Summary
Hier tonen we een nieuwe benadering voor het gebruik van hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (HR-SD-OCT) helpen levering van gen-therapie-agenten in de subretinal ruimte, beoordelen van haar areal dekking en karakteriseren fotoreceptor vitaliteit.
Abstract
HR-SD-OCT wordt gebruikt om te controleren de progressie van fotoreceptor degeneratie in levende muismodellen, beoordelen van de levering van therapeutische agenten in de subretinal ruimte, en ter beoordeling van toxiciteit en werkzaamheid in vivo. HR-SD-OCT gebruikt in de buurt van infrarood licht (800-880 nm) en heeft optica specifiek ontworpen voor de unieke optiek van het oog van de muis met sub-2-micron axiale resolutie. Transgene muismodellen van buitenste retinal (fotoreceptor) degeneratie en controles werden beeld voor de beoordeling van de progressie van de ziekte. Getrokken glas microneedles werden gebruikt voor het leveren van sub retinale injecties van adeno-associated virus (AAV) of nanodeeltjes (NP) via een trans-scleral en trans-choroidal aanpak. Nauwkeurige positionering van de naald in de subretinal ruimte was nodig voorafgaand aan een gekalibreerde druk injectie, die vloeistof in de sub retinale ruimte levert. Real time subretinal chirurgie werd uitgevoerd op onze retinal imaging systeem (RIS). HR-SD-OCT aangetoond progressieve uniforme Retina degeneratie toe te schrijven aan de expressie van een giftige mutant menselijke mutant rhodopsine (P347S) (RHOP347S) transgenic muizen. HR-SD-OCT kunt strenge kwantificering van alle lagen van het netvlies. Nucleaire buitenlaag (ONL) dikte en fotoreceptor buitenste segment lengte (OSL) metingen correleren met fotoreceptor vitaliteit, degeneratie, of redding. Het uitvoeringssysteem RIS kunt visualisatie in real time van de subretinal injecties in neonatale (~ P10-14) of volwassen muizen, HR-SD-OCT onmiddellijk bepaalt succes van levering en kaarten areal mate. HR-SD-OCT is een krachtig hulpmiddel dat het succes van subretinal chirurgie bij muizen, daarnaast evalueren kan tot het meten van de vitaliteit van de researchdieren in vivo. HR-SD-OCT kan ook worden gebruikt ter identificatie van de uniforme dierlijke cohorten om te evalueren in welke mate van Retina degeneratie, toxiciteit en therapeutische redding in onderzoeken voor preklinische gen-therapie.
Introduction
Onderzoekers ontwikkelen gentherapieën voor een verscheidenheid van retinale en netvlies degeneratieve ziekten met hoop van het vertalen van nieuwe therapeutics in behandelingen voor ziekten bij de mens1,,2,,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tijdsdomein of spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) is gebruikt om te onderzoeken van de aspecten van de buitenste Retina degeneratie in specifieke Muismodellen van de ziekte12,13,14 . HR-SD-OCT niet, echter, heeft uitgebreid gebruikt in het kader van de evaluatie van Muismodellen optimaliseren om te bepalen van het tarief en de ruimtelijke uniformiteit van Retina degeneratie, of in het kader van preklinische evaluatie van gen gebaseerde therapeutics, bijvoorbeeld, tot redding, toxiciteit of de ruimtelijke omvang van vector levering8,15,16te beoordelen. Zodra een muismodel volledig gekenmerkt wordt, kan de HR-SD-OCT-gegevens dienen als een informatieve en betrouwbare bron voor het meten van de impact van therapeutics uitoefenen toxiciteit in muismodellen van Retina degeneratie17of redding. Veel groepen zijn met behulp van subretinal injectie als een methode van vector levering als gevolg van het rendement bij transducing researchdieren en retinale pigment epitheel (RPE) cellen. Dit blijft echter een moeilijke methode te beheersen, gezien het feit dat het wordt meestal gedaan door gratis-Handchirurgie van het hoornvlies oppervlak, en vaak beladen met staar is, bloeden, en onbedoelde retinale detachementen gewoon door manipulatie van de posterior glasvocht. Veel groepen nog steeds proberen subretinal injecties blindelings en leveren het virus handmatige injecties met relatief grote diameter RVS naalden (34G)8,17,18,19 ,20,21,22, en een paar toepassingen optische coherentie tomografie (OCT)-imaging om te bevestigen correcte levering van vector aan het netvlies8,17, 20 , 22. enkele verbeteringen in de methode zijn onlangs beschreven met behulp van microscale naalden gedreven door een micromanipulator-22.
Presenteren we een geïntegreerde aanpak die helpt bij de positionering van de naald en de injecties worden gefaciliteerd door een aangepaste gestuurde stereo oftalmoscoop ontworpen in het lab specifiek voor het visualiseren van binnen het kleine oog van de muis17, 23. het gebruik van de micro naalden getrokken glas in combinatie met de stereotaxic micromanipulator bieden betere controle van de plaatsing van de naald met geen chirurgische cut down vereist (dat wil zeggen, door middel van de bindvliezen en bindweefsel) voorafgaand aan injectie. Het gebruik van de druk geregeld micro injector helpt leveren consistente injectie volumes en de injectie kan worden gedaan met veel grotere stabiliteit, precisie en veel trager dan handmatige injecties uitgevoerd door een hand-held spuit, daardoor verminderend de het voorkomen van bubble injectie in het oog. De kleinere naald voorkomt lekkage na naald terugtrekking omdat het pad zelfsluitende. Om te beoordelen in welke mate van injectie/levering, vertrouwen vele onderzoeksteams op het vinden en beoordelen van de areal omvang van verbeterde groene fluorescentie (EGFP) eiwituitdrukking in de retina (expressie construct geleverd door de vector) experimentele eind Wijs (euthanasie) om te bevestigen van succesvolle injecties11,19,20,24. Deze benadering (niet met behulp van OCT) om te controleren of chirurgische succes afval een enorme hoeveelheid middelen in chirurgische procedurele tijd en dieren, aangezien alle dieren met (onbekende) chirurgische mislukkingen worden gehandhaafd moeten, gevolgd met repetitieve maatregelen tot euthanasie en oog oogst (als EGFP wordt gemeten). Bevestiging van de locatie van injectie in het netvlies kan worden verbeterd met behulp van HR-SD-OCT om aan te tonen dat de injectie gelegen tussen de juiste lagen van het netvlies (dat wil zeggen de subretinal ruimte is). HR-SD-OCT kan ook worden gebruikt om af te bakenen onmiddellijk mislukte pogingen (chirurgische mislukkingen) om te identificeren van relevante variabelen in echte chirurgische tijd om op de aanpak te verbeteren. We vonden dat HR-SD-OCT talrijke voordelen in preklinische gen therapie studies biedt doordat snelle kwantitatieve evaluatie van de buitenste Retina degeneratie, waardoor identificatie/ruimen van studie dieren die niet voldoen aan de criteria van de experimentele ( bijvoorbeeld onjuiste subretinal injectie), en naar rechtstreekse follow-up imaging naar de regio van het oog waar de vector werd geleverd (indien preklinische effect is waarschijnlijk), alsmede het bepalen van de regio's waar de vector werd niet geleverd. Sinds de ontwikkeling ervan, het gebruik van SD-OCT heeft voortgezet te worden aanvaard en gebruikt door onderzoekers van de oogheelkunde en wordt nu beschouwd als de standaard voor retinale imaging in netvlies wetenschappelijke studies in muis of knaagdier modellen13,25. HR-SD-OCT en de softwaremogelijkheden werden gebruikt in unieke geïntegreerde manieren om het doel van succesvolle kwantitatieve gentherapie in muismodellen bij elke stap in het proces, inclusief diermodel selectie, karakterisering van degeneratie in gekozen ziekte modellen, therapeutische levering, toewijzing van vector levering en evaluatie van de toxiciteit/werkzaamheid. Het gebruik van HR-SD-OCT zorgt voor efficiëntere drugontdekking op elk niveau van het proces. Hier beschrijven we deze benaderingen die zijn gebruikt in ons RNA drugontdekking-programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke protocollen werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en de commissies van het gebruik van de VA WNY HCS en de University at Buffalo-SUNY. Dieren werden gebruikt volgens de bepalingen van de vereniging voor onderzoek in visie en oogheelkunde (ARVO) en de verklaring van Helsinki.
