin komut satırı analizi için de kullanılabilir.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Başarılı bir ChEC deneyinde, DNA'nın agaroz jel elektroforezi ile analizi, genomik DNA'nın bulaşması ve nihai olarak tamamen sindirilmesiyle gösterildiği gibi, DNA fragmentasyonunda zamanla kalsiyuma bağlı bir artış gösterecektir. Bazı durumlarda, geleneksel bir MNaz sindirimiyle görülen bantlara benzer bir bant merdiveni uzun süre sindirildikten sonra gözlemlenir. Nükleozom tükenmiş bölgelerini (NDR) bağlayan genel düzenleyici bir faktör olan Reb1'in ChEC analizi için durum böyle ( Şekil 2 ). GRF'lerde hızlı sindirim sisteminin hızla bölünmüş bağlanma bölgelerinde sinyal kaybına yol açtığını gördük 1 . İdeal olarak, zamana bağlı sinyal kaybını önlemek için, Reb1 ChEC için 30 ve 1 dakikalık zaman noktaları gibi yüksek molekül ağırlıklı bulaşıkları gösteren genomik DNA bandının boyutunda bir azalma bulunan bir örnek kullanılacaktır. .

    Şekil 3 ). Benzer şekilde, Ortamatör altbirim Med8'in MNase ile füzyonuyla önemli bir DNA klivajını gözlemledik, ancak kalsiyum ilavesinden 1 dakika sonra MED8 yükselticisi tarafından yönlendirilen serbest MNaz değil ( Şekil 3 ).

    Reb1 ChEC-seq verilerini ChIP-seq ile karşılaştırmak için, ORGANIC 13 tarafından belirlenen 1,991 Reb1 tepelerinin bir listesini elde ettik. Bu pikler, motif orta noktası çevresinde 100 bp'lik bir pencerede her bir taban pozisyonunda ortalama fragman biti sayımı ile motif merkezlidir. Parçacıkların çoğunluğu motifin yukarı tarafına haritalanarak, bölünme sırasında çarpıcı bir asimetri gözlemledik (Şekil 4 ).

    Şekil 1
    Şekil 1 : ChEC-seq Metodunun Şeması. Bir kromatin ilişkili protein (CAP) -MNaz füzyonu maya hücrelerinde eksprese edilir. Protein DNA'ya bağlanır ancak çekirdekte çok düşük serbest kalsiyum nedeniyle arka plan seviyelerinin üstünde yarılma oluşturmaz. Hücrelerin digitonin ile permeabilize edilmesi ve milimolar kalsiyum ilavesi üzerine CAP-MNase füzyonları genoma bağlanır ve DNA parçalanır ve küçük parçalar salınır. Bu fragmanlar daha sonra saflaştırılır, sekanslanır ve CAP-MNase füzyonu için bağlanma bölgelerine yakın prospektif parça uçlarının zirvelerini vermek üzere genoma geri eşlenir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.


    Şekil 2 : Reb1 ChEC Deneyinden DNA'nın Agaroz Jel Elektroforezi. Her ChEC zaman noktasından alınan 5 uL'lik DNA parçacığı, boyut seçiminden önce% 1.5 TAE agaroz jeli üzerinde analiz edildi. Bu, Reb1-MNase füzyonuyla genomik DNA'nın ilerici sindirimini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

    Şekil 3
    Şekil 3 : Reb1-MNase ve Free MNase ChEC-seq Denemelerinin Genom Tarayıcı Anlık Görüntüsü. IGV, Reb1 ve serbest MNase ChEC-seq 30 sn'lik kalsiyum ilavesi sonrası ve Med8 ve serbest MNase ChEC-seq'den 1 dakika sonra fragment son sinyali görüntülemiştir Maya genomunun temsili bir parçası boyunca ter kalsiyum ilavesi. Veri kümeleri, her bir taban konumuna eşlenen parçacıkların sayısını, eşlenen toplam parçacık sayısıyla bölünerek ve eşlenen toplam taban sayısı ile çarpılarak normalize edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

