Summary
여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.
Abstract
HR-SD-10 월은 라이브 마우스 모델에서 포토 리셉터 변성의 진행을 모니터링, 평가 subretinal 공간으로 치료제의 배달 독성과 효능에서 vivo에서평가 하 고 활용. HR-SD-10 월 적외선 (800-880 nm) 근처를 사용 하 고 광학 특히 하위 2 미크론 축 해상도 마우스 눈의 독특한 광학에 대 한 설계 되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델 외부 망막 (포토 리셉터) 변성 및 컨트롤의 질병의 진행을 평가 하기 위해 몇 군데 있었다. 가져온된 유리 바늘 제공 adeno 관련 바이러스 (AAV) 또는 나노 (NP) 를 통해 하위 망막 주사 트랜스 scleral 트랜스 안 접근 하 사용 되었다. Subretinal 공간으로 바늘의 위치 주의 하위 망막 공간으로 액체를 제공 하는 보정된 압력 주입 전에 필요 했다. 실시간으로 subretinal 수술 이미징 시스템 (RIS) 우리의 망막에 실시 됐다. HR-SD-10 월 시연 한 독성 돌연변이 인간 돌연변이 rhodopsin (P347S)의 표현으로 인해 진보적인 유니폼 망막 변성 (P347S) transgene 쥐에서. HR-SD-10 월 모든 망막 층의 엄격한 정량화를 허용 한다. 외부 핵 층 (ONL) 두께 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 길이 (OSL) 측정 포토 리셉터 활력, 변성, 또는 구조와 연관. RIS 배달 시스템 수 있습니다 subretinal 주사의 실시간 시각화 신생아 (~ P10-14) 또는 성인 쥐, 및 10 월 HR-SD 즉시 배달의 성공을 결정 하 고 지도 영역 범위. 10 월 인사-SD 대뇌 비보의 활력 측정 또한 쥐, subretinal 수술의 성공을 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. HR-SD-10 월 망막 변성, 독성, 그리고 전 임상 유전자 치료 연구에서 치료 구조의 정도 평가 하기 위해 균일 한 동물 동료를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간의 질병1,2,,34 에 대 한 치료로 번역 하는 새로운 치료의 희망으로 망막과 망막 퇴행 성 질병의 다양 한 유전자 요법을 개발 하는 연구원 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. 시간 영역 또는 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 외부 망막 변성 질환12,13,14의 특정 마우스 모델의 측면을 조사 하는 데 사용 되었습니다 . 그러나 HR-SD-10 월, 되지 않았습니다 광범위 하 게 속도 망막 변성의 공간적 균일성을 결정 하기 위해 최적화 마우스 모델의 평가의 맥락에서 사용 또는 유전자의 전 임상 평가의 맥락에서 기반 치료제, 예를 구조, 독성, 또는 벡터 배달8,,1516의 공간 범위를 평가 합니다. 일단 마우스 모델 특징 완전히 HR-SD-10 월 데이터 구조 또는 망막 변성17의 마우스 모델에서 독성을 발휘 하는 치료제의 영향을 측정 하는 유익 하 고 신뢰할 수 있는 리소스로 사용할 수 있습니다. 많은 그룹은 대뇌와 망막 안료 상피 (RPE) 셀 시험에 그것의 효율성 때문에 벡터 배달의 방법으로 subretinal 주입을 사용 하 여. 그러나, 그것은 일반적으로 각 막 표면에서 직접 수술에 의해 수행 하 고 백 내장, 출혈, 그리고 뒷부분의 조작 하면 발생 하는 의도 하지 않은 망막 분리에 따른 자주 다 마스터, 어려운 방법 남아 유리. 많은 그룹은 여전히 맹목적으로 subretinal 주사를 시도 하 고 비교적 큰 직경 스테인리스 바늘 (34g)8,,1718,19와 수동 주사를 사용 하 여 바이러스를 전달 ,20,,2122, 그리고 몇 사용 광학 일관성 단층 촬영 (10 월) 망막8,17, 에 벡터의 적절 한 배달 확인을 이미징 20 , 22. 몇 가지 개선 방법에는 최근 설명 눈금 바늘 micromanipulator22에 의해 주도 사용 하 여.
우리는 바늘의 위치에서 에이즈는 통합 된 접근 방식을 제시 하 고 주사 사용자 지정 지시 스테레오 ophthalmoscope 마우스17, 의 작은 눈 내 머릿속에 맞게 실험실에서 설계에 의해 촉진 된다 23. stereotaxic micromanipulator와 함께에서 가져온된 유리 마이크로 바늘의 사용 이전에 바늘 배치 필요 (즉, conjunctivae 및 결합 조직 통해) 아래로 수술 커트의 더 나은 제어를 제공 사출입니다. 압력의 사용 규제 마이크로 인젝터 도움이 제공 일관 된 주입 볼륨, 그리고 주사 훨씬 더 중대 한 안정성, 정밀, 그리고 휴대용 주사기, 감소에 의해 수행 하는 수동 주사 보다 훨씬 더 느리게 할 수 있는 눈에 거품 주입 발생 작은 바늘 경로가 자체 봉인 때문에 바늘 철수에 따라 누설을 방지할 수 있습니다. 사출/배달의 정도 평가 하기 위해 많은 조사 그룹 찾기 및 실험 끝에 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식 (식 구조는 벡터에 의해 전달) 망막에서의 면적 범위를 평가에 의존 (안락사) 성공적인 주사11,19,,2024확인 가리킵니다. 이 접근 (10 월을 활용 하지) 수술 성공 이후 수술 (알 수 없음된) 오류와 함께 모든 동물 필요가 유지 될 때까지 반복 측정을 가진 뒤 수술 절차 시간에 동물, 엄청난 양의 자원 낭비 확인 안락사와 눈 추수 (때 EGFP 측정 된다). 주사 (즉 subretinal 공간) 망막의 정확한 레이어 사이 보여주는 시간-SD-10 월을 사용 하 여 망막에 주입의 위치 확인을 개선할 수 있습니다. 10 월 인사-SD 즉시 접근 향상을 실제 수술 시간 관련 변수를 식별 하기 위해 (수술 실패) 시도 실패 윤곽을 그리 다 사용할 수 있습니다. 우리는 HR-SD-10 월 이점을 제공 합니다 수많은 임상 유전자에서 치료 연구 외부 망막 변성의 급속 한 양적 평가 함으로써 식별/실험 기준 ( 에 부합 하지 않는 연구 동물의 도태 수 발견 예를 들어, 잘못 된 subretinal 주입), 직접 어디 벡터 (여기서 전 임상 효과 가장 가능성이) 배달 되었다 눈의 지역에 따라 영상으로 벡터 배달 되지 않았습니다 영역을 제어 하 고. 개발 이후 SD OCT를 사용 하 여 허용 하 고 안과 연구자에 의해 사용을 계속 하고있다 그리고 이제 마우스 또는 설치류 모델13,25에서 망막 과학적 연구에서 망막 이미징의 표준으로 간주 됩니다. 10 월 인사-SD 및 그것의 소프트웨어 기능을 동물 모델 선택, 선택에 변성의 특성을 포함 하 여 프로세스의 모든 단계에서 마우스 모델에서 성공적인 정량 유전자 치료의 목표를 추가로 독특한 통합 방식에서 이용 하였다 질병 모델, 치료 배달, 벡터를 전달 하며, 독성/효능 평가의 매핑. HR-SD-OCT를 사용 하 여 프로세스의 모든 수준에서 더 효율적인 약물 발견에 대 한 수 있습니다. 여기 우리의 RNA 약물 발견 프로그램에 사용 되는 이러한 접근 방법을 설명 합니다.