1. de Muismodellen
- Muismodellen te worden geëvalueerd met inbegrip van besturingselementen identificeren.
Opmerking: Imaging werd uitgevoerd voor een C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, een gedeeltelijk gehumaniseerd Retina degeneratie muismodel homozygoot voor menselijke mutant RHOP347S hC1 allelen van het wild-type (WT) mouse RHO+/ + genotype26 , 27, hC1 x BL/6(J), een gedeeltelijk gehumaniseerd model met een enkel exemplaar van de mutant menselijke RHOP347S hC1 allel op de WT muis RHO+/ + genotype (hC1 /-/ / mWT/mWT) (verkregen door kruising van hC1/hC1 / / mWT/mWT met C57BL/6 () J) muizen). De boven autosomaal dominante retinitis pigmentosa (adRP) zijn de modellen op de achtergrond van de C57BL/6(J). Een muismodel dat is homozygoot voor twee kopieën van het menselijke WT RHO gen op de muis RHO knock-out achtergrond was ook gebruikte28,29. Deze regel is op de achtergrond van de 129Sv. Deze lijn werd gekruist met een muis RHO -knock-out op de achtergrond van de 129Sv, een enkelvoudige dosis van menselijke RHO treedt op op de muis RHO achtergrond. - Het handhaven van de dieren de volgendevoorwaarden relevant is voor de proefopzet.
Opmerking: De dieren werden onderhouden in de veterinaire medische Unit (VMU) op de HCS VA WNY. Muizen werden gevoed standaard lab chow en geteeld onder 12 h:12 h licht: donkere cycli met zachte fluorescerende overhead witte lichten met ongeveer 300 lux op niveau van de kooi op ongeveer 72 ˚F.
2. muis Eye Gel
- De optische gel gebruikt voor retinale imaging30 en chirurgische procedures voor te bereiden.
- Combineren van 2 mg/mL w/v ultrahoog moleculairgewicht (4 x 106 g/mol carbomer in steriele 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Meng bij kamertemperatuur totdat de gel een viskeuze optisch transparante gel vormt.
- Breng de gel in kleine flesjes van steriele en centrifugeer in een swingende emmer tafelblad centrifuge op 350 x g gevangen luchtbellen te verwijderen.
- Breng de gel rechtstreeks op het hoornvlies een interface tussen het hoornvlies muis en een premie dekking glas (18 mm x 18 mm) te maken.
3. HR-SD-OCT-Imaging
- Zie het HR-SD-OCT-apparaat (Figuur 1).
- Weeg het dier om het bepalen van de juiste dosis van de verdoving. Dan anesthetize de muis met behulp van 25 µL/g van het lichaamsgewicht van de 2,5% oplossing van gebufferde 2,2,2-tribromoethyl alcohol (Avertin) oplossing via intraperitoneale injectie (IP) en voeg dat de oogdruppels om het verwijden van de leerlingen, nadat het dier is geïmmobiliseerd.
- Bevestig dat het dier is volledig verdoofd door een snuifje teen, en er zeker van te zijn dat het dier reageert niet.
- Trim de snorharen en plaatst u de muisaanwijzer op de HR-SD-OCT-slee.
- Plaats van de muis oog direct voor de zendspoel lens en manipuleren van de fase-besturingselementen totdat het hoornvlies en de iris zich bevinden. Houd het hoornvlies gehydrateerd door het toepassen van kunstmatige tranen.
Opmerking: De fijnafstelling micromanipulators op de HR-SD-OCT-slee worden gebruikt om de positie van de muis, zodat de leerling diafragma is gecentreerd en georiënteerd. De optische zendspoel is dan geavanceerde totdat het netvlies zichtbaar wordt en het dier verder aangepast is met het oog op de best mogelijke beeld. - Eerst, open het programma "Muis" en klik op "patiënt/examen". Ten tweede, klikt u op "add patiënt" en voer de relevante gegevens ter identificatie van het dier in het nieuwe patiënt venster "opslaan en sluiten". Ten derde, klik "examen" gevolgd door "start examen". Ten vierde, klikt u op "add custom scan" en selecteer "rechthoekig volume", kies OD of OS voor het oog image wordt gemaakt, dan klik "examen". Ten slotte, start het instrument gericht en positionering van het dier voor de regio van belang. Na het vinden van de juiste regio, verwijder alle overtollige vocht van het oog oppervlak met behulp van een steriel katoenen applicator vlak voor Beeldacquisitie getipt om de beeldkwaliteit nog verder te verbeteren, klik dan "start momentopname", en als een goed imago wordt verkregen, klikt u op "opslaan scan".
Opmerking: Typische parameters voor rechthoekige HR-SD-OCT beelden zijn 900 a-scans/b-scan en 90 b-scans/afbeelding. Verworven beelden zijn 1.4 x 1.4 mm. De regio van het netvlies beeld hangt af van de specifieke experiment, maar de meeste beelden zijn gecentreerd op de kop van de oogzenuw (ONH).
4. beoordeling van de aanwezigheid, percentage en uniformiteit van de buitenste retinale Degenerations Model
- Buitenste Retina degeneratie Model evaluatie door HR-SD-oktober
- Dieren met een breed spectrum van leeftijden voor zowel het besturingselement als de experimentele onderwerpen om te beoordelen van de aanwezigheid, percentage en uniformiteit van de buitenste Retina degeneratie te verkrijgen.
- HR-SD-OCT imaging op meerdere dieren uitvoeren op elke leeftijd van beide cohorten (ziekte en normaal). Gebruik de methode beschreven in 3.1.6 te verkrijgen van de OCT beelden.
Opmerking: Gegevens kunnen worden verzameld van een grote cohort van dieren ineens, die rondgedeeld verjaardagen verspreid over een ruime periode van tijd (1 jaar), of een kleine cohort van het dier kan worden gebruikt voor het verzamelen van meerdere beelden gedurende een lange periode van tijd (1 jaar) om soortgelijke resultaten te verkrijgen. - Openen van een opgenomen beeld van de HR-SD-OCT rechthoekig volume en de identificatie van de eerste b-scan kunnen worden gemeten (idealiter bevatten de ONH of andere herkenbare landmark) van het ensemble van beelden. Vergroot de afbeelding om te vullen het scherm met de zoomfunctie in de software.
