Summary
網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT) を使用してへの新しいアプローチを示します。
Abstract
HR-SD-10 月は、ライブ マウス モデルにおける視細胞変性の進行を監視、下腔への治療薬の配達を評価と毒性と効果体内を評価するために活用されています。HR-SD-10 月近赤外光 (800-880 nm) を使用して、具体的には光学系を持ってサブミクロン 2 軸の解像度を持つマウス眼のユニークな光学系のために設計されています。病気の進行を評価するために外側の網膜 (視細胞) 変性およびコントロールのトランスジェニック マウス モデルをイメージしました。引っ張られたガラスのニードルは、強膜とトランス脈絡膜アプローチ アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) または経由でナノ粒子 (NP) のサブ網膜注射を提供する使用されました。下腔に針の注意位置決めがサブ網膜領域に液体を提供する校正された圧力注入前に必要でした。私たちの網膜イメージング システム (RIS) リアルタイム網膜手術を行った。HR-SD-10 月実証、有害変異人間変異型ロドプシン (P347S) 式のための進歩的な制服網膜変性マウス (RHOP347S) 遺伝子。HR-SD-10 月では、すべての網膜の層の厳密な定量化をことができます。感光体活力、変性、または救助と相関する核外層 (ONL) 厚さと視細胞外側セグメントの長さ (OSL) 測定。RIS 納品システムにより新生児に、網膜下注射のリアルタイム可視化 (~ P10 14) つまりアダルト マウス、および HR SD-10 月配信の成功を決定する地域範囲をマップし、すぐに。HR-SD-OCT は、光受容体の生体の活力を測定するさらにマウスの網膜の手術の成功を評価する強力なツールです。HR SD OCT は、網膜変性、毒性、および前臨床遺伝子治療研究で治療救助の程度を評価する制服動物コホートを識別するために使用もできます。
Introduction
人間の病気1,2,3,4の治療法治療薬に翻訳を期待して様々 な網膜と網膜変性疾患に対する遺伝子治療を開発している研究者,5,6,7,8,9,10,11. 時間領域またはスペクトル領域光干渉断層法 (SD-10 月) は、外側の網膜変性疾患12,13,14 の特定のマウス ・ モデルでの側面を調査する使用されています.HR-SD-10 月、しかし、されていない広範囲率と網膜変性の空間的一様性を決定するマウス モデルの評価を最適化するコンテキストで使用や遺伝子の前臨床評価のコンテキスト ベースなどの治療に救助、毒性、またはベクトル配信8,15,16の空間範囲を評価します。マウス モデルは完全に特徴と、一度 10 月 HR-SD データは救助や網膜変性17のマウス ・ モデルにおける毒性を発揮する治療薬の影響を測定する有益で信頼性の高いリソースとして使用できます。多くのグループは、その視細胞と網膜色素上皮 (RPE) 細胞の伝達効率のためベクトル配信の方法として網膜注入を使用しています。しかし、これはマスターに難しい方法のまま角膜表面から無料手の外科によって通常行われますそれは多くの場合白内障、出血、および単に後方の操作によって発生する意図しない網膜剥離に満ちていることを考える硝子体。多くのグループはまだ盲目的に網膜の注射を試みるし、比較的大径ステンレス針 (34 G)8,17,と18,19 手動の注射を使用してウイルスを提供 ,20,21,22、およびいくつかを使用して光干渉断層計 (OCT) 網膜8,17,にベクトルの適切な配信を確認するイメージング20,22。 メソッドにいくつかの改善に最近マイクロマニピュレーター22によって駆動されるマイクロ針を使用して記載されています。
針の位置で支援する統合的なアプローチを提案して注射は、特にマウス17,の小さな眼の中を可視化するラボで設計されたカスタム監督ステレオ検眼鏡によって促進されます。23. 固定装置用マイクロマニピュレーターと共に引っ張られたガラス マイクロ針の使用前に必要な (すなわち、白い部分結膜と結合組織を通じて) ダウンないメスを入れると針の配置のよりよい制御を提供します。インジェクション。圧力の使用規制マイクロ インジェクターにより配信一貫した注入量とはるかに大きい安定性、精度と比べると手持ちの注射器、減らすによって実行される手動の注射で注入を行うことができます、目に気泡注入が発生します。小さい針は、針撤退次のパスはセルフシール漏れを防ぐのに役立ちます。注入/配信の程度を評価するために多くの調査グループで検索と実験の終わりに網膜 (表現の構成要素がベクターで配信) で強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式の面積範囲を評価するのに頼る(安楽死) をポイントすると、成功した注射11,19,20,24を確認します。これは、アプローチは、(10 月を利用していない) (不明) の手術失敗ですべての動物がまで反復的な措置に続いて、維持する必要があるので手術の手続き時間と動物、廃棄物資源の膨大な量の手術の成功を確認するには安楽死と目収穫 (EGFP を測定) する場合。網膜の注入の場所の確認は、注射が網膜 (すなわち下腔) の正しい層の間に位置することを示すに HR SD-10 月を使用して改善できます。HR-SD-10 月は、すぐにアプローチを改良する実際の手術時間で関連する変数を識別する (外科的障害) の不成功な試みを記述する使用できます。我々 が見つかりました、HR SD-10 月臨床遺伝子の多数の利点療法研究によって提供外側の網膜変性症の急速な定量的評価実験条件 (を満たしていない研究動物の同定/殺処分を許可します。例えば、不適切な網膜注入)、ベクトルが配信されなかった地域をコントロールし同様、直接フォロー アップの観察 (臨床効果は最も可能性が高い) をベクトルが配信された目の領域にして。その開発以来 SD 10 月の使用を受け入れ、眼科研究者によって使用される続けています今マウスまたは齧歯動物モデル13,25で網膜の科学的研究で眼底イメージングの標準と考えられています。HR-SD-10 月とそのソフトウェア機能が動物モデルの選択、選択の変性の評価など、プロセスのあらゆる段階でマウス モデルで成功した量的遺伝子療法の目標を促進するためのユニークな統合された方法で活かされて疾患モデル、治療薬デリバリー、ベクトル配信、および毒性/有効性評価のマッピング。HR-SD-10 月より効率的な創薬プロセスのあらゆるレベルでの使用します。ここで私たちの RNA 創薬プログラムで使用されるこれらのアプローチについて述べる.