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Protocol
동물 프로토콜 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용의 버지니아 WNY HCS와 버팔로 SUNY에서 대학 위원회에 의해 승인 했다. 동물 협회의 규정에 따라 연구 비전 및 안과 (ARVO)와 헬싱키의 선언에 사용 했습니다.
1. 마우스 모델
- 마우스 컨트롤을 포함 하 여 평가 모델을 식별 합니다.
참고: 이미지는 C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT에 대 한 수행/mWT, 부분적으로 인간 답게 마우스 망막 변성 모델 homozygous 인간의 돌연변이 P347S hC1 대립 야생-타입 (WT)에 대 한 마우스 로+ + 유전자 형26 , 27, hC1 BL/6(J), 돌연변이 인간 로P347S hC1 대립 유전자의 WT 마우스 로단일 복사본을 사용 하 여 부분적으로 인간 답게 모델 x+ + 유전자 (hC1 /-/ / mWT/mWT) (hC1/hC1 / / mWT로 얻은/C57BL/6 (mWT J) 쥐)입니다. 상 염색체 지배적인 망막 화 (adRP) 위의 모델은 C57BL/6(J) 배경. 마우스 모델 homozygous 마우스 로 녹아웃 배경 인간의 WT 유전자의 두 복사본을 또한 사용된28,29이었다. 이 줄은 129Sv 배경. 이 선 129Sv 배경에서 마우스로 녹아웃으로 교차 했다 때 인간 노 의 단 하나의 복용량 마우스로 배경에서 발생 합니다. - 동물 실험 설계에 관련 된 조건에 따라 유지.
참고: 동물에는 수의 의료 단위 (VMU) 버지니아 WNY HCS에 유지 되었다. 마우스는 표준 연구소 차 우와 성장된 12 h:12 h 빛 루 했다: 소프트 형광 오버 헤드가 어두운 사이클 백색 약 72 ˚F에서 케이지 수준에서 약 300 럭 스와 조명.
2. 마우스 아이 젤
- 망막 이미징30 및 수술 절차에 사용 되는 광학 젤을 준비 합니다.
- 2 mg/mL w/v 높은 분자량 (살 균 1 인산 Buffered 식 염 수 (PBS) x 4 x 106 g/mol carbomer 결합.
- 실 온에서 혼합 점성 광학 투명 한 젤을 형성 하는 젤까지.
- 젤 작은 불 임 병에 전송 하 고 덫을 놓은 기포 제거를 350 x g에서 스윙 양동이 탁상 원심 분리기에 원심.
- 젤 마우스 각 막과 프리미엄 커버 유리 (18 x 18 mm) 사이의 인터페이스를 만들려면 각 막에 직접 적용 됩니다.
3. HR SD 10 월 영상
- HR-SD-10 월 장치 (그림 1)을 참조 하십시오.
- 마 취의 적절 한 복용량을 결정 하기 위해 동물의 무게. 버퍼링 된 2,2,2-tribromoethyl 알콜 (Avertin) 솔루션을 통해 복 주입 (IP)의 2.5% 솔루션의 몸 무게의 25 µ L/g를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 그리고 동물 움직일 후 눈동자를 팽창 하는 안 약을 추가 합니다.
- 동물 발가락 핀치에 의해 완전히 마 취를 확인 하 고 특정 동물 반응 하지 않습니다.
- 수염을 정돈 하 고 10 월 HR-SD 썰매에 마우스를 놓습니다.
- 마우스의 눈 바로 투구 렌즈 앞 놓고 각 막 및 홍 채 위치 될 때까지 단계 컨트롤을 조작 합니다. 각 막 인공 눈물을 적용 하 여 수산화 유지.
참고: 10 월 HR-SD 썰매에 미세 조정 micromanipulators 눈동자 조리개 중심 고 지향 되도록 마우스를 위치 하는 데 사용 됩니다. 광학 투구 망막 표시 됩니다 때까지 동물은 최상의 가능한 이미지를 조정 더 고급 다음입니다. - 첫째, 소프트웨어 프로그램 "마우스"를 열고 "환자/시험"을 클릭 합니다. 둘째, "환자 추가"를 클릭 하 고 새 환자 창에서 동물을 식별 하기 위해 관련 정보를 입력 및 "저장 하 고 종료". 셋째, "추가 시험" 뒤에 "시작 시험" 클릭 합니다. 넷째, "추가 사용자 지정 검사" 클릭 하 고 "직사각형 볼륨"을 선택, 몇 군데 되 고 눈에 대 한 OD 또는 운영 체제를 선택한 다음 "시험 추가"를 클릭. 마지막으로, 악기를 목표로 하 고 관심 영역을 얻기 위해 동물 위치를 시작 합니다. 올바른 영역을 찾는 더 이미지 품질을 향상 시키기 위해 이미지 수집 직전에 주걱을 밀고 메 마른 목화를 사용 하 여 눈 표면에서 어떤 과잉 액체를 제거 "스냅숏 시작", 그리고 좋은 이미지를 얻을 클릭 한 후 "저장 스캔 "입니다.
참고: 직사각형 HR-SD-10 월 이미지에 대 한 일반 매개 변수는 900 a-스캔/b-스캔 및 90 b-스캔/이미지. 수집 된 이미지는 1.4 m m x 1.4 m m입니다. 몇 군데 망막의 지역 특정 실험에 따라 달라 집니다 하지만 대부분의 이미지는 시 신경 머리 (ONH)으로.
4. 존재, 속도, 및 모델 외부 망막 유년의 균일성 평가
- HR-SD-10 월에 의해 외부 망막 변성 모델 평가
- 동물을 제어 및 존재, 속도, 그리고 외부 망막 변성의 균일성을 평가 하기 위해 실험 과목에 대 한 연령대의 다양 한 스펙트럼을 얻습니다.
- 두 동료 (질병 및 정상)에서 각 나이에 여러 동물에 HR-SD-10 월 이미지를 수행 합니다. 3.1.6에 설명 된 메서드를 사용 하 여 OCT 이미지를.
참고: 다양 한 기간 (1 년)에 걸친 생일 배포, 한 번에 동물의 대형 코 호트에서 데이터를 수집할 수 있습니다 또는 동물의 작은 코 호트 시간 (1 년) 유사한 결과 얻기 위해 오랜 기간 동안 여러 개의 이미지를 수집 하는 데 사용할 수 있습니다. - 기록 된 시간-SD-10 월 직사각형 볼륨 이미지를 열고 첫 번째 b-스캔 측정 식별 (이상적으로 포함 됩니다는 ONH 또는 다른 식별 랜드마크) 이미지의 앙상블에서. 확대/축소 기능을 사용 하 여 소프트웨어에서 화면을 채우기 위해 이미지를 확대.