- Open het gewenste aantal remklauwen door rechts te klikken op de afbeelding voor de b-scan en vervolgens te klikken op "Remklauwen" en ten slotte op zoveel remklauwen desgewenst te klikken (ze zijn genummerd 1 t/m 10). Zorg ervoor dat de remklauwen in de rechter benedenhoek van de afbeelding verschijnen. Met behulp van de functie "Configureren remklauw" toewijzen van hen allen als "vertical" in de hoek blok kolom en zet de "Display remklauw locatie' om te vergemakkelijken van uniforme plaatsing in het netvlies en tenslotte, tikken toepassen.
Opmerking: De 1st remklauw moet worden gelegd op de linkerkant van het beeld bij de verwerking van het oculus dexter (OD) rechteroog en remklauw: de 1st aan de rechterkant van de afbeelding moet worden geplaatst bij de verwerking van de oculus sinister (OS) linkeroog beelden. Dit resulteert in een nasaal temporele afdrukstand van alle gegevens voor zowel de linker- en ogen wanneer u uitzet. - Elke remklauw met behulp van de computermuis, verplaatsen naar de gewenste locatie (2.0 mm uit elkaar) over de b-scan, waarbij u een remklauw plaatsen in het midden van het hoofd van de oogzenuw, b-scan afbeeldingen opnemen (dit remklauw ingesteld op nul). Gebruik vervolgens de muis klikken en slepen de remklauw op lengte te omvatten van de regio van belang. Willekeurig instellen remklauwen die geen meetbare regio's van de b-scan tot maximale lengte overlay, en negeren tijdens de data-analyse.
- Het meten van de dikte van de ONL hulpprogramma's de remklauw, door het plaatsen van de bovenkant van de remklauw op de externe beperkende membraan (ELM) en de onderkant van de remklauw aan de onderkant van de Meervormige buitenlaag (OPL). Herhaal dit voor elke remklauw in het netvlies in stappen van 0,2 mm. Sla de metingen.
- Nadat alle remklauwen zijn geplaatst en aangepast aan de grootte, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op "Save remklauw Data".
- Herhaal de metingen op latere b-scans (elke 10th scannen werkt goed) uit hetzelfde rechthoekig volume OCT beeld verspreid over het hele netvlies van inferieur aan superieure regio's. Remklauwen moeten blijven open en op dezelfde locatie in de x-as. De lengte van de remklauwen passen zonder deze te verplaatsen in de X-richting.
- Open het opslaan in gegevensbestanden door te klikken op het kleine bestandspictogram naast de verwerkte b-scan afbeelding en klik op "Ga naar gegevens". Klik op 'datum gewijzigd te regelen van de bestanden in volgorde op basis van tijd opgeslagen, openen van alle bestanden voor elke b-scan gemeten.
- De onbewerkte gegevens van elke b-scan compileren naar een enkel bestand in volgorde van het laagste naar het hoogste gebaseerd op framenummer. Selecteren welke kolommen met gegevens, met inbegrip van "Remklauw naam", "Lengte" en "Center X".
- Zorg ervoor dat het center X hetzelfde voor alle b-scans gemeten voor elke rechthoekige volume OCT afbeelding verwerkt. Alle gegevens verwijderen van de remklauwen die waren niet gewend aan het opnemen van metingen en de remklauw gelegen in het centrum van het hoofd van de oogzenuw op nul ingesteld.
- De gegevens voor X vs. meerdere Y gegevenssets te krijgen een 3D perceel functie uitzetten in de totale dikte van de ONL uitzetten of andere gemeten retinale laag.
- Vergelijk ONL metingen tussen controle en proefdieren met bijbehorende leeftijden om te bepalen van het tarief en de uniformiteit van alle potentiële Retina degeneratie.
- Herhaal dit proces voor OSL metingen met behulp van dezelfde b-scan beelden. Volg dezelfde methode gebruikt voor het meten van de ONL, behalve het plaatsen van de remklauwen tussen ELM en Bruch van membraan (BM).
Opmerking: Een voorbeeld van hoe plaats ik de remklauw wordt weergegeven in de sectie van de vertegenwoordiger resultaten (Figuur 3B). Dit moet gebeuren op een ingezoomde afbeelding verkleind fout. - Herhaal de data-analyse voor meerdere dieren voor elke verjaardag voor beide experimentele en controle cohorten.
- Uitgebreide meet- en 3D-toewijzing van de dikte van het ONL of OSL met behulp van het hulpprogramma software remklauwen
- Injectie OCT postbeelden te bekijken en noteer alle identificeerbare bezienswaardigheden, zoals de ONH of bloedvaten in het netvlies. Plaats vervolgens de muis voor het verkrijgen van een follow-up SD-OCT uit dezelfde regio, en zorg ervoor dat u de zelfde identificeerbare bezienswaardigheden.
Opmerking: Zorgen ervoor dat de regio van het netvlies beeld en betrokken in het netvlies detachement in injectie SD-OCT postbeelden is geïdentificeerd. Een rechthoekig volume SD-OCT beeld opnemen en opslaan. - De opgenomen beelden verwerken zoals hierboven beschreven in stappen 4.1.3. om 4.1.14. Sla de gegevens van de remklauw en plot zoals hierboven beschreven.
Opmerking: De resulterende array van ONL metingen wordt gebruikt voor het maken van een 3D plot beeltenis van de ONL-dikte. De positie van de remklauwen langs de x-as kan men replot de grafiek plaatsen van de oogzenuw aan de oorsprong (0) langs de x-as. De y-as worden uitgezet met behulp van het nummer b-scan en de oogzenuw wordt vervolgens gebruikt voor het definiëren van het startpunt, waarmee een goed positie van de oogzenuw aan de oorsprong op de y-as. Identificatie van de oogzenuw in elke gegevensverzameling kunt follow-up beelden op betrouwbare wijze worden uitgelijnd.
- Injectie OCT postbeelden te bekijken en noteer alle identificeerbare bezienswaardigheden, zoals de ONH of bloedvaten in het netvlies. Plaats vervolgens de muis voor het verkrijgen van een follow-up SD-OCT uit dezelfde regio, en zorg ervoor dat u de zelfde identificeerbare bezienswaardigheden.
- De omvang van de injectieplaats op de maagwand beeld mapping
- Post injectie rechthoekig volume OCT om te bevestigen het succes van de injectie uit te voeren. Volg de methode die wordt beschreven in 3.6.
- Gebruik de remklauw functie in de software te identificeren van het omslagpunt bij de grens van het vrijstaande netvlies uit een aantal b-scans verspreid over het gehele OCT beeld. Gebruik de methode om het openen van de remklauwen beschreven 4.1.4.
- De beelden van de fundus met de toegewezen locatie van de OCT b-scan en de bijbehorende positie van de remklauw op het beeld van de maagwand, die overeenkomt met de locatie opnemen.
- Compileer alle fundus beelden in een samengestelde afbeelding, met inbegrip van de remklauw posities, wat in een nauwkeurige kaart van de injectieplaats op het beeld van de fundus (voorbeeld in Figuur 5Asectie vertegenwoordiger resultaten resulteert).
5. intraoculaire injecties
Opmerking: Informatie over het gebruik van de RIS zijn verder uitgewerkt in een recente studie23.