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Protocol
動物のプロトコルはレビューされ、機関動物ケアと VA WNY HCS、バッファロー州立大学の使用委員会によって承認されました。動物は、協会の規定による視覚と眼科 (ARVO) ・ ヘルシンキ宣言の研究に使用されました。
1. マウス モデル
- マウス コントロールなどの評価モデルを識別します。
注:C57BL/6(J)、hC1/hC1//mWT のイメージングを行った mWT、部分的にヒト化マウス網膜変性モデル野生型 (WT) の変異・ ローP347S hC1 遺伝子は人間のホモ接合体マウスロー/+/+遺伝子型26,27、hC1 WT マウスRHO変異の人間ローP347S hC1 遺伝子の単一コピーを部分的にヒト化モデル BL/6(J) x+/+遺伝子型 (hC1/-//mWT/mWT) (hC1/hC1//mWT により得た/C57BL/6 (mWTJ) マウス)。常染色体優性網膜色素変性症 (adRP) 上記のモデルは C57BL/6(J) の背景に。マウスRHOノックアウト背景に WT RHO遺伝子の 2 つのコピーのホモ接合体マウス モデルはまた使用される28,29だった。この行は、129Sv の背景には。この行は、129Sv の背景にマウスRHOノックアウトと横切られました、マウスRHO背景に人間RHOの単回投与が発生します。 - 動物以下の実験的なデザインに関連する条件を維持します。
注:動物は、VA WNY HCS で獣医医療ユニット (VMU) で維持されていた。マウスは、標準ラボ チョウと栽培下 12 h:12 h 光を与えられた: ソフト蛍光オーバーヘッドと暗いサイクル ホワイト ライトでは約 72 ˚F ケージ レベルで約 300 ルクス。
2. マウス アイジェル
- 網膜イメージング30と手術用光ゲルを準備します。
- 結合 2 mg/mL w/v 高分子量 (滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 4 x 106 g/mol カルボマー。
- ゲルは粘性光学的に透明なゲルを形成するまで室温でミックスします。
- 小さな滅菌ボトルにゲルを転送し、閉じ込められた空気の泡を削除する 350 x g でスイング バケツ卓上遠心遠心分離機します。
- マウス角膜とプレミアム カバー グラス (18 mm × 18 mm) 間のインターフェイスを作成する角膜に直接ゲルを適用します。
3. 人事 SD OCT イメージング
- 10 月 HR-SD デバイス (図 1) を参照してください。
- 麻酔薬の適切な投与量の決定には、動物の重量を量る。25 μ L/g バッファー内 2,2,2 tribromoethyl アルコール (Avertin) ソリューションを介して腹腔内注入 (IP) の 2.5% の解決の体重を使用してマウスを麻酔し、動物を固定化後は、瞳孔を広げる目薬を追加します。
- 動物の麻酔完全につま先ピンチを確認し、特定の動物が反応しません。
- トリミングひげと人事-SD-10 月そりの上にマウスを置きます。
- ♥ レンズの前に直接マウスの目を置き、角膜と虹彩があるまでステージ コントロールを操作します。角膜の人工涙液を適用することによって水分補給をしてください。
注:HR SD OCT そりで微調整マイクロマニピュレーターは、マウス ポインターを生絞りを中心とした、指向に使用されます。光 ♥ は、網膜が見えるようになり、最高画質の画像を取得する動物をさらに調整して高度な。 - まず、ソフトウェア プログラム「マウス」を開き、「患者/試験」をクリックします。第二に、「患者を追加する」をクリックし、新しい患者ウィンドウで動物を識別するために適切な情報を入力し、「保存と終了します」.第三に、「試験開始」に続いて「試験を追加します」をクリックしてします。第四に、「カスタム スキャンを追加"をクリックして「長方形のボリューム」を選択、イメージされている目の OD または OS を選択し、「試験を追加」をクリック。最後に、楽器を目指して、関心領域を取得する動物を配置を開始します。かどうかは、良い画像が得られます、適切な領域を見つけること、画質をさらに強化するために画像の取得の直前にアプリケーターの先端滅菌綿を使用して眼の表面から任意の余分な水分を削除し、「スナップショットを開始」をクリックとクリックして後「保存します。スキャン」。
注:長方形の HR SD OCT 画像の典型的なパラメーターは、900 a-スキャン/b-スキャンと 90 b-スキャン/画像です。取得した画像は、1.4 × 1.4 mm です。網膜イメージの地域特定の実験によって異なりますが、ほとんどの画像が視神経乳頭 (視神経) を中心としました。
4. プレゼンス、レート、およびモデル外網膜変性の均一性を評価します。
- HR SD OCT による外側の網膜変性モデル評価
- コントロールと存在、レート、および外側の網膜変性の均一性を評価する実験科目の両方の年齢の広いスペクトルを持つ動物を取得します。
- 複数の動物の両方のコホート (病気と正常な) からそれぞれの年代で HR SD OCT イメージングを実行します。3.1.6 で説明されているメソッドを使用して、OCT 画像を得る。
注:広い期間 (1 年間) にわたる誕生日を配布した、一度にすべての動物の大規模コホートからデータを収集することができます。 または動物の小さなコホートは、長期間 (1 年) と同様の結果を得るために複数の画像を収集するために使用できます。 - 記録された 10 月 HR-SD 長方形のボリューム イメージを開き、測定されるべき最初の b スキャンを識別 (理想的には、視神経または他の識別可能なランドマークのいずれか含まれている) 画像のアンサンブルから。ソフトウェアでズーム機能を使用して、画面に合わせて画像を拡大します。