- B-스캔 이미지를 클릭 하 고 다음 "캘리퍼스" 클릭 하 고 마지막으로 원하는 대로 많은 캘리퍼스를 클릭 하 여 캘리퍼스의 원하는 번호를 엽니다 (그들은 1-10 매겨집니다). 그는 캘리퍼스는 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시를 확인 하십시오. 할당 "캘리퍼스 구성" 기능을 사용 하 여 각 블록 및 망막에 걸쳐 균일 한 배치를 촉진 하기 위하여 마지막으로, 클릭 "표시 캘리퍼스 위치" 설정에서 "수직"으로 모두 적용.
참고: 1세인트 캘리퍼스 쏟아지는 덱스터 (OD) 오른쪽 눈을 처리할 때 이미지의 왼쪽에 배치 해야 하 고 쏟아지는 불길 한 (OS) 왼쪽된 눈 이미지를 처리할 때 1세인트 캘리퍼스는 이미지의 오른쪽에 배치 되어야 합니다. 이 결과 코에 왼쪽과 오른쪽 눈에 대 한 모든 데이터의 임시 방향 플롯할 때 었 어 요. - B-스캔, 그것은 포함 하는 b-스캔 이미지에 시 신경 머리의 센터에서 한 캘리퍼스를 배치 해야 되 고 걸쳐 각 캘리퍼스 (2.0 m m 간격) 원하는 위치로 이동 컴퓨터 마우스를 사용 하 여 (이 캘리퍼스 0으로 설정). 다음 마우스를 사용 하 여 클릭 하 여 관심 영역을 스팬 길이 캘리퍼스를 끕니다. 임의로 캘리퍼스는 b-최대 길이 검사의 측정 영역을 오버레이 및 데이터 분석 중에 무시 하지 않는 설정.
- 외부 제한 막 (느릅나무)와 외부 plexiform 레이어 (OPL)의 하단에 스크류의 하단에는 캘리퍼스의 상단 배치 하 여 캘리퍼스 도구를 사용 하 여 ONL 두께 측정 합니다. 0.2 m m 씩 증가에서 망막에 걸쳐이 각 캘리퍼스에 대 한 반복 합니다. 측정을 저장 합니다.
- 후 모든 캘리퍼스 배치 되었고 크기 조정, 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 한 "캘리퍼스 데이터 저장"을 클릭 합니다.
- 이후 b-스캔 (각 10회 잘 작품 검색) 같은 직사각형 볼륨 열 등 우수한 지역에서 전체 망막에 걸친 10 월 이미지에서에서 측정을 반복 합니다. 캘리퍼스는 개방적이 고 x 축에 동일한 위치에 유지 됩니다. X-방향으로 그들을 이동 하지 않고는 캘리퍼스의 길이 조정 합니다.
- 데이터 처리 b-스캔 옆 작은 파일 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일과 "데이터 이동"을 클릭 합니다 저장을 엽니다. 클릭 "파일을 저장, 시간에 따라 순서 대로 정렬 하 여 각 b-스캔 측정에 대 한 모든 파일을 열고 수정한 날짜.
- 프레임 번호를 기준으로 가장 낮은 순서에서 단일 파일로 각 b-스캔에서 원시 데이터를 컴파일하십시오. "캘리퍼스 이름", "길이", 및 "센터 X" 포함 하는 데이터의 열을 선택 합니다.
- 센터 X 모든 b-스캔 각 직사각형 볼륨 10 월 이미지 처리에 대 한 측정도 마찬가지 인지 확인 합니다. 측정, 기록 하는 데 사용 되지 않은 캘리퍼스에서 모든 데이터를 삭제 하 고 캘리퍼스 0 시 신경 머리의 가운데에 위치를 설정 합니다.
- 여러 Y 데이터 세트는 ONL의 전체 두께를 3 차원 플롯 기능을 대 X에 대 한 데이터 또는 다른 망막 층을 측정 합니다.
- ONL 측정 제어와 속도 어떤 잠재적인 망막 변성의 균일성을 확인 하기 위해 해당 연령대와 실험 동물 사이 비교.
- OSL 측정 같은 b-스캔 이미지를 사용 하 여 프로세스를 반복 합니다. ONL 느릅나무와 Bruch의 막 (BM) 사이 캘리퍼스 배치를 제외 하 고 측정 하는 데 사용 하는 동일한 방법론을 따릅니다.
참고: 캘리퍼스를 배치 하는 방법의 예는 대표적인 결과 섹션 (그림 3B)에 표시 됩니다. 이 오류를 줄이는 것에 확대 된 이미지에 행해져야 한다. - 각 실험 모두 생일 및 제어 동료에 대 한 여러 동물에 대 한 데이터 분석을 반복 합니다.
- 종합 측정 및 3D 매핑 소프트웨어 캘리퍼스 도구를 사용 하 여 ONL 또는 OSL 두께의
- 포스트 주입 10 월 이미지를 검토 하 고 어떤 식별할 수 있는, ONH 또는 혈관 망막에서의 기록. 다음 후속 SD 10 월 같은 지역에서 취득 하 고 같은 식별 랜드마크를 포함 해야 합니다. 마우스를를 놓습니다.
참고: 몇 군데와 망막에는 망막의 지역 포스트 주입 SD 10 월 이미지에서 식별 됩니다 확인 하십시오. 직사각형 볼륨 SD 10 월 이미지를 기록 하 고 그것을 저장 합니다. - 위의 단계에서 설명한 대로 기록 된 이미지를 처리 4.1.3. 를 4.1.14. 캘리퍼스 데이터 및 위에서 설명한 대로 도면을 저장 합니다.
참고: ONL 측정의 결과 배열 ONL 두께 묘사한 3D 플롯을 만드는 데 사용 됩니다. X 축 따라 캘리퍼스의 위치 하나 replot 시 신경 축의 원점 (0)에 배치 하는 그래프를 허용 합니다. Y b-스캔 수를 사용 하 여 플롯은 시 신경은 다음 제대로 시 신경에 y 축 원점에 위치 한 시작 지점을 정의 하는 데 사용 됩니다. 각 데이터 세트에서 시 신경 식별 후속 이미지를를 안정적으로 정렬 될 수 있습니다.
- 포스트 주입 10 월 이미지를 검토 하 고 어떤 식별할 수 있는, ONH 또는 혈관 망막에서의 기록. 다음 후속 SD 10 월 같은 지역에서 취득 하 고 같은 식별 랜드마크를 포함 해야 합니다. 마우스를를 놓습니다.
- 저 이미지에 사출 사이트의 범위를 매핑
- 포스트 주입 직사각형 볼륨 10 월 주사의 성공을 확인을 수행 합니다. 설명 하는 방법을 따라 3.6.
- 소프트웨어에서 캘리퍼스 기능을 사용 하 여 b-스캔 전체 10 월 이미지에 걸친 수에서 분리 된 망막의 경계에서 굴절 지점을 식별. 메서드를 사용 하 여 열에 설명 된 캘리퍼스 4.1.4.
- 저 이미지 10 월 b-스캔 및 해당 위치 하는 저 이미지에 해당 캘리퍼스 위치 매핑된 위치를 기록 합니다.
- 합성 이미지, 캘리퍼스 위치를 포함 하 여 저 이미지 (예를 들어 그림 5A대표 결과 섹션에)에 사출 사이트의 정확한 지도에 결과에 모든 저 이미지를 컴파일하십시오.