- Voorbereiding van glas injectie naalden
- Autoclaaf het capillair buizen met door samensmelting van filamenten in kleine batches, met behulp van de droge cyclus.
- Gebruik een pipet trekker en set-up een programma dat een glas tip met de scherpste hoek, en een diameter in het bereik van 2-5 µm produceren zal.
Opmerking: Een monster 5 stap-programma dat effectieve naalden op onze pipet trekker geproduceerd wordt weergegeven in tabel 1. - Bewaar de getrokken glas naalden in een steriele Pipetteer naald pot bij kamertemperatuur.
- Vul de injectie naald met de gewenste oplossing voor injectie
- Monteer de naald in de naald houder, verlaten ongeveer 5/8" uitsteken voorbij het einde van de houder.
Opmerking: A afstand minder dan 5/8" maakt het moeilijk bereiken de oplossing van de injectie te vullen van de naald, omdat de naald houder past niet gemakkelijk in de opening van 0,2 mL tubes. Tevens, having de naald die meer dan 5/8" resulteert in aanzienlijk grotere trilling of precessie van de tip, waardoor real-time imaging moeilijk omdat het tip laat het brandvlak of het beeldveld (FOV), opgetreden bij het aanprikken van het oog uitsteken. - Bereid de oplossing van de injectie in een steriele 0,2 mL-buis. Toevoegen van een 1:10 verdunning van steriele fluoresceïne-sulfaat (10 mg/mL in 1 x PBS) aan de oplossing van de injectie te verkrijgen van een eindconcentratie van fluoresceïne bij 1 mg/mL.
Opmerking: De exacte kleurstof gebruikt kan is specifiek voor de gebruiker en iets dat is niet-toxisch en zichtbaar met het blote oog onder wit licht verlichting om te vergemakkelijken van de precieze plaatsing van de tip van de naald op het niveau van de RPE en subretinal ruimte. - Visualiseer de naald door de stereomicroscoop terwijl het plaatsen van de naald, zodat het wordt uitgelijnd met het midden van de buis met de oplossing van de injectie moet worden gebruikt voor het vullen van de naald met de knoppen van de controle van de 3-as micromanipulator.
- Zorgvuldig rijden de naald-tip in de 0,2 mL-buis totdat de punt van de naald wordt ondergedompeld in de vloeistof. Het gewenste volume van injectie vloeistof (bijvoorbeeld 1 µL) opstellen in de naald nodig is voor een enkele injectie. Het behouden van de resterende oplossing in de buis geplaatst in ijs.
- Monteer de naald in de naald houder, verlaten ongeveer 5/8" uitsteken voorbij het einde van de houder.
- Voorbereiding van het dier voor injectie
Opmerking: de RIS-Microscoop is schoon, en is een contactloze systeem. De verwarmingsplaat is voorzien van een schoon adsorberende pad en naalden worden gesteriliseerde met autoclaaf voorafgaand aan wordt getrokken. Nadat zij worden opgehaald door een zelfstandige steriliserende verwarmd metalen strook, worden ze gehouden in een gesloten gesteriliseerde kamer ontworpen om te houden van getrokken glas naalden. De naalden worden alleen behandeld met gehandschoende handen en zorg wordt gebruikt om te voorkomen dat het aanraken van het uiteinde van de naald terwijl mounten in de houder. De geïnjecteerde oplossingen worden bereid met steriele techniek, en worden getest op de besmetting door een steekproef van de voorbereidingen van het virus op LB agar platen strepen en broeden ze over nacht bij 37 ˚C.- Weeg het dier (g) om te bepalen van de juiste dosis van verdoving pijnstiller.
- Beheren van verdoving (2,5% oplossing van gebufferde 2,2,2-tribromoethyl alcohol (Avertin)) via intraperitoneale injectie (IP).
- Onmiddellijk Anticholinergica drugs (bijvoorbeeld cyclopentylate) van toepassing op beide ogen verwijden van de leerlingen.
- Trim van het dier snorharen en nummer van het dier met oor punch of andere methode.
- Het wassen van het oog en de omgeving met verdunde betadine.
Opmerking: Voorkomen dat je van elke oplossing rond de neus, want dit leiden onbedoelde verdrinking tot kan. - Plaats de muis op de verwarming pad, gehandhaafd op 39 ˚C, in de pre-gevormde modeler klei muishouder met het oog om te worden geïnjecteerd richting de naald.
- Zorg ervoor dat de muis niet reageert met een snuifje test van de achterste voet.
- Uitvoeren van subretinal injectie
- Gebruik een paar van steriele botte iris verlostang ertoe voorzichtig proptosis van de wereld door het plaatsen van de tips van de verlostang op 7 en 10 uur posities op de deksels van de oog te duwen, terwijl open en neerwaartse op hetzelfde moment.
- Gebruik de verlostang om te overhalen de oogleden onder het oog globe te houden uit het stopcontact tijdens de injectie.
Opmerking: Dieren 10 tot 14 dagen oud zal gemakkelijker dan oudere dieren vaak het oog uit het stopcontact. - De tip van de naald ongeveer 1-1,5 mm onder de rand van het hoornvlies limbus direct en zorgvuldig in het oog door het bindvlies rijden, totdat het creëert een scleral depressie als de naald in het weefsel van de sclera doordringt, en manipulatie van het oog.
- Het draaien van het oog naar beneden met de micromanipulator om te visualiseren de scleral depressie door de verwijde pupil met de stereomicroscoop van RIS.
- Toepassing van een daling van steriele eye gel of 1 x PBS oplossing en bedek met een steriele dekglaasje aan.
- Focus op de scleral depressie, gemaakt door de punt van de naald (2-5 µm) en rijden de naald toekomen tot een scherpe piek van het netvlies vormen op de injectieplaats.
- De naald met behulp van de houder totdat de tip via de sclera verveelt en de fluoresceïne in de naald zichtbaar onder het netvlies in de onmiddellijke nabijheid van de RPE cel enkelgelaagde is draaien.
- De tip van de naald rijden, dus is het raakvlak aan de hele wereld en activeert u vervolgens de inspuitpomp met het pedaal voetschakelaar.
- Nadat het gewenste volume is afgeleverd (0.5-1 µL) naar de subretinal ruimte, trekken de naald en controleren of de bleb stabiel is en die vloeistof doet niet lekken uit de injectieplaats, die het eerste criterium voor een succesvolle injectie is.
Opmerking: Behoud van een goede tip diameter is (2-5 µm diameter) van cruciaal belang om te voorkomen lekkage van de injectieplaats. - Plaats het dier op de imaging platform van de OCT-instrument. Volg de aanwijzingen voor het HR-SD OCT Imaging als u wilt opnemen van de afbeelding van een rechthoekig volume.
- Bevestigen dat de ingespoten vloeistof bevindt zich in de subretinal ruimte en sparen de beelden voor het bepalen van de omvang van de bleb.
- Het dier van de houder verwijderen en een ruime hoeveelheid antibiotica zalf toepassen met de ingespoten ogen.
- Plaats het dier naar een verwarming pad tot het volledig herstelt, dan plaatst u deze terug in de oorspronkelijke kooi waar het uit kwam.
Opmerking: Onze dieren zijn meestal geïnjecteerd voorafgaand aan de spenen, moeten de dieren worden geretourneerd naar de kooi met de moeder.