- B-スキャンの画像を右クリックして、「ノギス」をクリックと必要に応じてできるだけ多くのキャリパーを最後にクリックするとキャリパーの必要な数を開く (1 10 から番号)。キャリパーはイメージの右下隅に表示されることを確認します。「キャリパーの構成」機能を使用して割り当てる角度ブロック列と網膜を横切る均一配置容易にし最後にクリックして"表示キャリパーの場所"をオンに"垂直"としてすべてが適用されます。
注:1stキャリパーはオクルス デクスター (OD) 右目を処理するとき、画像の左側に配置必要があります、オクルス不吉な (OS) 左目の画像を処理するとき、イメージの右側にある 1stキャリパーを配置必要があります。印刷するとき、左右の目の両方のすべてのデータの時間的方向に鼻でこの結果します。 - 各キャリパーを b-スキャン、b スキャン画像を含めることで、視神経乳頭の中心に 1 つのキャリパーを置きしている間 (2.0 mm 離れて) の目的の場所に移動コンピューターのマウスを使用して (このキャリパーをゼロに設定)。クリックし、関心領域にまたがる長さにキャリパーをドラッグするマウスを使用します。最大長さに b-スキャンの測定可能な領域をオーバーレイし、データ解析時に無視するキャリパーを任意に設定します。
- 外部境界膜 (エルム) と (OPL) 外網状層の下部にキャリパー下部にキャリパーのトップを配置することによってキャリパー ツールを使用して ONL 厚さを測定します。0.2 mm 刻みで網膜を横切る各キャリパーのこの手順を繰り返します。測定値を保存します。
- すべてキャリパーを配置してサイズを調整した後、イメージを右クリックし、「キャリパー データの保存」をクリックして。
- その後 b-スキャン (すべて 10回も作品をスキャン) 同じ長方形ボリューム優れた地域に劣るから網膜全体にまたがる oct 断層像からの測定を繰り返します。キャリパーは、オープンと x 軸の同じ位置に残るべきであります。X 方向に移動せずに、キャリパーの長さを調整します。
- 開く保存加工 b-スキャンの横にある小さなファイルのアイコンをクリックしてデータ ファイルのイメージし、「データを行く」をクリック。クリックして"保存すると、時間に基づく順序でファイルを配置し、各 b-スキャン測定のすべてのファイルを開く日付変更。
- 最も高いフレーム番号に基づいての順序で単一のファイルに各 b スキャンからの生データをコンパイルします。「キャリパー名」、「長さ」と"センター X"を含むデータの列を選択します。
- 中央の X がすべて b スキャン処理各長方形のボリューム 10 月イメージの測定のための同じことを確認します。ノギス測定、記録する使用されていないから任意のデータを削除し、ゼロに視神経乳頭の中央にあるキャリパーを設定します。
- ONL の全面的な厚さをプロットする 3 D プロット関数を取得する複数の Y データ セットと X のデータをプロットまたは別は網膜層を測定しました。
- ONL 測定制御率、任意の潜在的な網膜変性の均一性を確認して対応する年齢で実験動物とを比較します。
- 同じ b スキャン画像を用いた OSL 測定のプロセスを繰り返します。エルムとブルッフ膜 (BM) のキャリパーを置くことを除いて、ONL を測定するために使用同じ方法に従ってください。
注:代表結果] セクション (図 3B) にキャリパーを配置する方法の例を示します。これは、エラーを減らすために拡大した画像で行ってください。 - 各実験のための誕生日とコントロールのコホートに複数の動物のデータ解析を繰り返します。
- 包括的な測定とソフトウェアのキャリパー ツールを使用して ONL または OSL の厚さの 3 D マッピング
- ポスト噴射 OCT 画像を確認し、視神経や網膜の血管のような任意の個人を特定できるランドマークのメモしておいてください。[マウス ポインターから取得しフォロー アップの SD 10 月同じ地域、同じ明確な目標物を含めるようにしてください。
注:ポスト噴射 SD OCT 画像のイメージし、網膜剥離に関与する網膜の領域が識別されることを確認します。長方形ボリューム SD OCT 画像を記録し、保存します。 - 手順で上記のように記録された画像を処理4.1.3に4.1.14。 。キャリパー データと上記のプロットを保存します。
注:ONL 測定の結果の配列を使用して、ONL 厚さを描いた 3 D プロットを作成します。X 軸に沿ってキャリパーの位置は replot グラフの x 軸に沿って原点 (0) 視神経を配置すること。B スキャン数を使用して y 軸がプロットし、視神経を使用して、y 軸の原点の視神経を適切に位置決めすることができます開始点を定義します。各データ セットの視神経を識別するフォロー アップ画像を確実に配置することができます。
- ポスト噴射 OCT 画像を確認し、視神経や網膜の血管のような任意の個人を特定できるランドマークのメモしておいてください。[マウス ポインターから取得しフォロー アップの SD 10 月同じ地域、同じ明確な目標物を含めるようにしてください。
- 眼底画像上に注射部位の範囲をマッピング
- ポスト噴射長方形のボリューム 10 月注射の成功を確認するを実行します。記載されている方法に従う3.6 。
- B-スキャン OCT 画像を全体にまたがる数から網膜の国境で変曲点を識別するためにソフトウェアでキャリパーの機能を使用します。メソッドを使用して、記載されているキャリパーを開く4.1.4 。
- B-スキャン OCT と眼底画像で、その場所に対応する対応するキャリパー位置の割り当て先の場所と眼底画像を記録します。
- 眼底画像のすべてに、キャリパーの位置を含む複合のイメージが眼底画像 (図 5A代表 [結果] セクションの例) に注射部位の正確な地図でコンパイルします。
5. 眼内注射
注:RIS の使用の詳細については、最近研究23でさらに詳しく説明します。
- ガラス注射器の準備
- オートクレーブ キャピラリー チューブ乾燥のサイクルを使用して小さいバッチのフィラメント。
- ピペットの引き手とシャープな角度と直径が 2-5 μ m の範囲でガラスの先端を生成するプログラムのセットアップを使用します。