5. 안 구내 주사
참고: RIS의 사용에 세부 사항 더 최근 연구23에 정교.
- 유리 주사 바늘 준비
- 오토 클레이 브는 모 세관 튜브 건조 사이클을 사용 하 여 작은 배치에서 필 라 멘 트와 함께 합니다.
- 사용 하 여 피 펫 끌어당기는 사람 및 설정 프로그램을 날카로운 각도와 2-5 µ m의 범위에서 직경 유리 팁을 생산할 예정 이다.
참고: 우리의 피 펫 끌어당기는 사람에 효과적인 바늘 제작 샘플 5 단계 프로그램은 표 1에 표시 됩니다. - 실 온에서 피 펫 멸 균 바늘 항아리에서 가져온된 유리 바늘을 저장 합니다.
- 주입 바늘 주입에 대 한 원하는 솔루션 작성
- 바늘 홀더, 떠나 약 5/8"튀어나온 소유자의 끝에 바늘을 탑재 합니다.
참고: A 거리 5/8"만들 것입니다 그것은 어려운 도달 하는 것 보다는 바늘을 채우기 위해 주입 솔루션 바늘 홀더 0.2 mL 튜브의 오프닝으로 쉽게 적합 하지 않습니다 때문에. 또한, 5/8"상당히 큰 발진 또는 선행 팁, 실시간 이미징 어려운 이후 만들기 팁 찔린 눈을 동안 초점 비행기 또는 시야 (FOV), 잎의 결과 보다 더 내 다 니 데. - 살 균 0.2 mL 튜브에 주입 솔루션을 준비 합니다. 추가 1시 10분 희석 fluorescein 1 mg/mL에서의 최종 농도를 주입 솔루션에 살 균 fluorescein 황산 (1 x PBS에 10 mg/mL)의.
참고: 정확한 염료 사용 사용자에만 적용 되 고 비 독성 및 RPE의 subretinal 공간 수준에서 바늘 팁의 정확한 배치를 용이 하 게 도와 흰 빛 조명 아래 육안으로 표시 하는 것을 수 있습니다. - 스테레오 현미경을 통해 바늘을 작성 하는 데 사용할 주입 솔루션을 포함 하는 관의 센터에 부합 되도록 바늘을 위치를 3 축 micromanipulator의 컨트롤 노브를 사용 하는 동안 바늘을 시각화.
- 바늘의 팁은 액체에 빠져들 때까지 조심 스럽게 0.2 mL 튜브에 바늘 팁 드라이브. 필요한 단일 주사 바늘으로 주입 액체 (예: 1 µ L)의 원하는 볼륨을 그립니다. 얼음에 튜브에서 나머지 솔루션을 유지 관리 합니다.
- 바늘 홀더, 떠나 약 5/8"튀어나온 소유자의 끝에 바늘을 탑재 합니다.
- 동물 주사에 대 한 준비
참고: RIS 현미경, 깨끗 하 게 유지 되 고 비 접촉 시스템. 바늘은 이전에 끌려가고 압력가 및 난방 접시 깨끗 한 adsorbent 패드로 덮여 있다. 후 그들은 자체 살 균가 열된 금속 스트립에 의해, 그들은 닫힌된 멸 균된 챔버 가져온된 유리 바늘을 개최 하도록 설계 되었습니다에 보관 됩니다. 바늘만 gloved 손을 사용 하 여 처리 그리고 배려 보유자에 장착 하는 동안 바늘의 팁을 감동 방지 하기 위해 사용 됩니다. 주입된 솔루션 무 균 기술을 사용 하 여 준비 하 고 파운드 한 천 배지 위에 바이러스 준비의 샘플을 줄이 고 37 ˚C에서 밤에 그들을 배양 하 여 오염에 대 한 테스트.- 무게 (g) 동물 마 취 진통의 적절 한 복용량을 결정.
- 복 마 취 (버퍼 2,2,2-tribromoethyl 알콜 (Avertin)의 2.5% 솔루션)을 통해 주입 (IP)를 관리 합니다.
- 즉시 두 눈은 눈동자를 팽창을 anticholinergic 약물 (예: cyclopentylate) 적용 됩니다.
- 동물의 수염을 정돈 하 고 동물 귀 펀치 또는 다른 메서드를 사용 하 여 번호.
- 씻고 눈과 희석된 betadine와 주변 지역.
참고: 하지 마십시오 어떤 솔루션, 코 주위를 지 고이 실수로 익사에서 발생할 수 있습니다. - 에 바늘으로 주입을 눈으로 미리 성형된 모델러 클레이 마우스 홀더 39 ˚C 유지 열 패드에 마우스를 놓습니다.
- 마우스 뒷 다리의 핀치 테스트를 사용 하 여 응답 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
- Subretinal 주입 수행
- 살 균 무딘 아이리스 집게의 쌍을 사용 하 여 부드럽게 동시에 오픈 하 고 하향 7와 10 시 위치를 밀어 눈 뚜껑에 집게의 끝을 배치 하 여 세계의 proptosis 유도.
- 집게를 사용 하 여 소켓 주입 과정에서 그것을 지키려고 눈 세계 아래 눈 꺼 풀을 동축 케이블.
참고: 동물 10 ~ 14 일 자주 개최 한다 눈 소켓에서 오래 된 동물 보다는 더 쉽게. - 각 막 limbus 가장자리 아래 약 1-1.5 m m 바늘의 팁을 직접 하 고 신중 하 게 바늘 sclera, 조직으로 침투 하 고 눈의 조작 수 scleral 우울증 생성 될 때까지 결 막 통한 눈으로 드라이브.
- RIS 스테레오 현미경으로 넓혀 진된 눈동자를 통해 scleral 우울증을 시각화 micromanipulator 아래쪽으로 눈을 돌립니다.
- 메 마른 눈 젤 또는 PBS 솔루션 및 살 균 coverslip 커버 x 1의 방울을 적용 합니다.
- 바늘 주사 사이트에서 망막 형태의 날카로운 피크까지 앞으로 바늘 (2-5 µ m)과 드라이브의 끝에 의해 만들어진 scleral 우울증에 초점.
- 팁은 sclera 통해 한 거죠 고 바늘에 fluorescein RPE 세포 단층의 바로 근처에서 망막 아래 표시 될 때까지 소유자를 사용 하 여 바늘을 회전 합니다.
- 그래서 그것은 세계에 접선 바늘의 끝을 드라이브 하 고 발 페달 스위치와 함께 주입 펌프를 활성화.
- 원하는 볼륨을 전달한 후 (0.5-1 µ L) subretinal 공간 바늘을 철회 하 고는 bleb 안정적 이며 성공적인 주입의 첫 번째 기준은 사출 사이트에서 그 유체 누설 하지 않는 경우를 확인 하십시오.
참고: 적절 한 팁 직경을 유지 (2-5 µ m 직경)이 주사 사이트에서 누설을 피하기 위해 중요 합니다. - 10 월 악기의 이미징 플랫폼에 동물을 놓습니다. HR-SD 10 월 직사각형 볼륨 이미지를 기록 하기 위해 이미징에 대 한 지침을 따릅니다.