- De omvang van de subretinal bleb met behulp van OCT instrument softwaretools in kaart te brengen.
- Verkrijgen van een rechthoekig volume OCT beeld, met behulp van de methoden die eerder zijn beschreven van de bleb en het tot een herkenbaar oriëntatiepunt in het oog zoals de ONH plaats.
Opmerking: Opname van 90 b-scans werkt goed voor de toewijzing van de bleb, maar afhankelijk van de gewenste resolutie kan worden gebruikt. - Een enkele remklauw toevoegen aan de afbeelding en plaats deze op het omslagpunt waar het netvlies los van het vaatvlies en RPE.
Opmerking: Een overeenkomstige punt de software automatisch toegewezen aan een lijn op de afbeelding van de fundus van de remklauw en de b-scan wordt geëvalueerd. - Vastleggen van het scherm na plaatsing van de remklauwen en compileren van de beelden om effectief wijzen aan de rand van de injectie bleb op het beeld van de maagwand, die juist de kaarten van de injectieplaats. De gecompileerde afbeelding opslaan voor referentie om te helpen bij het lokaliseren van de regio's van belang tijdens de follow-up imaging.
Opmerking: Als alternatief, de remklauw gegevens kunnen worden opgeslagen, in acht genomen en uitgezet met behulp van een soortgelijke methode voor plotting 3D datasets van ONL dikte.
- Verkrijgen van een rechthoekig volume OCT beeld, met behulp van de methoden die eerder zijn beschreven van de bleb en het tot een herkenbaar oriëntatiepunt in het oog zoals de ONH plaats.
- Intravitreal injectie
- Plaats de punt van de naald met behulp van een soortgelijke chirurgische aanpak als sub retinale injectie, behalve dat de naald wordt gedreven volledig via de sclera op de pars plana ongeveer 0,25 mm achter het hoornvlies limbus en in het glasvocht.
- Na de plaatsing van de naald, de injectie pols van toepassing met het voetpedaal.
Opmerking: Een snelle verspreiding van de kleurstof fluoresceïne gedurende het glasvocht van de oogschelp wordt waargenomen, vullen de verwijde pupil diafragma met fluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van de aanwezigheid, de snelheid en de uniformiteit van de buitenste Retina degeneratie Model
Metingen van de ONL werden geregistreerd van de OPL naar de ELM, vaststelling van de grenzen van de ONL met het gereedschap van de remklauw waarin de software instrument. Het doel was om de progressie van de buitenste Retina degeneratie in een muismodel gedeeltelijk gehumaniseerd adRP in kaart. Vergelijkbare beelden van een controle C57BL/6(J) muis en een hC1/hC1 / / mWT/mWT muismodel, uitdrukken van twee exemplaren van de mutant menselijke staaf opsin (RHOP347S) genen, bleken te vertonen zowel de retinale bevindingen van de controle en die van een ernstige en snel progressieve Retina degeneratieve voorwaarde. De 3-week-oude adRP (hC1 x BL/6(J)) dier, hebben slechts één exemplaar van het gemuteerde gen voor menselijke RHO,P347S en twee exemplaren van de muis WT RHO genen, had in de buurt van normale ONL dikte. Echter scant de follow-up HR-SD-OCT op 10 en 37 weken aangetoonde stoffelijk progressieve en ruimtelijk uniforme Retina degeneratie dat in ongeveer 60% verlies van researchdieren erkend resulteerde als ONL uitdunnen over deze periode. In de hC1 x BL/6(J) adRP model heeft de degeneratie van het netvlies een constante (1/e) met de geschatte tijd van 13 weken. Homozygoot hC1 dieren, met twee doses van de giftige mutant menselijke transgenic op de muis WT RHO achtergrond, lijden een veel snellere degeneratie, zoals blijkt uit uitgebreide retinale dunner en de in wezen volledig verlies van alle researchdieren door 3 weken van leeftijd (Figuur 2).
De ONL-maatregel is slechts één onderdeel van de buitenste retinale normaliteit als een index van fotoreceptor vitaliteit. De OSL van de researchdieren en de innerlijke segment/buitenste segment (IS / OS) of ellipsoïde regel leveren bewijs ter ondersteuning van zowel fotoreceptor vitaliteit en functie. Vergelijkingen in dieren die aan een (N129R - x 129R-) of twee (2HRho 1T1T) kopieën (doses) van de menselijke genen WT RHO op de muis WT RHO knock-out achtergrond bevatten zijn gefokt werden gemeten voor de dikte van de buitenste netvlies. Een statistisch significante toename van ~ 8 µm in de ONL werd waargenomen in muizen met twee kopieën van de menselijke WT RHO gen in vergelijking met muizen met slechts één exemplaar van het menselijke gen. Een statistisch significante toename van ~ 5 µm in de OSL werd waargenomen in muizen met twee vs. één exemplaar van het menselijke WT RHO gen op de muis WT RHO knock-out achtergrond. Een voorbeeld van hoe ONL en OSL metingen zijn verricht is afgebeeld in Figuur 3. De hoge resolutie van de opnamen die zijn gemaakt met de HR-SD-OCT-systeem toestaan nauwkeurige metingen van de ONL of OSL waardoor discriminatie van kleine verschillen met stevige statistische betrouwbaarheid in de gehumaniseerd WT RHO Muismodellen.
Waaier van chirurgische resultaten gedetailleerde door LGO wanneer u probeert Subretinal injectie
HR-SD-OCT evaluatie van poging tot subretinal injecties leverde een scala aan resultaten. Ten eerste, de meest voorkomende ervaring was bevestiging dat de ingespoten vloeistof werd met succes afgeleverd binnen de sub retinale ruimte. De opening van de impliciete subretinal ruimte (die wordt gesloten tijdens ontwikkeling) gemaakt een bleb dat kan duidelijk worden gevisualiseerd, zowel in de weergave van de nl-gezicht van de HR-SD-LGO en in de b-scan beelden. De hypo-reflecterende vloeistof werd begrensd door de neurale netvlies boven en de hyper-reflectieve RPE cellaag nog tegen BM, hieronder (Figuur 4). De omvang van de subretinal injectie kon worden vastgesteld als het dier werd door HR-SD-OCT beeld onmiddellijk na injectie (zie hieronder). Ten tweede, de injectie kan optreden in de choroidal ruimte (onder BM) in plaats van in de subretinal ruimte. Dit resulteerde in een hyper-reflectieve laag (RPE) begrenzen de koepel van de vloeistof-ontheemd regio van het netvlies, en geen hyper-reflectiviteit op de achterste limieten van het oog in de LGO b-scans. Derde, een andere potentiële resultaat die optreden kan tijdens een poging van subretinal injectie was een retinale schisis (splitsen) bij de zenuw vezel laag. Dit resultaat leverde een normale buitenste netvlies anatomie, maar de binnenste laag van het netvlies ingekapseld de bleb, die al dan niet het glasvocht kan zijn binnengedrongen. In beginsel, dergelijke een schisis patroon kan optreden met injectie overal binnen de lamineringen van het juiste neurale netvlies, maar we alleen zenuw vezel laag schisis tot nu toe hebben gezien. Ten vierde, een intravitreal injectie kan zich ook voordoen, die heeft geen invloed op de LGO. Al deze tekortkomingen resulteren uit de eerste omdat het puntje van het glas naald of misschien sommige kleine beweging van de naald tijdens injectie, als gevolg van het hoofd van de druk van de geschakelde stroom injectie apparaat.