    Şekil 4
    Şekil 4 : Reb1 ORGANİK Sitelerinde Reb1-MNase'ten salınmış parçanın zenginleşmesi. ORGANIC tarafından belirlenen 1.991 Reb1 motifleri etrafında 30 saniye Reb1 ve serbest MNase ChEC-seq fragman son sinyalinin ortalama arsa. Veriler Şekil 3'deki gibi normalize edilmiştir.Lank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

    plazmid Maya seçilebilir işaretleyici notlar Addgene plazmid numarası
    pGZ108 kanMX6 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70231
    pGZ109 HIS3MX6 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70232
    pGZ110 TRP1 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70233
    pGZ136 URA3 REB1 promotörünün kontrolü altındaki 3xFLAG-MNase-SV40 NLS'sini ifade eder 72273
    pGZ173 kanMX6 MNase tagging, 8 aa linker 70234

    Tablo 1: ChEC Plazmidlerinin Ayrıntıları. Tüm etiketleme vektörleri pFA6a vektörlerine dayalıdır ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan F2 / R1 etiketleme primer çiftleri ile uyumludur. Etiketleme kaseti, belirtilen uzunluğa sahip bir bağlayıcı, batı blotlaması ile algılanmayı kolaylaştırmak için 3xFLAG epitopundan (linker 3xFLAG etiketini çıkarmak için kısaltılmış pGZ173 hariç), MNaz'ın olgun zincirini (GenBank P00644 , Aa 83 - 231) ve belirtilen seçilebilir işaretleyici.

    reaktif hacim [Son]
    5x PCR tamponu 10 mL 1x (2 mM MgCl2)
    10 mM dNTP karışımı (2.5 mM her bir dNTP) 1 mL 200 mM (50 mM her dNTP)
    10 mM F2 primeri 2.5 mL 0.5 mM
    10 mM R1 pRimer 2.5 mL 0.5 mM
    PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) 1 mL
    2 U / μL sıcak başlangıç ​​yüksek doğruluk polimeraz 0.5 mL 1 U
    DdH20 32.5 mL

    Tablo 2: 3xFLAG-MNase Etiketleme Kasetlerinin PCR Amplifikasyonu İçin Reaksiyon Karışımı. F2 / R1 primer sekansları http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt adresinde bulunabilir.

    Sıcaklık (° C) Zaman döngüleri
    98 30 s 1
    98 10 s 25
    55 30 s 25
    72 1 dak. 15 s 25
    72 2 dakika 1
    10 Sonsuza dek Ambar

    Tablo 3: 3xFLAG-MNase Etiketleme Kasetlerinin PCR ile Amplifikasyonu İçin Termal Çevrim Koşulları. Kuluçka sıcaklığı ve uzatma süresinin, kullanılan DNA polimerazına göre ayarlanması gerekebilir.

    reaktif hacim [Son]
    10x Taq tamponu 5 mL 1x (1.5 mM MgCl2)
    10 mM dNTP karışımı (2.5 mM her bir dNTP) 1 mL 200 mM (50 mM her dNTP)
    10 mM Kontrol primeri 1 mL 0.2 mM
    10 mM MNase-R veya negatif kontrol primeri 1 mL 0.2 mM
    5 U / mL Taq polimeraz 0.5 mL 2.5 U
    DdH20 41.5 mL

    Tablo 4: MNase Etiketlemenin Koloni PCR Onaylama İçin Reaksiyon Karışımı. Kontrol primer sekansları http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt adresinde bulunabilir. Kontrol primeri, MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') içindeki bir ters primer ve bir negatif kontrol olarak ilgili genin ~ 500 baz çiftinden (bp) ters primer ile birlikte ileri primer olarak kullanılır.