- bleb의 범위를 결정 하기 위한 이미지 저장 subretinal 공간에 주입 된 액체 위치 되는지 확인 합니다.
- 소유자에서 동물을 제거 하 고 항생제 연 고의 충분 한 양이 주입된 눈에 적용.
- 그것은 완전히 복구 하 고, 그 어디에서 온 원래 케이지에 다시 배치 될 때까지 난방 패드에 동물을 놓습니다.
참고: 우리의 동물 이유 전에 일반적으로 주사 된다, 따라서 동물 필요 어머니와 감 금 소에 반환.
- 정도 subretinal bleb 10 월 악기 소프트웨어 도구를 사용 하 여 매핑.
- bleb의 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 사각형 볼륨 10 월 이미지를 인식할 수 있는 랜드마크는 ONH 같은 눈 내를 포함 하도록 위치.
참고: 90 b-스캔 녹음 작품은 bleb을 매핑하기 위한 잘 하지만 원하는 해상도에 따라 사용할 수 있습니다. - 단일 캘리퍼스는 그림을 추가 하 고 망막 RPE 및 맥락 막에서 분리 하는 굴절 지점에 놓습니다.
참고: 소프트웨어 해당 포인트를 캘리퍼스 및 평가 되 고 b-스캔을 나타내는 저 이미지에 라인에 자동으로 매핑합니다. - 캘리퍼스의 배치에 따라 화면 캡처하고 이미지 정확 하 게 주사 부 지도 저 이미지에 주입 bleb의 테두리를 효과적으로 지도를 컴파일하십시오. 컴파일된 이미지 후속 영상 중 관심 영역을 찾기에 대 한 참조를 저장 합니다.
참고: 또한, 캘리퍼스 데이터 저장 될 수 있다, 준수, 및 ONL 두께의 3 차원 그리기 데이터 집합에 대 한 비슷한 메서드를 사용 하 여 플롯.
- bleb의 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 사각형 볼륨 10 월 이미지를 인식할 수 있는 랜드마크는 ONH 같은 눈 내를 포함 하도록 위치.
- Intravitreal 주입
- 제외 하 고는 바늘 동위 플 막 limbus 뒤에 및 유리 체에 약 0.25 m m에서 완전히 sclera를 통해 구동 됩니다 비슷한 수술 접근법을 사용 하 여 하위 망막 주입으로 바늘의 끝을 놓습니다.
- 바늘 배치에 따라 분사 펄스 발 페달으로 적용 됩니다.
참고: 형광으로 넓혀 진된 눈동자 조리개를 채워는 아이피의 유리 체에 걸쳐 fluorescein 염료의 급속 한 확산은 관찰 된다.
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Representative Results
존재, 속도 모델 외부 망막 변성의 균일성 평가
측정은 ONL의 느릅나무, ONL 악기 소프트웨어에서 제공 하는 캘리퍼스 도구를 사용 하 여의 한계를 정의 하는 OPL에서 기록 되었다. 목표는 부분적으로 인간 답게 adRP 마우스 모델에서 외부 망막 변성의 진행을 지도 했다. 제어 C57BL/6(J) 마우스를 hC1/hC1 / / mWT 비교 이미지/mWT 마우스 모델, 돌연변이 인간 막대 opsin (로P347S) 유전자의 두 복사본을 표현 제어 망막 연구 결과 그의 심각한 전시를 표시 했다 고 급속 하 게 진보적인 망막 퇴행 성 조건입니다. 3 주 된 adRP (BL/6(J)) 동물, 돌연변이 인간 로P347S 유전자의 단일 복사본만 있고 마우스 WT로 유전자의 두 복사본 x hC1 정상적인 ONL 두께 근처 했다. 그러나, 후속 인사-SD-OCT 10, 37 주 시연된 일시적으로 진보 하 고 공간적으로 균일 한 망막 변성 ONL이 시간 프레임 동안 숱이로 인식 하는 대뇌의 약 60% 손실에 결과에서 검색 합니다. BL/6(J) adRP 모델 x hC1 망막 변성에 13 주 대략적인 시간 상수 (1/e) 합니다. Homozygous hC1 동물 마우스 WT 배경, 독성 돌연변이 인간 transgene의 2 개의 복용량과 고통을 같이 광범위 한 망막 대머리와 모든 대뇌의 근본적으로 완전 한 손실에 의해 3에 의해 훨씬 더 급속 한 변성 주 세 (그림 2).
ONL 측정 포토 리셉터 활력의 색인으로 외부 망막 정상의 한 구성 요소입니다. 대뇌와 내부 세그먼트/외부 세그먼트의 OSL (IS / OS) 둥글지 선 포토 리셉터 생명력과 기능을 지 원하는 증거를 제공. 하나 (N129R-x 129R-) 또는 (2HRho 1T1T)의 복사본 두 개 (복용량) 마우스 WT로 녹아웃 배경에 인간의 WT 유전자를 사육 동물에 비교 외부 망막 두께 측정 되었다. 생쥐와 인간 유전자의 복사본을 하나만 마우스에 비해 인간의 WT 유전자의 두 복사본에 ONL에 ~ 8 µ m의 통계적으로 유의 한 증가 관찰 되었다. 통계적으로 유의 한 증가 OSL에서 ~ 5 µ m의 마우스 WT로 녹아웃 배경에 인간의 WT 유전자의 1 개의 사본을 대 두와 쥐에서 관찰 되었다. 어떻게 ONL 및 OSL 측정 되었다의 예는 그림 3에 표시 됩니다. HR-SD-10 월에 시스템과 함께 캡처 이미지의 높은 해상도 ONL 또는 OSL humanized WT 마우스 모델에서 단단한 통계 신뢰성과 작은 차이의 차별 허용의 정확한 측정을 허용 합니다.
범위의 수술 결과 세부 10 월에 의해 때 시도 Subretinal 주입
HR-SD-10 월 평가 시도 subretinal 주사의 다양 한 결과 얻지 못했다. 첫째, 가장 일반적인 경험 주입 된 액체는 망막 하 공간 내에서 성공적으로 배달 된 확인 했다. 암시적 subretinal 공간 (개발 중 종료)의 오프닝 인사-SD-10 월의 en 얼굴 보기와 b-스캔 이미지에 명확 하 게 구상 될 수 bleb을 만들었습니다. Hypo-반사 유체 위에서 신경 망막 그리고 BM, (그림 4) 아래에 아직도 반대 하이퍼 반사 RPE 세포 층에 의해 경계 되었다. 정도 subretinal 주입의 경우 동물 했다 주입 (아래 참조) 후 즉시 HR-SD-10 월에 의해 몇 군데 결정 될 수 있습니다. 둘째, 주사 (BM) 아래 안 공간에서 발생할 수 있습니다 보다 subretinal 공간으로. 이 경계는 망막의 액체 난민 지역의 돔 하이퍼 반사 층 (RPE) 귀착되 고 OCT에 눈의 후부 한계에서 하이퍼-반사도 아니 b-스캔. 셋째, subretinal 주입을 시도 하는 동안 발생할 수 있는 다른 잠재적인 결과 이었다 (분할) 신경 섬유 층에 망막 schisis. 이 결과 일반 외부 망막 해부학 굴복 하지만 내부 계층 망막의 캡슐화는 bleb, 또는 유리 체를 침공 하지 않을 수 있습니다. 원칙적으로, schisis 패턴 주입, 신경 망막의 박판 내 어디서 나 발생할 수 있지만 우리가 신경 섬유 층 schisis 최신 본만. 넷째,는 OCT에 영향을 주지 않습니다 있다 intravitreal 주사도 발생할 수 있습니다. 이러한 실패의 모든 전환된 흐름 주입 장치의 압력 머리 때문에 주입 하는 동안 유리 바늘의 팁 또는 바늘의 아마도 몇 가지 작은 모션의 초기 방치에서 유래한 다.