Karakterisering van de locatie van Subretinal injectie
Een kritische factor bij het bepalen van de werkzaamheid of toxiciteit van kandidaat-therapieën is de mogelijkheid om het vergelijken van retinale gebieden die vector vs heb ontvangen die dat niet hebben. We aanzienlijke inspanningen gericht op het ontwikkelen van een middel om de regio van het netvlies die betrokken zijn bij de subretinal injecties markeren, zodat tijdens de follow-up onderzoeken, we de areal omvang van het netvlies waar therapieën werden toegepast identificeren kunnen, en vandaar waar transductie was haalbaar. Gouden NPs toegestaan een hoge mate van vertrouwen in het identificeren van de regio's van het netvlies die waren of niet werden ingespoten. Echter leek de specifieke deeltjes of hun formulering te zijn giftig en heeft geleid tot een ernstige gelokaliseerde Retina degeneratie op de site van subretinal injectie door 24 uur bericht injectie (gegevens niet worden weergegeven). Daarom ontwikkelden we een alternatieve methode voor het toewijzen van de injectieplaats rechtstreeks vanuit de HR-SD-OCT imaging gegevens. Een methode voor het precies identificeren van de grenzen van de site injectie werd ontwikkeld met behulp van de meetinstrumenten (remklauwen) in het softwarepakket van het instrument (Figuur 5). We kunnen de rand van de bleb identificeren juist door het onderzoek van de individuele b-scans (vanaf inferieur aan superieure netvlies) gebruikt voor het maken van de fundus-afbeelding. Bij het plaatsen van een remklauw op het punt waar de bleb het bijgevoegde netvlies snijdt, is de positie van de remklauw automatisch toegewezen op de overeenkomstige b-scan van de afbeelding van de fundus nl gezicht op de precieze positie langs de x-as waar de remklauw was Geplaatst op de b-scan. Herhaling van dit proces maakt het mogelijk om de rand van de bleb op een beeld van de fundus nl gezicht volgen. Het uitlijning proces vereist dat vergelijkbare regio's van het netvlies zijn beeld telkens ten opzichte van de constante oogzenuw hoofd, en de beelden die wellicht draaien om het uitlijnen van de retinale bloedvaten uit de meerdere beelden voorafgaand aan gegevens segregatie. Na het uitlijning proces van het post injectie beeld en de daaropvolgende follow-up beelden was de injectie regio bovenliggende voorbij het gegevensraster van de punt aan het identificeren van de positie van de metingen binnen de regio betrokken in het netvlies detachement. Deze gegevens kan worden uitgezet als een oppervlak kaart, die een visueel hulpmiddel ter identificatie van de gegevenspunten inclusief de injectieplaats ten opzichte van gebieden buiten de injectieplaats.
Mapping van de ONL-dikte in 3D
Tot slot, we opnemen van metingen van de ONL, OSL of andere retinale lagen van in de gehele verbeelde regio van het netvlies, en vervolgens de gegevens met behulp van een oppervlakte perceel (Figuur 5) uitzetten. De kaart van de grens van de injectieplaats boven elkaar plaatsen kunt de segregatie van de twee gegevensverzamelingen, met inbegrip van de ingespoten en de regio die was niet los tijdens de injectie. Verdere kan verwerking en data-analyse worden uitgevoerd op deze twee gegevensverzamelingen voor het testen van hypothesen dat specifieke therapeutische agenten kunnen Retina degeneratie redden of induceren van toxiciteit. Deze aanpak mogelijk zorgt voor experimentele en controle gegevens worden verzameld uit een enkel oog, ingespoten versus niet-ingespoten regio's van de dezelfde oog te vergelijken.
Figuur 1 : UHR-SD-OCT apparaat. Het HR-SD-OCT-apparaat gebruikt wordt. Het instrument rack (A) bevat de computermonitor van (een), het toetsenbord en muis (b), de sonde interface-box (c), de OCT-motor (d), de computer (e), het bedieningsorgaan voor de super verlichte emitterende diodes (infrarood) (f), en de uninterruptible power supply (g). De optische Bank (B) bevat het imaging sonde optische hoofd (voor muis netvlies) (h), de multi-as (lineaire en rotatie) manipulator (ik), en een muis onderwerp (j). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Progressieve buitenste Retina degeneratie in gedeeltelijk gehumaniseerd adRP model zoals gemeten door HR-SD-oktober (A) HR-SD-OCT beelden van het netvlies werden verkregen voor het adRP-model (hC1 x BL/6 (J)) op verschillende leeftijden, het besturingselement C57BL/6(J) op 14 weken en de lijn homozygoot hC1 mutant op 3 weken. Het buitenste netvlies had een normale verschijning op 3 weken in het adRP-model, maar er was bewijs van progressieve ONL dunner en desorganisatie at en verder 10 weken oud. Met 37 weken, de (hC1 x BL/6(J)) aangetoond uitgebreide buitenste Retina degeneratie. Alle OCT scans werden in de nabijheid van de oogzenuw. (B) de dikte van de ONL (in mm) langs de horizontale as door de oogzenuw was uitgezet voor controle (C57BL/6(J)), hC1 en adRP dieren van verschillende leeftijden. Er was een progressief verlies van ONL dikte in het gedeeltelijk gehumaniseerd adRP model. ONL verlies was groter is dan 60% door de leeftijd van 37 weken. Foutbalken = standaardafwijking van het gemiddelde. Rode schaal bar = 200 µm en alle afbeeldingen zijn dezelfde schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kwantitatieve metingen van nucleaire buitenlaag en Outer segment lengte met behulp van HR-SD-oktober (A) muis lijnen gebruikt om aan te tonen van ONL en OSL maatregelen. Vertegenwoordiger OCT beelden van 2HRho1T/1T (2 doseringen HRho) op muis RHO knock-out achtergrond) (links panel) en N129R - x 129R-(één dosis menselijke RHO op muis RHO knock-out achtergrond) (rechts paneel). (B) een voorbeeld van hoe de remklauwen werden geplaatst om te meten de ONL (rood) en de OSL (blauw) wordt weergegeven. (C) de gegevens afkomstig van drie dieren van elke regel voor ONL dikte was uitgezet in staafdiagram formaat die de vergelijking van 2HRho1T/1T lijn en N129R - x 129R-(linkerdeel). De 2HRho1T/1T lijn heeft ~ 8 µm dikker ONL. Om aan te tonen verschillen in OSL, werden meerdere metingen (zeven) gemaakt van een b-scan van elke regel van de muis van de ELM bij de BM zoals in B (blauwe lijn) in 9 weken oude dieren (rechts paneel). Dit een ~ 5 µm verschil in de OSL tussen dieren met 1 vs 2 kopieën van het gen HRho aangetoond. ONL zowel de OSL-maatregelen waren statistisch significant, ONL p-waarde = 1.7e-5 en OSL p-waarde = 6.4e-5. Foutbalken = standaardafwijking van het gemiddelde. Rode schaal bar = 100 µm zowel de b-scans in 3A hebben dezelfde schaal, 3B is uitgezoomd om duidelijkheid van de retinale lagen en te zorgen voor een kwalitatieve demonstratie van hoe de metingen werden verworven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Soorten intraoculaire injecties in muizen geïdentificeerd door HR-SD-oktober (A). A (hC1xBL/6(J)) muis werd geïnjecteerd met ~ 1 µL van vloeistof