    Sıcaklık (° C) Zaman döngüleri
    95 5 dakika 1
    95 30 s 35
    55 30 s 35
    68 1 dakika 35
    68 5 dakika 1
    10 Sonsuza dek Ambar

    Tablo 5: MNase Etiketlemenin Koloni PCR Onaylama İçin Isıl Çevrim Koşulları. Kuluçka sıcaklığı ve uzatma süresinin, kullanılan DNA polimerazına göre ayarlanması gerekebilir.

    reaktif hacim [Son]
    1 M Tris, pH 7.5 1.5 mL 15 mM
    1 M KCl 8 mL 80 mM
    0,2 M EGTA 50 mL 0.1 mM
    DdH20 100'e kadar doldurmL

    Tablo 6: Tampon A için reçete. Kullanımdan önce, bir proteaz inhibitör tabletinin yarısı, 50 mcL 100 mM PMSF (1 mM nihai), 5 uL 200 mM spermin (0.2 mM nihai) ve 2.5 uL 1 M 5 mL solüsyon başına spermidin (0.5 mM son).

    reaktif hacim [Son]
    5 M NaCl 8 mL 400 mM
    0.5 M EDTA 4 mL 20 mM
    0,2 M EGTA 2 mL 4 mM
    DdH20 100 mL'ye kadar doldurun

    Tablo 7: 2x Durdurma Çözümü için Reçete. 90 uL sto birleştirinP çözeltisi ile 10 μL% 10 SDS ile bir mikrofuge tüp içerisinde alınacaktır (bkz. Adım 2.4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    ChEC'in kromatin üzerinde çeşitli maya protein sınıflarını haritalayabileceğini ve bunun mayada farklı TF'ler ailelerine ve diğer kromatin bağlayıcı faktörlere uygulanabileceğini öngörüyoruz. ChEC-seq, çapraz bağlanma, kromatin çözünürlüğü veya antikorları gerektirmediğinden avantajlıdır. Dolayısıyla, ChEC, X-ChIP-seq'de potansiyel olarak mevcut hâllerde bulunan hiper-ChIPable eser 3 , 4 ve yerli ChIP gibi, eksik protein çözünürlüğü nedeniyle yanlış negatifler gibi nesneleri önler 14 . ChEC-seq'in en büyük dezavantajı, tüm enzimatik füzyon yöntemlerinde olduğu gibi, bir füzyon proteini için şarttır. Bu maya tomurcuklanmasında hızlı bir şekilde başarılabilir, ancak metazenlerde daha zahmetlidir. ChEC-seq'in bir başka kısıtlaması, histon değişikliklerinin profillemesi için olduğu gibi uygulanamamasıdır. Bununla birlikte, modifikasyon bağlayıcı bir alan MNase'e birleştirilebilir ve ifade edilebilir; hChEC-seq ile istone modifikasyon haritası. Bu damarda, epitopla etiketlenmiş histon modifikasyon bağlanma alanları kullanan ChIP-seq, genom çapında histon modifikasyonu desenlerinin haritasını yapmak için kullanılmıştır.

    Ücretsiz bir MNase kontrolünün kullanılması, ChEC-seq sonuçlarının özgüllüğünün belirlenmesinde önemlidir. Serbest MNase suşu ilgi geni için endojen promotör kontrolü altında 3xFLAG ve simian virüs 40 nükleer lokalizasyon sinyali (SV40 NLS) ile işaretlenmiş MNase taşır. Kavramsal olarak DamID çalışmalarında kullanılan erimiş Baraj kontrolüne benzer 27 ve kromatin erişilebilirliğinden dolayı spesifik olmayan bölünme kontrolleri. TF ChEC-seq için ücretsiz bir MNase kontrolü olarak, ura3 lokus 1'de REB1 hızlandırıcısı tarafından tahrik edilen 3xFLAG-MNase-SV40 NLS'yi entegre ettik . Mediator ChEC-seq için, integrasyon yapmayan bir plazmadaki MED8 promoterinin kontrolü altındaki 3xFLAG-MNase-SV40 NLS'yi ifade ettik.D vektörü seçici ortamda muhafaza edilmiştir 21 . Her iki durumda da, serbest MNaz ile çok az bölünme gözlenmiştir. Bu nedenle, 3xFLAG-MNase-SV40 NLS'nin nispeten sağlam bir yükseltici tarafından yönlendirildiği tek bir kontrol suşu çoğu deney için uygun olmalıdır.