특성화 Subretinal 주입의 위치
효능 또는 후보 치료의 독성을 결정 하는 중요 한 요소는 그 벡터 vs 받은 하지 않은 망막 영역을 비교 기능입니다. 우리는 영역 표시는 망막의 subretinal 주사에 관련 된 후속 시험 동안 치료 적용 된 망막 영역 범위를 확인할 수 있도록 하는 수단을 개발에 상당한 노력을 감독 하 고 따라서 어디 변환 가능 했다입니다. 골드 NPs 또는 주입 했다 망막의 영역을 식별에 대 한 신뢰의 높은 수준의 수 있습니다. 그러나, 특정 입자 또는 그들의 정립 독성과 심한 지역화 된 망막 변성 사이트에서 24 시간 포스트 주입 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 subretinal 주입의 결과 것으로 나타났다. 따라서, 우리는 매핑 HR-SD-10 월 영상 데이터 로부터 직접 사출 사이트의 다른 방법을 개발. 정확 하 게 사출 사이트 경계를 식별 하는 방법 (그림 5) 악기의 소프트웨어 패키지에 측정 도구 (캘리퍼스)를 사용 하 여 개발 되었다. 우리는 개별 b-스캔 (에서 우수한 망막에 열 등 한) 저 이미지를 만드는 데 사용을 검사 하 여 정확 하 게는 bleb의 가장자리를 식별할 수 있는. 캘리퍼스의 위치는 캘리퍼스는 x 축 따라 정확한 위치에 en 얼굴 저 이미지의 해당 b-스캔에 자동으로 매핑되지는 bleb 연결 된 망막을 교차 하는 지점에서 캘리퍼스를 배치할 때 b-스캔에 배치. 이 과정을 반복 하나 en 얼굴 저 이미지에 bleb의 가장자리를 추적할 수 있습니다. 맞춤 과정 망막의 유사한 지역 상수 시 신경에 상대적으로 머리, 및 이미지 데이터를 분리 하기 전에 여러 이미지에서 망막 혈관에 맞게 회전 할 수 있습니다 때마다 몇 군데는 있어야 합니다. 포스트 주입 이미지와 후속 후속 이미지의 맞춤 과정에 따라 주입 지역이 끝났습니다 겹쳐 측정은 망막에 관련 된 지역 내에서 위치를 식별 하기 위해 데이터 포인트 그리드. 이 데이터 맵으로 표면, 사출 사이트 이외의 지역에 상대적으로 사출 사이트 포함 데이터 요소를 식별 하는 시각적 도구를 제공 하는 그릴 수 수 있습니다.
3d에서 ONL 두께 매핑
마지막으로, 우리는 망막의 전체 이미지 영역에 걸쳐는 ONL, OSL, 또는에서 다른 망막 층의 측정을 기록 하 고 표면 플롯 (그림 5)를 사용 하 여 데이터를 플롯. 좋군요 사출 사이트의 국경 지도 삽입 된 지역과 하지 주입 과정에서 분리 된 지역을 포함 하 여 두 데이터 집합의 분리 수 있습니다. 추가 처리 및 데이터 분석 특정 치료제 망막 변성을 구출 수 있습니다 또는 독성을 유발 하는 가설을 테스트 하 두 데이터 집합에서 수행할 수 다음. 이 방법은 잠재적으로 실험과 하나의 눈, 비 주사 주입된 대 지역 같은 눈의 비교에서 수집할된 데이터를 제어 합니다.
그림 1 : 시계-SD-10 월 장치. 사용 시간-SD-10 월 장치 표시 됩니다. (는) 컴퓨터 모니터, 키보드와 마우스 (b), 프로브 인터페이스 상자 (c), OCT 엔진 (d), 컴퓨터 (e), 슈퍼 발광에 대 한 제어 장치를 포함 하는 악기 선반 (A) 발광 다이오드 (적외선) (f), 무정전 전원 공급 (g). 광학 벤치 (B) 포함 (마우스 망막)에 대 한 이미징 프로브 광학 헤드 (h), 다중 축 (선형 및 회전) 조작 (나), 및 마우스 주제 (j). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : HR-SD-10 월으로 측정 된 부분적으로 인간 답게 adRP 모델에서 진보적인 외부 망막 변성 (A) adRP 모델에 대 한 망막의 HR-SD-OCT 이미지 획득 했다 (hC1 BL/6 (J) x) 다양 한 연령대, 14 주, C57BL/6(J) 제어와 3 주에서 homozygous hC1 돌연변이 라인에. 외부 망막 adRP 모델에 3 주에 정상적인 모습을 가졌지만 진보적인 ONL 숱이 해체 그리고 나이의 10 주 넘어의 증거. 37 주, BL/6(J)) 시연 광범위 한 외부 망막 변성 x (hC1. 모든 10 월 검사 시 신경의 주변에 있었다. (B)는 ONL 두께 (mm) 가로 따라 축 시 신경을 통해 컨트롤 (다른 나가의 C57BL/6(J)), hC1, 및 adRP 동물 플롯은. 부분적으로 인간 답게 adRP 모델에 ONL 두께의 진보적인 손실이 했다. ONL 손실의 나이 37 주 60% 보다 큰 했다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류 =. 빨간 눈금 막대 = 200 µ m 그리고 모든 이미지는 같은 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : HR-SD-10 월을 사용 하 여 외부 핵 층 및 외부 세그먼트 길이의 양적 측정 (A) 마우스 라인 ONL OSL 대책을 설명 하는 데 사용. 대표 10 월 2HRho1T/1T (2 복용량 HRho) 마우스로 녹아웃 배경에서에서 이미지) (왼쪽 패널)와 N129R-x 129R-(하나 복용량 마우스로 녹아웃 배경에 인간의 RHO ) (오른쪽 패널). (B) 캘리퍼스 했다 ONL (빨간색) 및 OSL (파란색) 측정을 배치 하는 방법의 예가 표시 됩니다. (C) 데이터 ONL 두께 N129R-x 129R-2HRho1T/1T의 비교를 보여주는 막대 그래프 형태로 표시에 대 한 각 줄의 세 동물에서 얻은 (왼쪽된 패널). 2HRho1T/1T 라인 ~ 8 µ m가 두꺼운 ONL. OSL에서 차이 보여, 여러 측정 (7) B (파란 선)로 BM에는 느릅나무에서 각 마우스 라인에서 하나의 b-스캔에서 9 주 된 동물 (오른쪽 패널)에 만들어졌다. 이 ~ 5 µ m 차이 OSL 1 vs 2 HRho 유전자의 사본 가진 동물을 설명 했다. ONL 및 OSL 조치 했다 통계적, ONL p-값 = 1.7e-5, OSL p-값 = 6.4e-5. 오차 막대는 뜻의 표준 오류 =. 빨간 눈금 막대 100 µ m = 모두 3A에서 b 검사 같은 규모, 3B 망막 층의 선명도 개선 하 고 측정 어떻게 인수 했다의 질적 데모를 제공을 확대 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : HR-SD-10 월으로 식별 하는 쥐에서 안 구내 주사의 종류 (A). A (hC1xBL/6(J)) 마우스 Inferonasal transcleral transchoroidal 주입을 통해 액체의 ~ 1 µ L로 주입 했다. 