via Inferonasal transcleral transchoroidal injectie. De resulterende retinale detachement wordt gezien als de groene lagere juiste regio van de nl afbeelding, maken een scherpe rand aan de voorrand van de bleb aan de rechterkant van de afbeelding. De OCT fundus afbeelding van een injectieplaats vertoont slechts subtiele verschillen afhankelijk van de positie van de vloeistof gevulde holte, want het beeld een compilatie van alle de b-scans van de gehele netvlies dikte is. Daarnaast verandert de injectie bleb de afstand van het netvlies oppervlak van de OCT zendspoel, produceren een ongericht regio op de injectieplaats. (B) de OCT b-scan van een niet-ingespoten netvlies is aangetoond. De ONH heet. (C) A subretinal injectie wordt aangetoond. De ONH heet en pijlen in de nl gezicht afbeelding (juiste panelen) wijzen naar de achterste rand van het detachement. (D) een choroidal injectie wordt aangetoond met een duidelijke verhoging (opwaartse verplaatsing) van de RPE laag (hyper-reflectieve kromme) van de onderrand van het netvlies (pijlen) en verlies van hyper-reflectiviteit van de RPE en choroideus lagen hieronder de geïnjecteerde vloeistof. Vergelijk pijlen in de beelden (C vs. D). (E) A retinale schisis is aangetoond in de buurt van de zenuw vezel laag. De zeer dunne hyper-reflectieve membraan inkapselen van de geïnjecteerde vloeistof, terwijl het netvlies blijft gekoppeld aan de RPE observeren. Subtiele verschillen tussen de drie verschillende detachementen kunnen ook worden gevisualiseerd in de nl gezicht beelden (C, D, en E). De subretinal detachement heeft een grens die moeilijk is te visualiseren (pijlen in C), terwijl de choroidal injectie een wazig hyper reflecterende rand op de voorrand van de bleb maakt en de retinale schisis is duidelijk door de scherpe afbakening van de toonaangevende (E). Beide rode balken schaal = 200 µm in 4B. Alle beelden 4B via 4E even worden geschaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Mapping en kwantificeren van de buitenste Retinal wijzigingen na Subretinal injectie. Een methode ontwikkeld om te identificeren gebieden van belang bij follow-up onderzoek van muizen die had subretinal injectie van vector, met 3D-plotten van ONL metingen uit meerdere OCT b-scans. Een 2HRho1T/1T dier werd geïnjecteerd met een zelf-complementaire adeno-associated virus uiten GFP zowel de voorsprong kandidaat hammerhead Ribozym (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (OS eye) in een scherm van toxiciteit. (A) Imaged onmiddellijk na, de areal omvang van de injectie werd in kaart gebracht door het plaatsen van de remklauwen op de voorrand van de bleb op het punt waar de buitenste segmenten scheiden van de RPE in de b-scans (linker paneel (rode remklauw)). De positie van de remklauw gereedschap wordt automatisch toegewezen aan de maagwand afbeelding, en dit is herhaald en samengesteld voor zoveel b-scans als dit nodig is, die afhankelijk van de gewenste resolutie (elke 5th scan in (A) (rechtervenster)). Latere OCT studies (elke 2 weken) beeld dezelfde regio van het netvlies dat superpositie; de ONH en netvlies bloedvaten zijn monumenten ter vergemakkelijking van de Cartesische of roterende aanpassingen. De hele regio van het netvlies werd gemeten voor ONL dikte, mits de vereiste grenzen (OPL en ELM) zichtbaar waren. (B) de ONL-lengte over de ingespoten oppervlak de remklauw posities (met kleurcode) worden opnieuw toegewezen op het beeld van de fundus en gecompileerd tot een samengestelde afbeelding toewijzen. Elke 5th b-scan van de OCT beelden werd gemeten met ingebouwde remklauwen op maximaal tien punten over het netvlies. (C) pre-en post gecompileerde beelden zijn gedraaid, met behulp van beeldbewerkingssoftware retinale therapieën, waardoor gegevenspunten binnen het netvlies vrijstaande netvlies regio worden geïdentificeerd door de beeldoverlay en gescheiden worden uitgelijnd. (D) de gegevens set is toegewezen in een tabelindeling, identiek aan de maagwand afbeelding matrix, en verdeeld in twee groepen (metingen binnen de bleb (rode hoogtepunten) en die niet). (E) gegevens wordt gepresenteerd met behulp van een 3D-oppervlak plotting functie, waarmee visualisatie van ONL dikte over de hele verbeelde regio. Hierdoor kan de beoordeling van de kwantitatieve verschillen tussen ingespoten en niet-ingespoten regio's van het oog. De spleet in de 3D-plot (E) biedt een handige manier om te scheiden van de gegevensset van ONL metingen binnen de regio van het vrijstaande netvlies uit de regio die bleef verbonden onmiddellijk na injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: programma gebruikt voor het trekken van de glas-naalden. Programma-parameters om glas naalden nuttig voor subretinal door trans-scleral, transchoroidal benadering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-OCT biedt een eenvoudige methode voor karakterisering van mogelijke dierlijke modellen van ziekten bij de mens om te bepalen hun nut in het testen van potentiële therapeutics. De mogelijkheid om snel en betrouwbaar kenmerkend zijn voor een potentiële diermodel van ziekten bij de mens is essentieel voor het proces van therapeutische drugontdekking (bijvoorbeeldvervanging gentherapie, Ribozym of shRNA vechtpartij gentherapie, gecombineerde gentherapie). HR-SD-OCT biedt een eenvoudige, snelle en niet-invasieve methode voor de evaluatie van de retinale gezondheid die kan worden gebruikt voor het karakteriseren en controleren van de progressie van de retina degeneratie in bijna elke muismodel. De OCT beelden kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van de metingen van een of alle van de verschillende lagen van het netvlies, die een gedetailleerde beoordeling van een degeneratie van de buitenste retinal (fotoreceptor) na verloop van tijd of het effect van therapeutische redding pogingen over de degeneratie verschaffen kunnen omvang of kinetische tijdlijn. HR-SD-OCT kan ook worden gebruikt ter beoordeling van de toxiciteit van geleverde vector- of materialen. De meest significante impact op een fotoreceptor Retina degeneratie onderzoeksprogramma is de mogelijkheid om verfijnde metingen van ONL na verloop van tijd in levende dieren. Een kunt een Retina degeneratie tijdlijn uitzetten uitpakken een tijdconstante, oftewel een kritieke eerste stap om te evalueren van de werkzaamheid en de toxiciteit van kandidaat-therapeutics in de dezelfde modellen over een temporele venster therapeutische kansen. Deze technologie voorziet ook in aanzienlijke besparingen van kostbare middelen (dieren en tijd) ten opzichte van de klassieke eindpunt histologie doordat de onderzoeker te identificeren van afwijkingen in de dierlijke cohort voorafgaand aan een studie en elimineren van dieren die niet aan experimentele voldoen (bijvoorbeeld, succesvolle subretinal levering).