    ChEC deneyini planlarken, ilgi proteininin yapısal önemi önemli olabilir. Örneğin, MNase'in Reb1'in C terminusuna eklenmesinin Reb1 motifleri etrafında bir asimetrik bölünme paterni verdiğini, buna karşın N-terminal MNase'li Reb1'in ifadesi simetrik bir bölünme paterni 1 verdiğini bulduk. Bu farklı bölünme modellerini Reb1'in yapısına bağlarız. Reb1'in DNA bağlama alanı, C-ucunda bulunur; Dolayısıyla, C-terminusu DNA'ya yakın yapıdadır ve MNase'in hareket aralığını sınırlar ve sadece C-terminali bölünmeye izin verir. Aksine, Abf1'in C-ucu, nispeten yapılandırılmamıştır ve dolayısıylaMNase'ye ulaşır, Abf1 bağlanma alanlarının her iki tarafında yarılmaya izin verir. Bir başka maya GRF olan Rap1 durumunda, C terminali ve MNase arasındaki bağlayıcının 33 ila 8 aa arasında kısaltılmasının, muhtemelen Rap1'in C terminali bölümünün önerilen uzaklığı nedeniyle bölünmeyi ciddi olarak azaltmaya yeterli olduğunu bulduk DNA 28 . Bu gibi yapısal bir düşünce, büyük komplekslerde bulunan proteinlerin bağlanmasını harekete geçirmeye çalışırken de büyük önem taşımaktadır. Mediator'un maya genomuna 21 bağlanan ChEC-seq analizimiz için kompleks içinde gömülmek yerine yapısal olarak maruz kalacağı tahmin edilen C-termini altbirimleri seçtik. MNase ile kaynaştırılan üç alt birimden biri, DNA'yı sağlam bir şekilde parçalamamıştı, bu da ya, ya diğer DNA bağlama faktörleri ile olan etkileşimler ya da sterik kısıtlamaların DNA bölünmesini zayıflattığını düşündürüyordu.

    ChEC-seq'in, maya GRF'leri Abf1, Rap1 ve Reb için 4-12 kat daha yüksek tepe tespit ettiğini bulduk1 tüm zaman noktaları birlikte değerlendirildiğinde, çeşitli ChIP yaklaşımlarına göre 1 . Bu alanlar, MNase bölünme kinetiğine dayalı olarak iki sınıfa ayrılabilir. Mayal GRF'ler için ChEC-seq verilerinin analizi iki geçici olarak bağlanma bölgesi sınıflandırmasını ortaya koydu. 'Hızlı' olarak adlandırılan ilk, kalsiyum ilavesinden sonra <1 dakika maksimum bölünme göstermiş ve genel olarak bilinen konsensüs motifleri ile sağlam kibritler içermektedir. "Yavaş" olarak adlandırılan ikincisi, kayda değer derecede bölünme seviyelerine ulaşmak için birkaç dakika sürdü ve motif eşleşmeleri tükendi. Her iki site sınıfı da, ortalama olarak, ChIP veri setlerinde bağlanma açısından zenginleştiler, buna rağmen mutlaka bu ChIP çalışmalarında tepeler olarak adlandırılmadılar. Verilen bir faktör için sitelerin çoğunluğu yavaş sitelerdi. Hızlı alanların yüksek afiniteli transkripsiyon faktörü bağlanma alanlarını temsil ettiğini, yavaş bölgeler ise bağlanma bölgesi taramasında geçici olarak örneklenen lokusları temsil ettiğini düşünüyoruz. ObMNase bölünmesinin kinetiğiyle ayrılmış iki sınıf bağlanma alanının servizasyonu, birçok ChIP-seq veri setinde gözlemi açıklayabilir; bu da, iyi yerleşmiş bir DNA bağlama özgünlüğüne sahip belirli bir faktör için çok sayıda tepe noktası bir konsensüs motifi içermez 29 : Çoğu ChIP protokolünde 10-15 dakika boyunca gerçekleştirilen formaldehit çapraz bağlanması, art arda genom ile bir faktörün geçici veya fırsatçı etkileşimlerini yakalar ve sinyal enflasyonuna yol açar. Nitekim, ChIP-ekso ve canlı hücre görüntülemesinin karşılaştırılması, durumun 2 olduğunu göstermektedir. Özellikle, Aracı ChEC-seq sinyalinin nispeten 30 s'den 20 dakikaya sabit olduğu Mediator ChEC-seq sinyalleri 21'de dramatik zamana bağlı bir azalma gözlemledik. Bu gözlemler göz önüne alındığında, yüksek güven veren bağlayıcı siteleri kurtarmak için kısa süreli ChEC-seq gerçekleştirmenizi öneririz.