결과 망막 이미지의 오른쪽에 bleb의 앞 가장자리에 날카로운 테두리를 만드는 en 얼굴 이미지의 녹색 더 낮은 오른쪽 영역으로 볼 수 있다. 10 월 저 이미지는 사출 사이트의 이미지는 모든 b-스캔 전체 망막 두께에서 편집 때문에 액체 채워진된 구멍의 위치에 따라 미묘한 차이 전시 한다. 또한, 주입 bleb OCT 헤드폰을 생산 하는 사출 사이트에 산만된 지역에서 망막 표면 거리를 변경 합니다. (B) 10 월 b-스캔 비 주입의 망막은 설명 했다. ONH 표시 됩니다. (C) A subretinal 주입 시연입니다. ONH 표시 됩니다, 그리고 en 얼굴 이미지 (오른쪽 패널)의 화살표 표시는 초연의 후부 테두리. (D) A 안 주입 RPE (하이퍼 반사 곡선)는 RPE의 하이퍼 반사의 중요 한 손실과 망막 (화살표)의 더 낮은 국경의 레이어와 맥락 막 층 아래의 분명 상승 (상향 변위)로 증명 되는 주입 된 액체입니다. (C 대 D) 이미지에 화살표를 비교 합니다. (E) A 망막 schisis는 신경 섬유 층 가까이 보여 줍니다. 매우 얇은 하이퍼 반사 막 망막 남아는 RPE에 연결 된 동안 주입 된 액체를 캡슐화를 관찰 합니다. 3 다른 분리 사이의 미묘한 차이 또한 en 얼굴 이미지 (C, D, E)에 시각 수 있습니다. Subretinal 분리는 안 주사는 bleb의 앞 가장자리에 흐리게 하이퍼 반사 테두리를 만드는 동안 ( C에서 화살표), 시각화 하기 어려운 국경 그리고 망막 schisis의 날카로운 경계에 의해 분명 하다는 첨단 (E) 둘 다 빨간 바 규모 = 4B에서 200 µ m. 모든 이미지 4B 4E 통해 동일 하 게 축척 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 매핑 및 측정 외부 망막 변화 Subretinal 주입 다음. ONL 측정 여러 10 월 b-스캔에서의 3D 플롯으로 벡터의 subretinal 주입 했다 쥐의 후속 검사 하는 동안 관심의 영역을 식별 하는 방법 개발 되었다. 2HRho1T/1T 동물 자체 보완 adeno 관련 바이러스 GFP와 리드 후보 귀상어 ribozyme (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) 주사 (OS 눈) 독성 화면에서. (A) 군데 직후, 주사의 면적 범위 외부 세그먼트 b-스캔 (왼쪽된 패널 (빨간 캘리퍼스))에서 RPE에서 분리 하는 시점에서 bleb의 앞 가장자리에 캘리퍼스를 배치 하 여 매핑된. 캘리퍼스 도구의 위치는 자동으로 저 이미지에 매핑되고 이것은 반복 하 고 원하는 해상도 (모든 5번째 검사 (A) (오른쪽 패널))에 의존 하는 필요에 따라 많은 b-스캔에 대 한 컴파일된. 이후 10 월 연구 (2 주) 몇 군데 자취; 수 있도록 망막의 같은 지역 ONH 및 망막 혈관 랜드마크 직교 또는 회전 조정을 촉진 하는. 망막의 전체 지역 (OPL 및 느릅나무) 필요한 경계는 볼 수 있었다 제공 ONL 두께 측정 했다. (B) ONL 길이 캘리퍼스 위치 (컬러 코드) 다시 저 이미지에 매핑 및 합성 이미지도 주입 된 표면에 매핑됩니다. 모든 5일 b-스캔 OCT 이미지에서 망막에 걸쳐 최대 10 포인트에 내장 된 캘리퍼스로 측정 되었다. (C) 사전 및 사후 컴파일된 이미지, 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 오버레이 의해 식별 분리 된 망막 영역 망막 내의 데이터 요소를 허용 하 고 분리 된 망막 맥 관 구조에 맞게 회전 합니다. (D) 데이터 세트는 저 이미지 배열에 동일한 테이블 형식으로 매핑되고 두 그룹 (bleb (빨간색 하이라이트)와 하지 않은 측정)으로 나누어. (E) 데이터 전체 이미지 영역에 ONL 두께의 시각화 수 있는 3D 표면 플롯 기능을 사용 하 여 제공 됩니다. 눈의 주입 및 주입 되지 않은 영역 사이의 양적 차이의 평가 수 있습니다. 3D 플롯 (E)에서 틈새 ONL 측정 주입 직후 연결 된 남아 있는 지역에서 분리 된 망막의 지역 내에서 데이터 집합을 분리 하는 편리한 방법을 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 유리 바늘을 사용 하는 프로그램. 트랜스 scleral transchoroidal 접근 방식에 의해 subretinal 유용 유리 바늘을 달성 하기 위해 프로그램 매개 변수.
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Discussion
10 월 인사-SD 잠재적인 치료제 테스트에서 그들의 유용성을 결정 하는 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성에 대 한 간단한 방법을 제공 한다. 신속 하 고 안정적으로 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성 수는 (예를 들어, 교체 유전자 치료, ribozyme 또는 shRNA 최저의 유전자 치료, 결합 된 유전자 치료) 치료 약물 발견의 과정에 중요 합니다. HR-SD-10 월 특성화 및 거의 모든 마우스 모델에서 망막 변성의 진행을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 망막 건강을 평가 하기 위한 간단한, 빠른, 및 비-침략 적 방법을 제공 한다. OCT 이미지 퇴보에 시간이 지남에 따라 외부 망막 (포토 리셉터) 변성의 상세한 평가 또는 치료 구조 시도의 영향을 제공할 수 있습니다. 망막의 다른 층의 일부 또는 전부의 측정을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 범위 또는 운동 타임 라인입니다. 10 월 인사-SD 전달된 벡터 또는 재료의 독성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 포토 리셉터 망막 변성 연구 프로그램에 가장 큰 영향을 생체에 시간이 지남에 ONL의 세련 된 측정을 할 수 있는 능력 이다. 치료 기회의 시간 창에 효능과 같은 모델에서 후보 치료제의 독성을 평가 하는 중요 한 첫 번째 단계는 시간 상수를 추출 하는 망막 변성 타임 라인을 플롯할 수 하나. 이 기술은 또한 수 있습니다 (동물 및 시간) 귀중 한 자원의 상당한 비용 절감을 위한 클래식 끝점 조직학을 기준으로 연구 함으로써 이상 연구를 입력 하 고 동물을 제거 하기 전에 동물 일대에 식별 하는 실험 조건 (예를 들어, 성공적인 subretinal 납품) 맞지 않습니다.