De behoefte aan nauwkeurige levering van bepaalde therapeutics in de subretinal ruimte van het oog van de muis is uitdagend, en HR-SD-OCT biedt een accurate visuele bevestiging van succesvolle subretinal injecties als een criterium voor de lopende opname van dieren in de Preklinische studie ontwerp. Uitgebreide inspanning is vereist om te volgen vaak dieren geïnjecteerd in gen therapie studies na verloop van tijd, aangezien deze modellen vaak simuleren retinale degeneratieve ziekten bij de mens waar de ziekte tijdlijnen decennia ontstaan. Talrijke follow-up onderzoeken zijn nodig om te bepalen van de therapeutische werkzaamheid of om te beoordelen van de toxiciteit. Een oplossing voor deze belangrijke uitdaging is de mogelijkheid hebben te identificeren en verwijderen van dieren van studie ontwerpen, die chirurgische mislukkingen voor levering van de therapeutische vector. De mogelijkheid om een succesvolle injectie leveren voor een goed opgeleide technicus met jarenlange ervaring heeft 90% benaderd als injecteren van één oog per dier, en ongeveer 80% succes als injecteren van beide ogen. Met dit efficiëntieniveau is verwijdering van de studie ontwerp van dieren met mislukte injecties voordelig voor de hypothese testen. Dit is niet alleen bespaart u kritieke tijd, maar ook zorgt voor meer consistente en voorspelbare resultaten. Bovendien, HR-SD-OCT kunt één te verminderen van het aantal dieren moet voor elke één experiment doordat dezelfde dieren worden gevolgd na verloop van tijd, dat de variabiliteit van de dier-aan-dier in beide experimentele vermindert en controlegroepen en meer robuuste statistische beoordeling van hypothesen over de mogelijke werkzaamheid en toxiciteit van kandidaat-therapeutics.
De omvang van de retinale dekking door een subretinal injectie is meestal niet 100%, hetgeen mogelijk zelf giftige31,32,33,34. Vandaar, het vermogen om te onderscheiden tussen getransduceerde en niet-getransduceerde regio's is cruciaal voor goed testen van hypothesen van reddings- en toxiciteit voor een bepaalde kandidaat therapeutische. Het creatieve gebruik van beschikbare softwaretools zorgt voor nauwkeurige toewijzing van subretinal injecties in het oog van de muis. De onmiddellijke beeldvorming van het geïnjecteerde oog geeft richting voor follow-up imaging aan regio's van belang, en de mogelijkheid om het vergelijken van de regio's die hebben al getransduceerde naar regio's die niet zijn behandeld binnen de dezelfde wereld. Afhankelijk van de toewijzing precisie gewenst, dit proces kan worden uitgevoerd voor elke b-scan of periodiek bemonstering van het ensemble van b-scans verzameld onmiddellijk bericht injectie en alle afbeeldingen van de fundus in een enkel beeld met behulp van grafische software zo te compileren dat de stuksgewijs continu grens is zorgvuldig toegewezen op het beeld van de maagwand. Vergelijking van de beelden van onmiddellijk na injectie aan follow-up beelden vereist dat de beelden worden uitgelijnd zodat meting posities kunnen worden toegewezen op de maagwand beeld, en de gegevenspunten kunnen worden gescheiden in de injectieplaats en niet-ingespoten regio's van de netvlies. De toewijzing van het hoofd van de oogzenuw en de retinale bloedvaten kan ook worden bereikt met behulp van deze dezelfde methodiek, die bij de oriëntatie van het oog helpt bij een poging om de afbeeldingen na injectie met latere follow-up afbeeldingen uitlijnen. Deze informatie kan worden gebruikt in latere imaging te identificeren van de regio van het netvlies waar de injectie had plaatsgevonden. Natuurlijk, wanneer de dieren zijn euthanized, kan de locatie van de expressie van EGFP, geleverd door een vector van AAV ook met een kandidaat-therapeutische gen (bijvoorbeeld, Ribozym), ook worden gebruikt om de locatie van de transductie vergelijken met het gebied bepaald door afbeelding met hyperlinks die afhankelijk van de locatie van de bloedvaten is. Hierdoor zal de identificatie van de verspreiding van de vector in de nadien gesloten subretinal ruimte buiten gebieden van anatomische onthechting.
Ons succes met het gebruik van goud NPs voor het label van de subretinal bleb werd beperkt door toxiciteit geïnduceerd door de gebruikte materialen. Wij raden het verdere onderzoek van dergelijk materiaal op het etiket van de omvang van subretinal blebs, als alternatieve preparaten (wisselende afmetingen, oppervlakte wijzigingen) kunnen worden gevonden die doen niet het induceren van toxiciteit.
De HR-SD-OCT biedt een enorme hoeveelheid informatie met aanzienlijk minder tijd en middelen, en met meer informatie over de werkzaamheid en toxiciteit van potentiële therapeutics in vergelijking met traditionele methoden zoals histologie kan worden quantitated. Het gebruik van deze technologie kan de onderzoeker te verzachten een van de ernstige knelpunten in preklinische retinale drug discovery35. De muis RIS en HR-SD-OCT zijn krachtige hulpmiddelen op de steun van preklinische retinale gene therapie studies als een onderdeel van onze RNA drugontdekking-programma. Deze hulpprogramma's kunnen in het algemeen worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Commerciële relaties: MCB: None; JMS: geen. De retinale imaging systeem (RIS)23 gebruikt in deze studie is een nieuw apparaat van substantieel gebruik aan elke groep willen voeren gene therapie levering studies in muizen, knaagdieren of kleine dieren. Terwijl de auteurs er geen conflicten optreden te verklaren met betrekking tot dit apparaat op dit moment, de University at Buffalo - SUNY en de veteranen administratie rechten hebben in de intellectuele eigendom en kan proberen te commercialiseren van dit instrument in de toekomst.
Acknowledgments
Dit materiaal is gebaseerd op het werk, gedeeltelijk ondersteund door het Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, Office of Research en ontwikkeling (biomedische laboratoriumonderzoek en ontwikkeling) (VA verdienste Grant 1I01BX000669). JMS werkzaam is, gedeeltelijk als personeel arts-wetenschapper, oogheelkunde, door VA WNY; MCB is gedeeltelijk in dienst van VA WNY. De studie werd uitgevoerd bij, en deels gesteund door de veteranen administratie Western New York gezondheidszorg systeem (Buffalo, NY). Inhoud geven niet de standpunten van het Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten. Ook ondersteund, in groot deel, door de NIH/NEI R01 verlenen EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 verlenen EY016662 (UB Vision infrastructuur Center, PI: M slachten, directeur - Biophotonics Module: JMS), een onbeperkte subsidie aan de afdeling oogheelkunde/Universiteit van Buffalo van onderzoek te voorkomen blindheid (New York, NY), en een subsidie van de Oishei Foundation (Buffalo, NY). Wij erkennen de gave van de hC1 transgene RHOP347S lijn en de exon 1 muis RHO knockout van Dr. Janis Lem (Tufts-New England Medical Center, Boston, MA), en de gave van de NHR-E transgenic model in de heterozygoot staat op de muis exon 2 RHO knock-out achtergrond uit Drs. G. Jane Farrar en Peter Humphries (Trinity College in Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