注:私たちのピペットの引き手に効果的な針を生んだ例 5 ステップ プログラムは表 1に示します。 - 部屋の温度で滅菌ピペット針 jar に引っ張られたガラス針を格納します。
- 注射剤の目的で注射針を埋める
- 針を残して約 5/8"ホルダーの終わりを超えて突出針ホルダーにマウントします。
注:A の距離 5/8"になること困難に達するより少ない針に合わせて注射液針ホルダーが 0.2 mL チューブの開口部に容易に適合しないため。また、5/8「大きく振動または困難リアルタイム イメージング先端葉フォーカル プレーンまたは視野 (FOV) 目を穿刺しようとするので先端の歳差運動の結果より突出している針を持ちます。 - 0.2 mL の滅菌チューブに注射液を準備します。1:10 を追加、最終濃度が 1 mg/ml フルオレセインの注射剤を無菌フルオレセイン硫酸 (1 × PBS で 10 mg/mL) の希薄化。
注:使用される正確な染料は、ユーザー固有、非毒性と RPE と下腔のレベルで針先の正確な配置を促進するために白色光照明下で肉眼に表示される何かをすることができます。 - ステレオの顕微鏡を使って針を充填に使用する注入剤を含む管の中央に整列するので、針の位置に 3 軸マニピュレーターの制御ノブを使用しながら針を視覚化します。
- 針の先端が液中に水没するまで慎重に 0.2 mL チューブに針の先端をドライブします。単一の注入に必要な針の中に射出液 (例えば1 μ L) の音量を描画します。氷に差し込んだ管で残りの溶液を維持します。
- 針を残して約 5/8"ホルダーの終わりを超えて突出針ホルダーにマウントします。
- 注射用動物の準備
注: RIS 顕微鏡を清浄に保ち、非接触システム。加熱プレートはきれいな吸着パッドで覆われ、針が引っ張られる前にオートクレーブ。彼らは自己殺菌加熱金属ストリップでプルが後、引っ張られたガラス針を保持するために設計された閉じた滅菌チャンバー内で保持されます。針だけ手袋をはめた手を使用して処理されます、ケアがホルダーにマウントしながら針の先端に触れることを防ぐために使用されます。注入ソリューションは、生殖不能の技術を使用しております、LB 寒天培地プレート上にウイルス製剤のサンプル 37 ° C で一晩インキュベートそれらによって汚染を検査します。- 麻酔鎮痛薬の適切な投与量の決定動物 (g) の重量を量る。
- 腹腔内注射麻酔を介して(バッファーに格納された 2,2,2 tribromoethyl アルコール (Avertin) の 2.5% 溶液) (IP) を管理します。
- 両方の目の瞳孔に抗コリン薬 (例えばcyclopentylate) をすぐに適用されます。
- 耳の穿孔器または他の方法を使用して動物の数し、動物のヒゲを除去します。
- 目と希釈 betadine で周辺を洗います。
注:これは意図しない溺死につながるよう、鼻の周りの任意のソリューションを得ることを避けるため。 - 針に向けて注入する目であらかじめ成型モデラーズ粘土マウス ホルダーの 39 ° C で維持加熱パッドの上にマウスを置きます。
- マウスが応答を停止、後脚のピンチのテストを使用していることを確認します。
- 網膜下注入を行う
- そっと開くと下向き同時に 7 位と 10 位を押しながらまぶたに鉗子の先端を配置することによって世界中の眼球突出を誘発するのに滅菌鈍アイリス鉗子のペアを使用します。
- インジェクションのプロセス中にソケットからそれを保つために眼球の下まぶたを同軸ケーブルに鉗子を使用します。
注:動物 10 ~ 14 日古い、しばしば目を保持ソケットからより古い動物より簡単に。 - 角膜輪部のエッジの下約 1 〜 1.5 mm の針の先端を直接、結膜を通して目に針、強膜の組織に浸透し、目を操作できるように、それは強膜うつ病を作成するまで慎重にドライブします。
- RIS のステレオ顕微鏡による強膜うつ病、瞳孔を通じてを視覚化するマニピュレーターに下方に目を回転させます。
- 滅菌アイジェルまたは PBS ソリューションと滅菌 coverslip カバー x 1 滴を適用します。
- 針は、注射部位の網膜形態の鋭いピークまで転送針 (2-5 μ m)、およびドライブのヒントによって作成された強うつ病に焦点を当てます。
- 先端穴強膜を介して、針のフルオレセインは RPE 細胞膜のすぐ近くで網膜の下に表示まで、ホルダーを使用して針を回転させます。
- 地球の接線、針の先端をドライブし、足のペダル ・ スイッチと噴射ポンプをアクティブに。
- 必要なボリュームが配信された後 (0.5-1 μ L) 下腔に針を撤回し、水疱が安定し成功した注入の最初の基準は、注射部位からその液体が漏れていないかどうかをご確認ください。
注:適切な先端径を維持する (2-5 μ m 径) は、注射部位からの漏出を避けるために重要です。 - 10 月楽器のイメージング プラットフォームに動物を配置します。HR SD OCT イメージング長方形のボリューム イメージを記録するための指示に従ってください。
- 下腔で、水疱の範囲を決定するための画像を保存、注入の流体があることを確認します。
- 動物をホルダーから外し、注入された目に抗生物質軟膏の十分な量を適用します。
- それは完全に回復し、それがどこから来た元のケージに戻しまで加熱パッドの上に動物を配置します。
注:私たちの動物は通常離乳前に注入される、したがって、動物は、母親と一緒にケージに返却する必要です。
- 10 月計測器ソフトウェア ツールを使用して網膜の水疱の範囲をマッピングします。
- 水疱の前述の方法を使用して、長方形のボリューム 10 月画像を得るし、視神経など眼球内で認識可能なランドマークを含むようにそれを配置します。
注:90 b-スキャンを記録動作します、ブレブをマッピングするが、目的の解像度に応じて使用できます。 - 単一キャリパーを図に追加し、網膜が網膜色素上皮や脈絡膜からデタッチ変曲点に配置。
注:ソフトウェアは自動的にキャリパーと b-スキャンの対象を表す眼底画像上に線に対応するポイントをマップします。 - ノギス、配置、次画面をキャプチャし、注射部位を正確にマップする眼底画像上に射出ブレブの境界線を効果的に画像をコンパイルします。フォロー アップ イメージ投射の間の関心領域の特定に役立てるに参考のためコンパイル済みの画像を保存します。
注:また、キャリパー データは、保存できます、遵守、ONL 厚さのプロットの 3 D データ セットの同じような方法を使用してプロットされます。
- 水疱の前述の方法を使用して、長方形のボリューム 10 月画像を得るし、視神経など眼球内で認識可能なランドマークを含むようにそれを配置します。
- ケナコルト硝子体内注入
- 針は、 pars プラナ角膜輪部の背後にあると、硝子体に約 0.25 mm で強膜を介して完全に駆動は除いてサブ網膜注入と同様の手術アプローチを使用して針の先端を配置します。
- 針位置、足ペダルで噴射パルスを適用します。
注:蛍光を用いた瞳孔絞りを充填アイカップの硝子を通してフルオレセイン色素の急速な普及が見られます。
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Representative Results
プレゼンス、率およびモデル外網膜変性の均一性の評価
ONL の計測は、計測器のソフトウェアで提供されるキャリパー ツールを使用して ONL の制限の定義、elm OPL から記録されました。目標は、部分的にヒト adRP マウス モデルの外側の網膜変性の進行をマップすることでした。制御 C57BL/6(J) マウスと hC1/hC1//mWT から同等の画像コントロールの眼底所見と深刻なの両方を展示する示されていた突然変異体人間のロッド (RHOP347S) のオプシン遺伝子の 2 つのコピーを表現する mWT マウス モデル/と急速進行性の網膜変性の条件です。3 週齢 adRP (BL/6(J)) 動物、人間・ ローP347S遺伝子の単一コピーのみと WT マウスRHO遺伝子の 2 つのコピーを持つ x hC1 が通常 ONL 厚近くあった。ただし、フォロー アップ HR SD OCT スキャン 10、37 週間実証一時的漸進的かつ空間的に均一網膜視細胞の ONL をこの時間枠で薄くとして認識の約 60% の損失を発生させた。網膜変性がある x BL/6(J) adRP モデル hC1、13 週間のおおよその時間定数 (1/e)。ホモ接合体 hC1 動物、マウス WT RHO背景に有害突然変異体人間遺伝子の 2 つの用量で苦しむ 3 によって広範な網膜が薄くなると光受容体はすべての本質的に完全な損失によって示されているように、はるかに急速な変性週齢 (図 2)。
ONL メジャーは、視細胞活力の指標として外側の網膜正規の 1 つだけのコンポーネントです。光受容体の内部セグメント/外側セグメント OSL (は/OS) 線または楕円体の線は感光体の活力と機能の両方をサポートする証拠を提供します。(N129R - x 129R-) の 1 つまたは 2 つ (2HRho 1T1T) のコピー (線量) WT マウスRHOノックアウト背景に WT RHO遺伝子のいずれかを格納するために飼育されている動物の比較は、外側の網膜厚測定しました。ONL ~ 8 μ m の統計的に有意な増加は、人間の遺伝子のコピーを 1 つだけのマウスと比較して WT RHOの遺伝子の 2 つのコピーを持つマウスで観察されました。OSL ~ 5 μ m の統計的に有意な増加は、WT マウスRHOノックアウト背景に WT RHO遺伝子の 1 つのコピーと 2 つのマウスで観察されました。ONL と OSL 測定方法の例は、図 3に示します。HR-SD-OCT システムで撮影した画像の高解像度は、ONL の OSL ヒト WT RHOマウスモデルの統計的信頼性差の差別を可能にする正確な測定を許可します。
範囲の手術結果詳細 OCT によるとき Subretinal 注射をしようとして
未遂網膜下注射の時間-SD-10 月評価には、さまざまな成果が得られました。まず、最も一般的な経験された注入の流体がサブ網膜領域内で正しく配信されたことを確認です。暗黙的な網膜下スペースを終了します (開発中) のオープニングは、HR SD OCT の正面ビューと b-スキャン画像の両方明確に視覚化することができます水疱を作成しました。ハイポ反射流体は、上記神経網膜と BM (図 4) の下にまだ反対してハイパー反射の網膜色素上皮細胞層に囲まれました。動物を注入 (下記参照) の直後に HR SD OCT によるイメージした場合、網膜注入の範囲を決定できます。第二に、注射が (BM) の下にある脈絡膜の領域で発生する可能性が網膜ではなく。これは、結果、網膜の流体避難地域のドームを境界ハイパー反射層 (RPE) と OCT の眼の後方の限界でハイパー反射率 b-スキャンないです。第三に、網膜注入中に発生する可能性がもう一つの潜在的な結果は神経線維層で (分割) 網膜若年。この結果得られた正常網膜の解剖学が、網膜の内側の層は、硝子体を侵略しない可能性がありますまたはブレブをカプセル化します。原則として、このような若年のパターン、適切な神経網膜のラミネーション内注入発生する可能性が、我々 はこれまで神経線維層の若年を見ただけ。第四に、ケナコルト硝子体内注入にも発生する可能性があります、する影響を与えません、10 月。これらの障害のすべての交換フロー噴射装置の圧力のための注入中にガラス針の先端または針のおそらくいくつかの小さな動きの初期の紛失からなります。
網膜下注入の場所の特性
有効性又は候補者療法の毒性を決定する上で重要な要素を持たないベクトル対それらを受けた網膜の領域を比較できることです。我々 は、フォロー アップ診断時に我々 は治療が適用された網膜の面積の範囲を識別することができるように網膜の注射に関与する網膜の領域をマークするための手段の開発に多大な努力を指示、それゆえどこ伝達は可能だった。ゴールド NPs がまたはない注入された網膜の領域を識別するに自信の高レベルを許可します。しかし、特定の粒子またはその定式化登場毒性と重篤なローカライズされた網膜の変性サイトで注射後 24 時間 (データは示されていない) による網膜の注射の結果。そこで、人事 SD OCT 画像データから直接注射部位をマッピングの代替法を開発しました。インジェクション敷地境界を正確に識別するためのメソッドは、(図 5) 計測器のソフトウェア パッケージの測定ツール (ノギス) を使用して開発されました。我々 は、個々 b-スキャン (から優れた網膜に劣る) 眼底画像を作成するために使用を調べることによって正確に水疱のエッジを識別できます。キャリパーの位置はキャリパーは x 軸に沿った位置に正確に直面して眼底画像の対応する b-スキャンに自動的にマップされる水疱が接続されている網膜と交差するポイントで、キャリパーを配置するとき、b スキャン上に配置。このプロセスを繰り返し直面して眼底画像上にブレブのエッジをトレースすることができます。配置プロセスでは、一定の視神経を基準にして、頭とイメージ データの分離の前に複数の画像から網膜血管を合わせて回転する必要がありますたびに、網膜の類似した領域がされる必要があります。ポスト噴射画像とそれに続くフォロー アップ画像の配置プロセスでは、次の注入領域は網膜剥離に関与する領域内で測定の位置を識別するためにデータ ポイントのグリッドでスーパーイン ポーズでした。このデータは、注射部位以外の地域を基準にして、注射部位を含むデータ ポイントを識別するために視覚的なツールを提供する表面マップとしてプロット可能性があります。
ONL の 3D 厚さをマッピング
最後に、我々 は網膜のイメージ領域全体にわたって ONL、OSL、またはから他の網膜の層の測定を記録し、サーフェス プロット (図 5) を使用してデータをプロットします。注射部位の境界の地図を重ね合わせ挿入された地域とない注入プロセスの間に孤立していた地域を含む、2 つのデータ セットの分離が可能します。さらに処理とデータ解析は特定薬剤が網膜変性を救出したり、毒性を誘発する仮説をテストするこれらの 2 つのデータ セットでは実行しでした。このアプローチは潜在的実験、および、単一の目は、同じ目の非注射注入 vs 地域比較から収集するデータを制御できます。
図 1: 10 月 UHR SD デバイス。使用 10 月 HR-SD デバイスが表示されます。インストゥルメン トラック (A) には、(、)、コンピューターのモニター、キーボードとマウス (b)、プローブ インターフェイス ボックス (c)、(d) 10 月エンジン、コンピューター (e)、超発光の制御装置が含まれています。(赤外線) 発光ダイオード (f)、および無停電電源は装置 (g) です。光学ベンチ (B) イメージング (マウス網膜) 用プローブ光学ヘッドが含まれています (h) (私)、多軸 (線形および回転) マニピュレーターとマウスのテーマ (j)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 部分的にヒト adRP モデル HR-SD-10 月によって測定される進歩的な外網膜変性(A) adRP モデルの網膜の HR SD OCT 画像を得た (hC1 BL/6 (J) x) 年齢別、14 週間で C57BL/6(J) コントロールと 3 週間でホモの hC1 の突然変異系統で。網膜の外側が adRP モデルで 3 週間で通常の外観を持っていたが、進歩的な ONL 間伐と解体 10 週齢以降の証拠があった。37 週目まで、実証 BL/6(J)) 豊富な外側の網膜変性 x (hC1。10 月のすべてのスキャンは、視神経の近くにいた。視神経を通って水平方向に沿って (mm) に ONL 厚 (B) 軸プロット コントロール (C57BL/6(J))、hC1、および adRP 異年齢の動物。部分的にヒトの adRP モデルに ONL 厚さの進歩的な損失があった。ONL 損失は 37 週齢によって 60% よりも大きかった。誤差、平均値の標準誤差を =。赤いスケール バー = 200 μ m とすべての画像が同じスケール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 10 月 HR-SD を使用して核の外側の層と外側のセグメント長の定量的な対策(A) マウス線 ONL と OSL 措置を示すために使用します。代表 10 月画像マウスRHOノックアウト背景に 2HRho1T/1 t (2 用量 HRho)) (左のパネル) と (1 つはマウスRHOノックアウト背景に人間RHO線量) N129R - x 129R-(右側のパネル)。(B) キャリパーだった ONL (赤) と OSL (青) を測定する配置方法の例を示します。(C) データは各行の 3 つの動物から得られる ONL 厚さ 2HRho1T/1 t ラインと N129R - x 129R-との比較を示す棒グラフ形式でプロットしたため (左側のパネル)。2HRho1T/1 t 線は ~ 8 μ m 厚い ONL。OSL の違いを示すためには、複数の測定値 (7) は、9 週齢動物 (右側のパネル) で B (青線) のように BM ELM からそれぞれマウスの行から 1 つの b スキャンから作られました。これは HRho 遺伝子のコピーを 1対2 で動物の OSL の ~ 5 μ m の違いを実証しました。ONL 両方 OSL 措置だった統計的に有意な ONL p 値 = 1.7e-5 と OSL p 値 = 6.4e-5。誤差、平均値の標準誤差を =。赤いスケールバー = 100 μ m 両方同じスケールのある 3 a の b スキャン、3B をズームすると、網膜の層の明瞭さを向上させると、定性的測定値を取得する方法のデモンストレーションを提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 10 月 HR-SD によって識別されるマウスの眼内注射の種類(A). A (hC1xBL/6(J)) マウスは Inferonasal transcleral transchoroidal 注入を介して流体の ~ 1 μ L を注射されました。結果として得られる網膜剥離は、画像の右側にブレブのリーディング エッジでシャープなボーダーを作成するアン顔画像の右下緑の領域として認識されます。注射部位の OCT 眼底画像イメージがすべて b-スキャン全体の網膜厚からのコンパイルのみ流体充填腔の位置によって微妙な違いを発揮します。さらに、注入ブレブは、OCT ヘッドピース, 注射部位のやり場のない産地から網膜の表面までの距離を変更します。(B) 10 月の b-スキャン非注射の網膜を示した。視神経が付いています。(C) A 網膜注入が示されています。ラベルは、視神経、 en 顔画像 (右側のパネル) で矢印が剥離の後縁を示します。網膜 (矢印) の下端と RPE のハイパー反射率の重要な損失の網膜色素上皮層 (ハイパー反射曲線) と脈絡層以下の明確な昇格 (上方変位) で A (D) 脈絡膜注入を発揮、注入の流体。(C と D) 画像に矢印を比較します。A (E) 網膜若年は、神経線維層近傍に示されています。RPE に接続されている網膜のまま注入の流体をカプセル化する非常に薄い超反射膜を観察します。3 つの別の分遣隊の微妙な違いは、 en 顔画像 (C、D、およびE) で視覚化できます。網膜剥離、脈絡膜注入、ブレブのリーディング エッジのぼやけハイパー反射縁を作成している間 ( Cの矢印) を視覚化することは困難である国境と網膜の若年の鋭い分界で明らかなそのリーディング エッジ (E)。両方の赤スケール バー = 4 b で 200 μ m。4E を介してすべての画像 4B は均等に拡大されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: マッピングと網膜注入定量化外網膜変化します。複数 10 月 b-スキャンから ONL 測定結果を 3 D プロットとベクトルの網膜下注入をしていたマウスの追跡調査中に関心領域を識別する方法を開発しました。2HRho1T/1 t 動物は GFP と鉛の候補者ハンマー ヘッド型リボザイム (scAAV GFP ad6 hhRz 725) を表現する自己補対アデノ随伴ウイルスを注射された (OS 目) 毒性スクリーンで。(A) Imaged 直後、射出の面積程度外側セグメントが b-スキャン (左パネル (赤キャリパー)) の網膜色素上皮から分離時点で水疱のリーディング エッジでキャリパーを配置することによってマップされていた。キャリパー ツールの位置は自動的に眼底画像にマップされ、これが繰り返され、必要に応じて多くの b-スキャンのコンパイル (すべて 5番目のスキャン (A) (右側のパネル) で) 目的の解像度に依存しています。その後の 10 月研究 (2 週間ごと) イメージ; の重ね合わせできるように網膜の同じ領域視神経と網膜の血管は、デカルトや回転の調整を容易にするランドマークです。網膜の全体の地域は、(OPL とエルム) 必要な境界に表示されていた提供 ONL の厚さを測定しました。(B) 注入表面キャリパー位置 (色分け) は再び眼底画像の上にマッピングし、合成画像にコンパイルに ONL の長さをマップします。すべて 5th b-スキャン OCT 画像からは、網膜を横切る最大 10 ポイントで組み込みノギスで測定しました。網膜の血管は、イメージ オーバーレイによって識別される戸建網膜領域の網膜内のデータ ポイントをことができます、区切りを配置するイメージング ソフトウェアを使用して、(C) の前と後にコンパイル済みの画像を回転します。(D) データ セットは眼底画像配列と同じ表形式にマップされ、(bleb (赤のハイライト) とは、内の測定) の 2 つのグループに分かれています。(E) データは、イメージ化された地域全体に ONL 厚さの描出が可能の 3 D 表面プロット機能を使用して表示されます。これは目の注入および非注入地域間量的差異の評価をことができます。3 D プロット (E) の隙間は、ONL 測定注入直後がくっついたままで地域から網膜の領域内のデータのセットを分離するための便利な方法を提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: プログラム ガラス針をプルするために使用します。強膜、transchoroidal アプローチによって subretinal 役に立つガラスの針を達成するためにプログラムのパラメーター。
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Discussion
HR-SD-10 月は、潜在的な治療のテストでその有用性を決定する人間の病気の動物モデルの潜在的な特性のための簡単な方法を提供します。迅速かつ確実に人間の病気の動物モデルすることができる (例えば、代替遺伝子治療、リボザイムや shRNA ノックダウン遺伝子療法、複合遺伝子治療) の治療薬探索プロセスに不可欠です。HR-SD-10 月は、網膜の健康を特徴付けるし、ほぼすべてのマウス モデルの網膜変性の進行をモニターするための評価のシンプル、迅速、かつ非侵襲的なメソッドを提供します。OCT 画像を使用して変性が時間をかけて外網膜 (視細胞) 変性症の詳細な評価や治療の救助試みの影響あります網膜の異なるレイヤーの一部またはすべての測定を取得できます。範囲またはキネティック タイムライン。HR-SD-10 月は配信されたベクターまたは材料の毒性を評価するために使用もできます。視細胞変性網膜研究プログラムによる最も大きな影響は、生きた動物で時間をかけて ONL の洗練された測定を行う能力です。1 つは、治療機会の時間ウィンドウの上効果と同じモデルで候補者治療の毒性を評価するための重要な第一歩である時定数を抽出する網膜変性タイムラインをプロットできます。この技術ができます (動物と時間) の貴重な資源の大幅な節約古典的なエンドポイント組織に対する研究者を許可することで動物のコホート研究を入力および動物を排除する前に異常を識別するために、(例えば、正常に網膜配信) 実験的基準を満たしていません。
マウス眼の網膜にある特定の治療の正確な配信の必要性は挑戦的な HR SD-10 月提供動物の継続的な包含のための規準として成功した網膜下注射を正確に視覚的に確認して、前臨床研究デザイン。広範な努力は、これらのモデルは、しばしば病タイムラインが十年にわたって現れる人間の網膜変性疾患をシミュレートするので、時間をかけて遺伝子治療研究で注入される動物を頻繁に必要です。数多くのフォロー アップ検査は、治療の有効性を判断したり、毒性を評価する必要があります。この重要な課題への解決策は特定し、治療ベクターの配信のために外科的障害研究のデザインから動物を削除する能力を持つことです。両方の目を注射すると、動物、約 80% の成功につき 1 つ目を注射すると、長年の経験と熟練技術者の成功した射出を提供する能力は 90% に近づいています。この効率レベルと失敗した注射で動物の研究デザインから削除は仮説検定に有利です。これは重要な時間の節約だけでなくより一貫性があり予測可能な結果ができます。さらに、HR SD-10 月実験動物-動物の変動が減少、時間をかけて続かれるべき同じ動物を許可することで任意の 1 つの実験に必要な動物の数を減らすし、グループを制御することができますできより多く潜在的な有効性と治療薬候補の毒性についての仮説の堅牢な統計的評価。
網膜下注入による網膜のカバレッジの範囲通常 100% ではない自体である有毒31,32,33,34。したがって、導入された、非導入地域を区別するための能力を適切に特定候補者の治療のための救出、毒性の仮説の検証が欠かせません。マウス眼の網膜下注射の正確なマッピングの利用可能なソフトウェア ツールの創造的な使用ができます。挿入された眼の即時のイメージングは、利子および同じ世界内で扱われていない地域に導入されている地域を比較する機能の地域へのフォロー アップの画像の方向を提供します。必要なマッピング精度に応じて b スキャンごとにこのプロセスを実行できるまたはすぐに注射後、グラフィック ソフトウェアを使用して単一のイメージにすべての眼底画像をコンパイル収集 b-スキャンのアンサンブルから定期的にサンプリング区分的連続的なボーダーは慎重に眼底画像上にマップされています。フォロー アップ画像に注入直後から画像を比較する画像の計測位置が眼底画像上にマップされ、注射部位と非注入領域にデータ ポイントを区別できますように配置する必要があります、網膜。視神経乳頭や網膜の血管のマッピングは、それに続くフォロー アップ画像と投与後の画像を配置するときの目の向きに役に立ちます、これと同じ方法を使用しても実行できます。この情報は、注入が発生していた網膜の領域を識別する後続イメージングに使用できます。もちろん、動物を安楽死させても (例えばリボザイム)、候補者の治療遺伝子を含む AAV ベクターによる配信、EGFP 式の場所も使えますによって決まる領域と伝達の場所を比較するには血管の場所に依存する画像のマッピング。これは、解剖学的剥離の領域を超えてその後閉じた網膜下空間内のベクトルの拡散の識別になります。
金使って成功網膜下の水疱をラベルするように NPs は使用される材料によって毒性のため限られていた。それは毒性を誘発しないでください (様々 な寸法、表面改質) 代替の準備を見つけることができる場合網膜鉱物の範囲をラベルにそのような材料の更なる調査おすすめ。
HR-SD-10 月は大幅に少ない時間とリソース情報の膨大な量を提供し、組織学のような従来の方法論と比較して潜在的な治療の効果と毒性についての詳細を提供するために測定することができます。この技術の使用により、前臨床網膜創薬探索35で深刻なボトルネックの 1 つを軽減するために研究者。マウス RIS と人事-SD-10 月は、RNA 創薬プログラムのコンポーネントとして臨床網膜遺伝子療法の研究を支援する強力なツールです。これらのツールは、広く適用できます。
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Disclosures
商業の関係: MCB: 何もない;JMS: どれも。イメージング システム (RIS)23本研究で使用される網膜は、実質的な使用マウス、齧歯動物、小動物の遺伝子療法配信研究を実施しようとすると、任意のグループへの新規デバイスです。著者には、この時点でこのデバイスに関して宣言する競合がない、SUNY バッファロー - と復員軍人援護局の大学は知的財産権があるし、将来的にこの楽器を実用化することを求めます。
Acknowledgments
この素材は、一部部門のベテラン出来事 (VA)、退役軍人健康庁、室の研究と開発 (生物医学研究および開発) によってサポートされる作業に基づいて (VA メリット助成金 1I01BX000669)。JMS に採用されての一部としてスタッフ医師・科学者、眼科、VA WNY;一部では、VA WNY に MCB を採用します。研究は、行われ、退役軍人管理ウエスタン ニューヨーク医療システム (ニューヨーク州バッファロー) によって一部にはサポートします。内容は、退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。サポートも主要な部分は、NIH/ネイ R01 で付与 EY013433 (PI: JMS)、NIH/ネイ R24 付与 EY016662 (UB ビジョン インフラ センター、PI: M 虐殺、ディレクター-バイオフォトニクス モジュール: JMS)、無制限で与えるに部の眼科/大学で防ぐため失明 (ニューヨーク、ニューヨーク) に研究からバッファローと Oishei 財団 (ニューヨーク州バッファロー) からの助成金。我々 博士ジャニス ・ レム (タフツ ニュー イングランド医療センター, ボストン、マサチューセッツ) からローノックアウト、ヘテロ接合の状態で NHR E 遺伝子モデルのギフトには hC1 トランスジェニックローP347Sラインとエクソン 1 マウスのギフトを認める、マウス エクソン 2 RHOノックアウト背景夫妻 G. ジェーン ・ ファラーとピーター ・ ハンフリーズ (トリニティ ・ カレッジ、ダブリン、IRE) から。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
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