마우스 눈의 subretinal 공간으로 특정 치료제의 정확한 배달에 대 한 필요, 도전 이며 동물에서의 지속적인 포함 조건으로 성공적인 subretinal 주사의 정확한 시각적 확인을 제공 하는 HR-SD-10 월에 전 임상 연구 디자인입니다. 광범위 한 노력이 자주 있기 때문에 이러한 모델은 종종 인간의 망막 퇴행 성 질환 질병 일정 년간 등장 시뮬레이션 시간이 지남에, 유전자 치료 연구에 주입 하는 동물에 따라 필요 합니다. 수많은 후속 시험이 치료 효능을 확인 하기 위해 또는 독성을 평가 하기 위해 필요 합니다. 이 중요 한 문제에 해결책을 식별 하 고 치료 벡터의 배달에 대 한 수술 실패 연구 설계에서 동물을 제거 하는 기능을 것입니다. 두 눈을 주입 하는 경우 동물, 그리고 약 80% 성공 당 한쪽 눈을 주입 하는 경우 년간의 경험과 숙련된 기술자에 대 한 성공적인 사출을 제공할 수 있는 능력 90% 접근 했다. 이 효율 수준으로 실패 한 주사와 동물의 연구 설계에서 제거 가설에 유리 하다. 이 중요 한 시간을 절약할 뿐만 아니라 또한 보다 일관 되 고 예측 가능한 결과 대 한 수 있습니다. 또한 HR-SD-10 월 한 두 실험 동물-동물 다양성 감소 시간이 지남에 따라 같은 동물을 함으로써 어떤 한 실험에 필요한 동물의 수를 감소 및 제어 그룹, 그리고 더 많은 수 잠재적인 효능과 후보 치료제의 독성에 대 한 가설의 강력한 통계 평가.
정도 subretinal 주입에 의해 망막의 아니다 일반적으로 100% 자체 독성31,32,,3334있을 수 있습니다. 따라서, 불리고 비 불리고 지역 사이 구별 하는 능력은 적절 한 치료는 특정된 후보에 대 한 구조 및 독성의 가설의 테스트 중요 합니다. 사용할 수 있는 소프트웨어 도구의 창조적인 사용 마우스 눈에서 subretinal 주사의 정확한 매핑을 허용합니다. 주입 된 눈의 즉각적인 영상 관심, 그리고 동일한 지구 내에서 처리 되지 영역을 불리고 있는 영역을 비교 능력의 영역에 따라 영상에 대 한 방향을 제공 합니다. 원하는 매핑 정밀도 따라 각 b-스캔에 대 한이 프로세스를 수행할 수 있습니다 또는 게시물 주입 하 고 그래서 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 하나의 이미지로 모든 저 이미지 컴파일 즉시 수집 b 검사의 앙상블에서 주기적으로 샘플링 그는 불연속 연속 국경 신중 하 게 저 이미지에 매핑됩니다. 후속의 이미지에 즉시 주입에서 이미지를 비교 측정 위치는 저 이미지에 매핑될 수 있습니다 데이터 포인트 주사 사이트와의 지역 비 주입으로 분리 될 수 있도록 이미지 정렬 될 필요는 망막입니다. 시 신경 머리 및 망막 혈관의 매핑 또한 눈의 방향에 에이즈 이후 후속 이미지 포스트 주입 이미지 정렬 하려고 할 때이 동일한 방법론을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 정보는 주입 발생 했다 망막의 영역을 식별 하 후속 이미징에 사용할 수 있습니다. 물론, 동물 안락사는 때 또한 (예를 들어, ribozyme), 후보 치료 유전자를 포함 하는 AAV 벡터에 의해 전달 EGFP 표현의 위치 사용할 수 있습니다 또한 정한 면적 변환의 위치를 비교 하 혈관의 위치에 의존 하는 이미지 매핑. 이 해부학 초연의 영역을 넘어 이후에 닫힌된 subretinal 공간에서 벡터의 확산의 식별을 허용할 것 이다.
골드의 사용과 우리의 성공 subretinal bleb을 NPs 사용 되는 재료에 의해 유도 된 독성으로 인해 제한 되었습니다. 우리는 독성을 유도 하지 않는 대안 준비 (다양 한 크기, 표면 수정)를 찾을 수 있습니다 하는 경우 레이블을 정도 subretinal blebs의 그러한 자료의 추가 조사를 격려 했다.
HR-SD-10 월 훨씬 적은 시간과 리소스, 엄청난 양의 정보를 제공 하 고 효능 및 조직학 같은 전통적인 방법론에 비해 잠재적인 치료제의 독성에 대 한 자세한 정보를 제공 quantitated 수 있습니다. 이 기술 사용 하 여 전 임상 망막 약물 발견35에 심한 병목 현상의 완화에 연구원을 수 있습니다. 마우스 RIS 및 HR-SD-10 월에는 RNA 약물 발견 프로그램의 구성 요소로 서 전 임상 망막 유전자 치료 연구를 돕기 위해 강력한 도구. 이러한 도구를 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
상업적인 관계: MCB: 없음; JMS: 없음. 이미징 시스템 (RIS)23 이 연구에 사용 된 망막은 쥐, 설치류, 또는 작은 동물에서 유전자 치료 배달 연구 하고자 하는 어떤 그룹에 실질적인 사용의 소설 장치. 저자가이 시간에이 장치에 관하여 선언 하 고 충돌이 동안, SUNY 버팔로-재향 군인의 관리에서 대학 지적 재산에 권한이 고이 악기를 미래에 상용화를 추구 수 있습니다.
Acknowledgments
이 자료는 학과의 재향 군인 담당 (버지니아), 재향 군인의 건강 관리, 사무실의 연구와 개발 (생물 의학 실험실 연구 및 개발)에 의해, 부분적으로, 지원 작업 기반 (VA 공로 그랜트 1I01BX000669). JMS는 고용, 부분적으로로 직원 의사-과학자, 안과, 버지니아 WNY; MCB VA WNY에 의해, 부분적으로, 채택 된다. 연구, 실시 하 고, 참전 용사 관리 서양 뉴욕 의료 시스템 (버팔로, 뉴욕)에 의해 부분적으로 지원 했다. 내용 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다. 도 지원, 주요 부분에서 네이 NIH R01 부여 함으로써 EY013433 (PI: JMS), NIH/네이 R24 부여 EY016662 (UB 비전 인프라 센터, 파이: M 학살, 감독-Biophotonics 모듈: JMS), 무제한 부여 하는 학과의 안과/대학에서 실명 방지 (뉴욕), 연구에서 버팔로 그리고 Oishei 재단 (버팔로, 뉴욕)에서 부여. 우리 인정 hC1 유전자 변형 로P347S 선 및 exon 1 마우스의 선물 (Tufts 뉴잉글랜드 의료 센터, 보스톤, MA), 박사 제 니스 렘에서 로 녹아웃 heterozygous 상태에 NHR E transgene 모델의 선물에는 마우스 exon 2로 녹아웃 배경 박사 G. 제인 파라와 피터 험프리 (삼위일체 대학, 더블린, 분노).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
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