    ChEC-seq'in maya yerine adapte olabileceğini tahmin ediyoruzsistemleri. Uyarılmamış memeli hücrelerindeki serbest kalsiyum konsantrasyonu, etkin MNase aktivasyonu için eşik değerin çok altında 50-300 nM 30 , 32'dir. Metazoan sistemlerde ChEC-seq'nin oluşturulması için sınırlayıcı adım, bu nedenle, metazoada maya hücrelerinden çok daha zahmetli olan füzyon proteinlerinin üretilmesidir. Bununla birlikte, metazoan genlerinin endojen etiketlenmesi, CRISPR tabanlı genom mühendisliği 33'in ortaya çıkışı ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır ve bu yüzden bu sınırlamanın kolayca üstesinden gelinmelidir. Alternatif olarak, MNase füzyon proteinleri plasmidlerden düşük seviyelerde eksprese edilebilir. Bu yaklaşım Dodesophila 34 , 35 ve insan 36 hücrelerinde DamID için oldukça başarılı olmuştur ve bu nedenle metazoan hücrelerde ChEC-seq'u kolaylaştırabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

    Acknowledgments

    Moustafa Saleh ve Jay Tourigny'ye el yazması ile Steven Hahn ve Steven Henikoff'un eleştirel okumaları için ChEC-seq'in gelişimi boyunca rehberlik ve destek için ve arabulucu kompleksine uygulanmasından dolayı teşekkür ediyoruz. SG, NIH bağışları R01GM053451 ve R01GM075114 tarafından desteklenmektedir ve GEZ, Indiana Üniversitesi başlangıç ​​fonlarıyla desteklenmektedir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    dNTPs NEB N0447
    Q5 high-fidelity DNA polymerase NEB M0491L Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
    TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder ThermoFisher Scientific 10488085
    Taq DNA polymerase NEB M0273L
    cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001 It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
    PMSF ACROS Organics AC215740010
    Digitonin, High Purity EMD Millipore 300410-250MG Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
    Proteinase K, 20 mg/mL Invitrogen 25530049
    RNase A, 10 mg/mL ThermoFisher Scientific EN0531
    Ampure XP beads Beckman Coulter A63880 Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
    MagneSphere magnetic rack Promega Z5342

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
    2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
    3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
    4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
    5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
    6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
    7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
    8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
    9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
    10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
    11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
    12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
    13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
    14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
    15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
    16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
    17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
    18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
    19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
    20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
    21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
    22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
    23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
    24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
    25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
    26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
    27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
    28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
    29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
    30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
    31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
    32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
    33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
    34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
    35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
    36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

    Tags

    Genetics ChEC-seq ChIP-seq transkripsiyon genom çapında Arabulucu,
    ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Grünberg, S., Zentner, G. E.… More

    Grünberg, S., Zentner, G. E. Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (124), e55836, doi:10.3791/55836 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter