Summary
Burada biz kendi alansal kapsama değerlendirmek ve photoreceptor canlılık karakterize subretinal boşluğa gen terapisi ajanların teslim yardımcı olmak üzere yüksek çözünürlüklü spektral alanlı optik koherens tomografi (HR-SD-Ekim) kullanarak yeni bir yaklaşım göstermek.
Abstract
HR-SD-Ekim canlı fare modelleri photoreceptor dejenerasyon ilerlemesini izlemek için terapötik ajanlar teslim subretinal boşluğa değerlendirmek ve toksisite ve etkinliği vivo içindedeğerlendirmek için kullanılmaktadır. HR-SD-Ekim kızılötesi ışık (800-880 nm) kullanılır ve özellikle optik var benzersiz optik fare göz ile alt-2-mikron Aksiyel kararlılık için tasarlanmış. Transgenik fare modelleri (photoreceptor) dış Retina dejenerasyonu ve denetimlerin hastalık ilerleme değerlendirmek için görüntüsü. Çekti cam microneedles adeno ilişkili virüs (AAV) ya da nano tanecikleri (NP) yolu ile alt retinal enjeksiyonlari trans-scleral ve trans-choroidal bir yaklaşım sağlamak için kullanılmıştır. Dikkatli iğne subretinal boşluğa konumlandırma sıvı alt retinal uzaya sunar bir kalibre edilmiş basınçlı enjeksiyona önce gerekli oldu. Gerçek zamanlı subretinal ameliyat bizim Retina görüntüleme sistemi (RIS) yapılmıştır. HR-SD-Ekim gösterdi bir toksik mutant insan mutant rhodopsin (P347S) ifadesi nedeniyle ilerici Tekdüzen Retina dejenerasyonu (RHOP347S) transgene farelerde. HR-SD-Ekim Retina katmanların sıkı miktar sağlar. Dış nükleer tabaka (yalnız) kalınlığı ve photoreceptor dış segment uzunluğu (OSL) ölçümleri photoreceptor canlılık, dejenerasyon veya kurtarma ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. RIS iletim sistemi gerçek zamanlı görselleştirme subretinal enjeksiyonları içinde yenidoğan sağlar (~ P10-14) ya da yetişkin fareler ve HR-SD-Ekim hemen teslim başarısını belirler ve alansal ölçüde eşler. HR-SD-Ekim subretinal cerrahi başarı farelerde, ayrıca photoreceptors içinde vivocanlılığını ölçme için değerlendirebilir güçlü bir araçtır. HR-SD-Ekim de Retina dejenerasyonu, toksisite ve preklinik gen terapisi araştırma çalışmaları tedavi kurtarma ölçüde değerlendirmek için tek tip hayvan tabur tanımlamak için kullanılabilir.
Introduction
Araştırmacılar gen terapileri Retina ve Retina Dejeneratif hastalıkları çeşitli roman tedavi tedaviler için insan hastalık1,2,3,4 dönüştürerek httpd'ye umutları ile gelişmekte olan , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. saat alan veya spektral etki alanı optik koherens tomografi (SD-Ekim) hastalık12,13,14 belirli fare modellerinde dış Retina dejenerasyonu yönleriyle araştırmak için kullanılmıştır . HR-SD-Ekim, ancak, henüz kapsamlı bir şekilde oranı ve Retina dejenerasyonu kayma tekdüzelik belirlemek için fare modelleri değerlendirilmesi en iyi duruma getirme bağlamında kullanılan veya gen preklinik değerlendirilmesi bağlamında therapeutics örnek, e dayalı kurtarma, toksisite veya vektör teslim8,15,16kayma ölçüde değerlendirmek. Bir kez bir fare modeli tam olarak karakterize, HR-SD-Ekim veri kurtarma veya fare modelleri Retina dejenerasyonu17toksisite uygulamak için tedavi etkisini ölçmek için bilgilendirici ve güvenilir bir kaynak olarak hizmet verebilir. Birçok grup subretinal enjeksiyon vektör teslimat photoreceptors ve retina pigment epiteli (RPE) hücreleri transducing, verimlilik nedeniyle bir yöntem olarak kullanıyorsunuz. Genellikle özgür-el cerrahi ile kornea yüzeyinden yapılır ve genellikle katarakt, kanama ve sadece arka manipülasyon tarafından meydana gelen istenmeyen Retina dekolmanı ile dolu olduğunu ancak, bu ana, zor bir yöntem kalır vitreus. Birçok grup hala subretinal enjeksiyonları körü körüne girişimi ve nispeten geniş çaplı paslanmaz çelik iğneler (34 G)8,17,18ile,19 el ile enjeksiyonlar kullanarak virüs göndermek ,20,21,22ve vektör uygun teslimat retina8,17, onaylamak için Imaging birkaç kullanır optik koherens tomografi (OCT) 20 , 22. bazı iyileştirmeler yönteminin son zamanlarda micromanipulator22tarafından tahrik microscale iğneleri kullanarak tarif edilmistir.
Biz AIDS iğne konumlandırma entegre bir yaklaşım mevcut ve enjeksiyonları laboratuarında fare17, küçük göz içinde görüntülenmesi için özel olarak tasarlanmış özel yönlendirilmiş stereo ophthalmoscope tarafından kolaylaştırdı 23. çekti cam mikro iğne stereotaksik micromanipulator ile birlikte kullanımı önce iğne yerleştirme gerekli (Yani, konjonktivayi ve bağ dokusu) hiçbir cerrahi kesme ile daha iyi kontrol sağlar enjeksiyon. Basınç kullanımı Mikro enjektör yardımcı olur teslim tutarlı enjeksiyon birimleri düzenlenmekte ve çok daha fazla istikrar, hassas ve el ile enjeksiyonlar böylece azalan bir el şırınga tarafından gerçekleştirilen daha yavaş ile enjeksiyon yapılabilir göz içine enjeksiyon kabarcık oluşumu. Daha küçük iğne iğne çekilme yolu kendinden contalı olduğundan takip kaçağı önlemek yardımcı olur. Enjeksiyon/teslimat ölçüde değerlendirmek için birçok araştırmacı grupları bulma ve retina (vektör tarafından teslim ifade yapısı) gelişmiş yeşil floresans protein (EGFP) ifade alansal ölçüde deneysel sonunda değerlendirme itimat (ötenazi) başarılı enjeksiyonları11,19,20,24onaylamak için gelin. Bütün hayvanlar (bilinmeyen) cerrahi hataları ile muhafaza edilmesi, kadar tekrarlayan önlemler takip gerekiyor beri cerrahi başarı kaynakları çok büyük miktarda cerrahi yordam zaman ve hayvanlar, atıkların doğrulamak için bu yaklaşım (OCT kullanmak değil) ötenazi ve göz hasat zaman (EGFP ölçülür). Retina yerleştirmeye konumunu teyit enjeksiyon (yani subretinal alanı) retina doğru katmanları arasında yer alır göstermek için HR-SD-Ekim kullanarak geliştirilebilir. HR-SD-Ekim hemen başarısız denemeleri (gerçek cerrahi zamanında yaklaşım geliştirmek için ilgili değişkenleri tanımlamak için cerrahi hataları) betimlemek için kullanılabilir. HR-SD-Ekim sayısız avantajı preklinik gen terapisi çalışmaları dış Retina dejenerasyonu, hızlı kantitatif değerlendirilmesi izin vererek kimlik/deneysel ( ölçütlerine uymayan çalışma hayvanların itlaf izin sağladığını bulduk Örneğin, yanlış subretinal enjeksiyon) ve nerede vektör teslim edildi (preklinik etkisi büyük olasılıkla nerede) bölgeye göz izleme görüntüleme doğrudan yanı sıra bölgeler değil teslim edildi her nerede vektör kontrol için. Gelişimi beri SD-Ekim kullanımı kabul olması ve Oftalmoloji araştırmacılar tarafından kullanılan devam etti ve şimdi fare veya kemirgen modelleri13,25Retina bilimsel çalışmalarda Retina Görüntüleme standartları olarak kabul edilir. HR-SD-Ekim ve yazılım yeteneklerini başarılı kantitatif gen tedavisi sürecinde hayvan modeli seçimi, seçilmiş dejenerasyon karakterizasyonu dahil olmak üzere her aşamada fare modellerinde amacı daha fazla için benzersiz entegre şekilde kullanılmıştır hastalık modelleri, tedavi teslim, eşleme vektör teslim ve toksisite/etkinlik değerlendirme. HR-SD-Ekim kullanımı daha etkili uyuşturucu bulma işleminin her düzeyde sağlar. Burada kullanılan bu yaklaşımlar RNA ilaç keşif programımızda açıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan iletişim kuralları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitelerinin VA WNY HCS ve SUNY Buffalo Üniversitesi tarafından onaylanmış. Hayvanlar dernek hükümlerine göre araştırma vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) ve Helsinki Deklarasyonu için kullanılmıştır.
1. fare modelleri
- Denetimleri de dahil olmak üzere değerlendirilecek fare modelleri tanımlayın.
Not: Görüntüleme için bir C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT gerçekleştirilen / mWT, kısmen insanlaşmış fare Retina dejenerasyonu manken insan mutant RHOP347S hC1 allelleri vahşi-türü (WT) için homozigoz fare RHO+/ + genotip26 , 27, hC1 BL/6(J), kısmen insanlaşmış manken mutant insan RHOP347S hC1 alleli WT fare RHOüzerinde tek bir kopyası ile x+ / + genotip (hC1 /-/ / mWT/mWT) (hC1/hC1 / / mWT crossing tarafından elde edilen/mWT C57BL/6 () ile J) fareler). Otozomal dominant retinitis pigmentosa (adRP) C57BL/6(J) özgeçmişlerine modellerdir. Homozigoz iki fare RHO nakavt arka plan üzerinde insan WT RHO gen kopyası için bir fare modeli de kullanılan28,29oldu. Bu çizgi üzerinde 129Sv arka plan var. Bu fare RHO nakavt ile 129Sv özgeçmişlerine çizgiyi, insan RHO tek bir doz fare RHO arka plan ortaya çıkar. - Deneysel tasarım için uygun koşulları aşağıdaki hayvanları korumak.
Not: Hayvanlar içinde hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi birimi (VMU) VA WNY HCS yönü muhafaza. Fareler beslenen Standart laboratuvar chow ve yetişkin altında 12 h:12 h ışık: yumuşak floresan yükü ile karanlık devir beyaz ışıkları ile yaklaşık 300 Lüks yaklaşık 72 ˚F, kafes düzeyinde.
2. fare göz jeli
- Retinal görüntüleme30 ve cerrahi işlemler için kullanılan optik jel hazırlayın.
- 2 mg/mL w/v yüksek molekül ağırlıklı (4 x 106 g/mol Karbomer fosfat Buffered Saline (PBS) x steril 1. birleştirin
- Oda sıcaklığında mix jel viskoz bir optik şeffaf jel oluşturur kadar.
- Jel küçük steril şişe aktarmak ve sallanan bir kova Masa Üstü Santrifüj sıkışmış hava kabarcıkları kaldırmak için 350 x g, santrifüj kapasitesi.
- Jel doğrudan kornea fare kornea ve bir sigorta primi kapak cam (18 x 18 mm) arasında bir arabirim oluşturmak için uygulanır.
3. insan kaynakları-SD-Ekim görüntüleme
- HR-SD-Ekim aygıt (Şekil 1) bakın.
- Anestezi uygun doz belirlemek için hayvan tartın. Sonra 25 µL/g % 2.5 çözüm tamponlu 2,2,2-tribromoethyl alkol (Avertin) çözüm yolu ile mayi enjeksiyon (IP) vücut ağırlığının kullanarak fare anestezi ve hayvan immobilize sonra öğrenciler genişletmek için göz damlası ekleyin.
- Hayvan tam bir ayak çimdik tarafından anestezi onaylayın ve hayvan tepki emin olun.
- Bıyık düzeltme ve HR-SD-Ekim kızak üzerine fareyi getirin.
- Fare göz doğrudan başlığın objektif önünde konumlandırın ve kornea ve Iris bulunmaktadır kadar aşama denetimleri işlemek. Suni gözyaşları uygulayarak sulu kornea tutun.
Not: Hassas ayar micromanipulators İK-SD-Ekim kızak üzerinde öyle ki öğrenci diyafram merkezli ve odaklı fare konumlandırmak için kullanılır. Optik başlığın sonra retina görünür hale gelir ve hayvan daha fazla olası en iyi resmi elde etmek için ayarlanır kadar gelişmiş. - İlk olarak, yazılım programı "Fare" açın ve hasta/sınav "'ı" tıklatın. İkinci olarak, "hasta Ekle" seçeneğini tıklatın ve yeni hasta pencerede hayvan tanımlamak için uygun bilgileri girin ve "Kaydet ve çık". Üçüncü olarak, "sınav"başlangıç sınav tarafından"takip Ekle" seçeneğini tıklatın. Dördüncü olarak, "özel tarama Ekle" seçeneğini tıklatın ve "dikdörtgen birimi", OD veya işletim sistemi görüntüsü göz için seçin, sonra "sınav Ekle" seçeneğini tıklatın. Son olarak, araç hedefleyen ve bölgenin ilgi almak için hayvan konumlandırma başlar. Doğru bölge bulma göz yüzeyden daha fazla görüntü kalitesini arttırmak için bir steril pamuklu aplikatör hemen önce resim alma uçlu kullanarak herhangi bir aşırı sıvı kaldırın, sonra "anlık görüntü", Başlat ve iyi bir görüntü elde ettiğinizde tıklattıktan sonra "Kaydet tarama".
Not: 900 a-taramalar/b-inceden inceye gözden geçirmek ve 90 b-taramalar/resim dikdörtgen HR-SD-Ekim görüntüler için tipik parametreleridir. 1.4 mm x 1.4 mm edinsel görüntülerdir. Yansıma retina bölgenin belirli deney üzerinde bağlıdır, ancak çoğu görüntü optik sinir başı (ONH) ortalanır.
4. varlığı, hızı ve Model dış Retina dejenerasyonlar tekdüzelik değerlendirilmesi
- HR-SD-Ekim tarafından dış Retina dejenerasyonu modeli değerlendirilmesi
- Yaş için denetim ve durum, hızı ve dış Retina dejenerasyonu tekdüzelik değerlendirmek için deneysel konularda geniş bir yelpazede hayvanlarla edinin.
- HR-SD-Ekim görüntüleme her yaştan itibaren her iki tabur (hastalık ve normal), birden çok hayvanlar üzerinde gerçekleştirin. OCT görüntü elde etmek 3.1.6 içinde açıklanan yöntemi kullanın.
Not: Veri geniş bir zaman (1 yıl) aralığını kapsayan Doğum günü dağıtılan, hayvanlar tek seferde büyük bir kohort toplanabilir veya hayvan küçük bir kohort benzer sonuçları elde etmek için süre (1 yıl) uzun bir süre içinde birden fazla resim toplamak için kullanılabilir. - Kaydedilen HR-SD-Ekim dikdörtgen birim yansıması açın ve ölçülecek ilk b tarama tanımlamak (ideal olarak ONH veya diğer kişisel Simgesel Yapı içerecektir) üzerinden fotoğraf topluluğu. Yakınlaştırma özelliği yazılımımı ekranı kaplayacak şekilde büyütmek.
- Çap pergeli istediğiniz sayıyı b-tarama görüntü üzerinde sağ tıklayarak ve daha sonra "Kumpasları" tıklayarak ve nihayet istenildiği kadar Çap pergeli tıklayarak açın (1 ile 10 arasında numaralandırılır). Çap pergeli resmin alt sağ köşesinde ortaya emin olun. "Halife yapılandırma" özelliğini kullanarak atama onları bütün olarak "dikey" açı blok sütun ve "görüntü Kaliper Tekdüzen yerleşim arasında retina kolaylaştırmak ve nihayet, tıkırtı için yeri" açmak içinde geçerlidir.
Not: 1st Kaliper oculus dexter (OD) sağ gözü işlerken görüntü sol tarafta yer almalıdır ve 1st Kaliper oculus uğursuz (OS) sol gözünü görüntülerin işlenmesi sırasında görüntünün sağ tarafında yer almalıdır. Bu bir burun içinde sol ve sağ gözler için tüm verilerin geçici yönlendirme için komplo oluşur. - Bilgisayar fare hareket ettirmek istimal her Kaliper istediğiniz konuma (2.0 mm apart) b-tarama, bir kumpas dahil b taramalı görüntüler optik sinir başının ortasına yerleştirmek emin olmak arasında (Bu kumpas sıfır olarak küme). Sonra fareyi tıklatın ve Kaliper bölgenin ilgi span uzunluğa sürükleyin için kullanın. Keyfi değil ölçülebilir maksimum uzunluğu b taramaya bölgelerinde yer paylaşımı, ve veri çözümleme sırasında göz ardı Çap pergeli ayarlayın.
- Yanında duvar ilanı Kaliper üst dış sınırlayıcı membran (ELM) ve Dış pleksiform tabaka (OPL) altındaki gövde altında Kaliper araçlarını kullanarak dit kalınlık ölçer. Bu 0.2 mm aralıklarla, retina arasında her Kaliper için yineleyin. Ölçümler kaydedin.
- Tüm kaliperleri yerleştirilmiş ve boyutunu için sonra resmin üzerine sağ tıklayın ve "Kaliper verileri kaydet"'i tıklatın.
- Sonraki b-(her 10th tarama işleri de) inceden inceye gözden geçirmek aynı dikdörtgen biriminden gelen üstün bölgeler için aşağı tüm retina kapsayan OCT görüntü üzerinde ölçümler yineleyin. Çap pergeli, açık ve x ekseni aynı konumda kalmalıdır. X yönünde hareket ettirmeden Kumpasları uzunluğunu ayarlayın.
- İşlenmiş b tarama yanındaki küçük dosya simgesini tıklatarak veri dosyalarını görüntü ve "Data git" düğmesini tıklayıp kayıt açın. Tıklatın "kaydedilen zamanına göre sırayla dosyaları düzenlemek ve ölçülen her b tarama için tüm dosyaları açmak için tarihi değiştirildi.
- Her b-tarama ham verileri tek bir dosya için en yüksek temel çerçeve numarası üzerinde sırayla en düşükten derlemesi. "Halife adı", "Uzunluk" ve "Merkezi X" de dahil olmak üzere veri sütunları seçin.
- Merkezi X tüm b-işlenen her dikdörtgen birim OCT yansıması için ölçülen inceden inceye gözden geçirmek için aynı olduğundan emin olun. Ölçümleri kaydetmek için kullanılan değildi Çap pergeli tüm verileri silmek ve sıfır olarak optik sinir başı merkezinde bulunan Halife ayarlayın.
- X için verileri birden çok Y veri kümesi dit genel kalınlığı çizilecek bir 3D çizim işlev elde etmek için vs çizmek ya da başka bir Retina tabakası ölçülen.
- Denetim ile ilgili yaş oranı ve herhangi bir potansiyel Retina dejenerasyonu tekdüzelik belirlemek için deneysel hayvan arasında dit ölçümlerin karşılaştırıldığında.
- Aynı b-tarama görüntüleri kullanarak OSL ölçüleri için tekrarlayın. Çap pergeli karaağaç ve Bruch'ın membran (BM) arasında yerleştirerek dışında dit, ölçmek için kullanılan aynı yöntemi izleyin.
Not: Kaliper yerleştirmek nasıl bir örnek (Şekil 3B) temsilcisi sonuçları bölümünde gösterilir. Bu hata azaltmak için bir içinde yakınlaştırılmış görüntü üzerinde yapılmalıdır. - Veri analizi için birden fazla hayvan her Doğum günü için hem deneysel ve denetim tabur için yineleyin.
- Kapsamlı ölçüm ve 3D mapping yazılım Çap pergeli aracını kullanarak dit veya OSL kalınlıkta
- Yazı enjeksiyon OCT resimleri gözden geçirin ve herhangi bir tanımlanabilir tarihi yerler, ONH veya kan damarlarının retina gibi not edin. Sonra bir izleme SD-Ekim aynı bölgeden elde etmek ve aynı olarak tanımlanabilir işaretlerini eklemeyi unutmayın için fareyi getirin.
Not: Retina görüntülü ve Retina dekolmanı söz konusu bölgenin posta enjeksiyon SD-Ekim Albümdeki tanımlanır emin olun. Bir dikdörtgen birimi SD-Ekim görüntü kaydetmek ve kaydedin. - Yukarıda açıklanan adımlardaki gibi kaydedilen görüntüleri işlemek 4.1.3. için 4.1.14. Kaliper veri ve yukarıda açıklandığı gibi arsa kaydedin.
Not: Sonuçta elde edilen dizinin dit ölçümlerin dit kalınlığı resmeden bir 3D çizim oluşturmak için kullanılır. Çap pergeli x ekseni boyunca konumunu bir grafiğin x ekseni boyunca kökenli (0), optik sinir yerleştirerek replot izin verir. Y ekseni b-tarama numarası kullanılarak çizilir ve optik siniri daha sonra bir düzgün y ekseni köken, optik sinir pozisyonu sağlar başlangıç noktasını tanımlamak için kullanılır. Optik sinir içinde her bir veri kümesi tanımlama güvenilir bir şekilde hizalanmasını takip görüntüleri sağlar.
- Yazı enjeksiyon OCT resimleri gözden geçirin ve herhangi bir tanımlanabilir tarihi yerler, ONH veya kan damarlarının retina gibi not edin. Sonra bir izleme SD-Ekim aynı bölgeden elde etmek ve aynı olarak tanımlanabilir işaretlerini eklemeyi unutmayın için fareyi getirin.
- Enjeksiyon yeri fundus resim üzerine ölçüde eşleme
- Yazı enjeksiyon dikdörtgen birim OCT enjeksiyon başarısı onaylamak için gerçekleştirin. Açıklanan yöntemi takip 3.6.
- B-inceden inceye gözden geçirmek tüm OCT resim kapsayan bir dizi müstakil retina dönüm noktası sınır belirlemek için yazılımda Kaliper özelliğini kullanın. Çap pergeli açıklanan açmak için yöntemini kullanın 4.1.4.
- Fundus görüntüleri OCT b-inceden inceye gözden geçirmek ve karşılık gelen Kaliper konumdaki konumuna karşılık gelen fundus görüntü üzerinde eşlenen konumla kaydetmek.
- Fundus görüntülerin tüm enjeksiyon izi fundus bileştirir (örnekte temsilcisi sonuçları bölümü, Şekil 5A) kesin bir harita, sonuçları Kaliper pozisyonları dahil olmak üzere bir kompozit görüntü, içine derleyin.
5. göz içi enjeksiyonları
Not: RIS kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi daha fazla bir son çalışma23' oluşturulmamıştır.
- Cam enjeksiyon iğneler hazırlanıyor
- Otoklav filamentler kuru döngüsü kullanılarak küçük gruplar halinde ile kılcal tüpler.
- Bir pipet puller ve set-up bir cam ucu keskin açı ve çapı 2-5 µm yelpazesi ile üretecek bir program kullanın.
Not: Bizim pipet çektirme üzerinde etkili iğneler üretilen örnek 5 adım programının bir Tablo 1' de gösterilen. - Çekti cam iğne oda sıcaklığında pipet steril iğne kavanozda saklayın.
- Enjeksiyon iğneyi enjeksiyon için istenen çözüm ile doldurmak
- İğne iğne bağı, yaklaşık 5/8 sahibi sonu çıkıntılı "bırakarak içine monte.
Not: A mesafe 5/8" zor ulaşmak-ecek yapmak o daha az iğne doldurmak için enjeksiyon çözüm iğne bağı 0.2 mL tüpler açılış içine kolayca uymuyor çünkü. Ayrıca, 5/8" önemli ölçüde daha büyük salınım veya gerçek zamanlı görüntüleme yapraklar ipucu odak düzlem veya görüş alanı (FOV), göz ponksiyon çalışırken bu yana zor yapım belgili tanımlık uç, devinim sonuçlarında daha fazla çıkıntı iğne sahip. - Enjeksiyon çözüm bir steril 0.2 mL Tüp hazırlayın. 1:10 Ekle seyreltme floresein 1 mg/mL, son bir konsantrasyon elde etmek için enjeksiyon çözüm için steril floresein sülfatın (10 mg/mL 1 x PBS).
Not: Kullanılan tam boya kullanıcıya özeldir ve toksik olmayan ve çıplak gözle RPE ve subretinal alanı düzeyinde iğne ucu kesin yerleşimini kolaylaştırmak için beyaz ışık aydınlatma altında herhangi bir şey olabilir. - İğne ile stereo mikroskop iğne iğne doldurmak için kullanılacak enjeksiyon solüsyon içeren tüp merkezi ile uyumlu şekilde konumlandırmak için 3 eksenli micromanipulator kontrol düğmeleri kullanırken gözünün önüne getir.
- Dikkatli iğne ucu sıvı batık kadar iğne ucu 0.2 mL tüp içine sür. Tek bir enjeksiyon için gerekli iğne içine enjeksiyon sıvısı (Örneğin 1 µL) istenen sesini çizin. Buzun içine yerleştirilen tüp içinde kalan çözüm korumak.
- İğne iğne bağı, yaklaşık 5/8 sahibi sonu çıkıntılı "bırakarak içine monte.
- Hayvan enjeksiyon için hazırlanıyor
Not: RIS mikroskop temiz tutulur ve temassız sistemidir. Isıtma yüzeyi temiz adsorbent bir yastık ile kaplıdır ve iğneler çekti önce autoclaved. Sonra kendi kendine sterilizing bir ısıtmalı metal şerit tarafından alınır, onlar çekti cam iğneler tutmak için tasarlanmış bir kapalı steril odasında tutulur. İğneler yalnızca eldivenli ellerini kullanarak işlem görür ve bakım yuvasına montaj sırasında iğne ucu dokunmadan önlemek için kullanılır. Enjekte çözümleri steril tekniği kullanılarak hazırlanır ve kirlenme için bir örnek virüs hazırlıkları LB ağar kaplamalar üzerine çizgiler ve onları üzerinden 37 ˚C geceleri kuluçka tarafından test edilir.- Anestezik analjezik uygun doz belirlemek için hayvan (g) tartmak.
- Anestezik (% 2.5 çözüm tamponlu 2,2,2-tribromoethyl alkol (Avertin)) üzerinden mayi enjeksiyon (IP) yönetmek için.
- Hemen antikolinerjik ilaçlar (Örneğin, cyclopentylate) öğrenciler genişletmek için her iki gözde uygulanır.
- Hayvanın bıyık düzeltme ve kulak yumruk veya başka bir yöntemi kullanarak hayvan sayısı.
- Göz ve çevresi seyreltilmiş betadin ile yıkayın.
Not: Bu kasıtsız boğulma neden olabileceğinden burun etrafında herhangi bir çözüm almamak. - Fare doğru iğne enjekte edilir önceden şekillendirilmiş standart Modelleyici'nın kil fare tutucu gözle 39 ˚C, tutulan ısıtma yastığını yerleştirin.
- Fareyi kullanarak bir tutam test arka ayak yanıt vermemesine neden olur emin olun.
- Subretinal enjeksiyon gerçekleştirme
- Steril künt Iris forseps çifti proptosis dünyanın 7 ve 10: 00 pozisyonlar iterek süre göz kapaklarının üzerinde pensler uçları Açık ve aşağı doğru aynı anda yanında duvar ilanı nazikçe ikna etmek için kullanın.
- Forseps enjeksiyon işlemi sırasında yerinden tutmak için göz küre altında göz kapakları koaksiyel için kullanın.
Not: Hayvanlar 10-14 gün eski kez göz yuvasından büyük hayvanlar daha kolay yapacak. - Yaklaşık 1-1.5 mm aşağıda kornea limbus kenarı iğne ucu doğrudan ve dikkatle iğne sklera dokusuna nüfuz eder ve göz manipülasyon sağlar gibi bir scleral depresyon oluşturur kadar konjonktiva gözünden içine götürmek.
- Aşağı doğru gözle scleral depresyon ile dilate pupil RIS stereo mikroskopla görselleştirmek için micromanipulator döndürün.
- Steril göz jeli veya 1 x PBS çözüm ve steril coverslip kapaklı bir damla uygulanır.
- İğne (2-5 µm), disk ve iğne ileri retina formları enjeksiyon yerinde keskin zirvesine kadar ucu tarafından oluşturulan scleral depresyon odaklanmak.
- İğne ucu ile sklera sıkar ve iğne floresein RPE hücre monolayer hemen yakınında retinada altında görünür kadar tutucu kullanarak döndürün.
- Yani dünyanın teğet iğne ucu sürücü ve ayak pedalı anahtarı ile enjeksiyon pompası etkinleştirin.
- Sonra istediğiniz birimin teslim (0.5-1 µL) iğne subretinal boşluğa, çekilme ve kontrol bleb stabil ve o sıvıyı ilk ölçüt başarılı bir enjeksiyon enjeksiyon yeri dışında kaçak değil.
Not: Uygun uç çapı Bakımı (2-5 µm çapı) enjeksiyon sitesinden kaçağı önlemek için önemlidir. - Hayvan OCT enstrüman görüntüleme platformu üzerinde yerleştirin. Bir dikdörtgen birim görüntü kaydetmek için HR-SD OCT görüntüleme için yönergeleri izleyin.
- Enjekte sıvının subretinal uzayda ve bleb kapsamını belirlemek için görüntüleri kaydet bulunduğu olduğunu doğrulayın.
- Hayvan tutucusunu kaldırmak ve antibiyotikli bir krem bol miktarda enjekte gözler için geçerlidir.
- Bu tamamen kurtarır, sonra geri geldiği yere özgün kafes içine yerleştirin kadar hayvan ısıtma yastığını üzerine koyun.
Not: Bizim hayvanlar genellikle sütten kesme önce enjekte edilir, bu nedenle hayvanların annesi ile kafes geri gerekir.
- OCT enstrüman yazılım araçları kullanılarak subretinal bleb ölçüde eşleme.
- Bleb daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak bir dikdörtgen birim OCT resmi elde etmek ve tanınabilir bir dönüm noktası ONH gibi göz içinde içerecek şekilde konumlandırın.
Not: 90 b-inceden inceye gözden geçirmek kayıt çalışır bleb eşlemek için fakat istenen çözünürlüğü bağlı olarak kullanılabilir. - Ve nerede retina RPE ve koroid ayırır dönüm noktasında yer tek bir kumpas şekil için ekleyin.
Not: Yazılım karşılık gelen bir nokta temsil eden Halife ve değerlendirilen b tarama fundus resim üzerine bir çizgi otomatik olarak eşleştirir. - Kumpasları yerleşimini aşağıdaki ekran yakalama ve görüntüleri etkili enjeksiyon bleb hassas enjeksiyon site haritaları fundus görüntü üzerine kenarlığını eşlemek için derleyin. Başvuru sırasında izleme görüntüleme faiz bölgelerinde bulunmasına yardım etmek için derlenmiş resmi kaydedin.
Not: Alternatif olarak, Kaliper veri kaydedilebilir, uyulması ve çizim 3D veri kümeleri için dit kalınlıkta benzer bir yöntemle çizilen.
- Bleb daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak bir dikdörtgen birim OCT resmi elde etmek ve tanınabilir bir dönüm noktası ONH gibi göz içinde içerecek şekilde konumlandırın.
- Intravitreal enjeksiyon
- İğneyi tamamen sklera ile pars plana yaklaşık 0,25 mm kornea limbus arkasında ve vitre içine tahrik dışında alt retinal enjeksiyon, benzer bir cerrahi yaklaşım kullanarak iğne ucu yerleştirin.
- İğne yerleşim ayak pedalı ile enjeksiyon darbe uygulayın.
Not: Dilate pupil diyafram ile floresan doldurma floresein boya kadeh vitre boyunca hızlı bir difüzyon görülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varlığı, hızı ve Model dış Retina dejenerasyonu tekdüzelik değerlendirilmesi
LNIZCA ölçümleri OPL araç yazılım sağlanan Kaliper aracını kullanarak dit sınırlarını tanımlama karaağaç için kaydedildi. Kısmen insanlaşmış adRP fare modeli dış Retina dejenerasyonu ilerlemesini eşlemek için hedefi oldu. Bir denetim C57BL/6(J) fare ve bir hC1/hC1 / / mWT karşılaştırılabilir görüntüleri/mWT fare modeli, iki kopya mutant insan çubuk opsin (RHOP347S) genlerin ifade denetim Retina bulgular ve bu ciddi bir sergi için gösterildi ve hızla progressive retinal dejeneratif durumu. 3-hafta-yaşlı adRP (hC1 BL/6(J)) hayvan, mutant insan RHOP347S genini yalnızca tek bir kopyası ve iki kopya fare WT RHO genlerin sahip x normal dit kalınlığı vardı. Ancak, bu zaman dilimi içinde dit inceltme olarak tanınan photoreceptors yaklaşık % %60 kaybına sonuçlanan 10 ve 37 hafta gösterdiği geçici ilerici ve dağınık şekilde düzgün Retina dejenerasyonu, takip HR-SD-Ekim tarar. BL/6(J) adRP modeli x hC1 içinde Retina dejenerasyonu 13 hafta yaklaşık süre sabiti (1/e) vardır. Homozigoz hC1 hayvanlar, iki dozlarda toksik mutant insan transgene WT RHO arka plan, fare üzerinde çok daha hızlı bir dejenerasyon geniş Retina incelme ve tüm photoreceptors aslında tam kaybı tarafından 3 tarafından gösterildiği gibi acı hafta-in yaş (Şekil 2).
LNIZCA ölçü photoreceptor canlılık dizini olarak dış Retina normallik sadece bir bileşenidir. Photoreceptors ve iç segment/dış segment OSL (IS / OS) veya elips satırındaki sağlamak kanıt photoreceptor canlılık ve işlevi desteklemek. Karşılaştırmalar (N129R - x 129R-) bir veya iki (2HRho 1T1T) (doz) kopyasını fare WT RHO nakavt arka plan üzerinde insan WT RHO genleri içeren için yetiştirilen hayvanlar için dış retina kalınlık ölçüldü. İki fareler için insan gen tek bir kopyası ile karşılaştırıldığında insan WT RHO gen kopyası ile farelerde dit ~ 8 µm istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenmiştir. İki insan WT RHO gen fare WT RHO nakavt arka plan üzerinde bir kopyasını vs ile farelerde OSL ~ 5 µm istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenmiştir. Ne kadar yalnız ve OSL ölçümler yapılmış bir örnek Şekil 3' te gösterilmiştir. HR-SD-Ekim sistemi ile yakalanan görüntüleri yüksek çözünürlüklü dit veya katı istatistiksel güvenilirlik insanlaşmış WT RHO fare modelleri ile ayrımcılık küçük farklılıklar izin OSL doğru ölçümler sağlar.
Aralığı, cerrahi sonuçları ayrıntılı tarafından OCT zaman çalışırken Subretinal enjeksiyon
Teşebbüs subretinal enjeksiyonları HR-SD-Ekim değerlendirme sonuçları çeşitli vermiştir. İlk olarak, en yaygın enjekte sıvı içindeki alt Retina alanı başarıyla teslim edildiği onay bir tecrübeydi. (Bu geliştirme sırasında kapanır) örtülü subretinal alanının açılış açıkça görüntülenmeyecektir bir bleb tr yüz görünümü, HR-SD-Ekim ve b taramalı görüntüler oluşturdu. Hipo-yansıtıcı sıvı yukarıda sinirsel retina ve yansıtıcı hiper RPE hücre katmanı hala BM, aşağıda (Şekil 4) için karşı tarafından sınırlanmıştır. Hayvan HR-SD-Ekim tarafından hemen enjeksiyon sonra (aşağıya bakın) görüntüsü Eğer subretinal enjeksiyon ölçüde tespit edilemedi. İkinci olarak, enjeksiyon (BM altında) choroidal uzayda meydana gelebilir yerine subretinal boşluğa. Bu kubbe Retina sıvı yerlerinden bölgesinin sınırlayıcı bir yansıtıcı hiper katmanda (RPE) sonuçlandı ve hiper yok yansıtırlık OCT'de göz posterior sınırları, b-inceden inceye gözden geçirmek. Üçüncü, subretinal enjeksiyon girişimi sırasında meydana gelebilecek başka bir olası sonuç (sinir lifi katmanında bölme) bir retina schisis oldu. Bu sonuç normal dış retina anatomi vermiştir ama iç tabaka Retina veya camsı istila değil bleb saklanmış. Prensip olarak, böyle bir schisis model enjeksiyonlu sinirsel retina uygun laminasyonları içinde herhangi bir yerde oluşabilir ama biz sadece sinir lifi tabakası schisis tarihe gördük. Dördüncü olarak, bir intravitreal enjeksiyon da oluşabilir, OCT üzerinde hiçbir etkisi olduğu. Tüm bu hatalar nedeniyle anahtarlamalı akış enjeksiyon aygıt basınç Başkanı enjeksiyon sırasında cam iğne ucu veya belki de bazı küçük hareket iğne saklanmalıdır ilk neden.
Subretinal enjeksiyon konumunu karakterize
Etkinlik ya da toksisite aday tedavilerin belirlemede önemli bir faktör değil-si olmak vektör vs bu alınan Retina bölgeleri karşılaştırmak için yeteneğidir. Biz böylece izleme sınavları sırasında nerede tedaviler uygulandı, retina alansal ölçüde teşhis edebilir retina bölge subretinal enjeksiyonları katılan işaretlemek için bir araç geliştirme içine önemli çabaları yönetmen ve dolayısıyla nerede iletim mümkün. Altın NPs veya değil enjekte edildi retina bölgelerin belirlenmesinde güven yüksek düzeyde izin. Ancak, belirli parçacıkları veya onların formülasyon bir şiddetli yerelleştirilmiş Retina dejenerasyonu sitesinde subretinal enjeksiyonu ile 24 saat mesaj enjeksiyon (veri gösterilmez) içinde sonuçlandı ve zehirli olduğu ortaya çıktı. Bu nedenle, enjeksiyon sitesinden doğrudan HR-SD-Ekim görüntüleme veri eşleme alternatif bir yöntem geliştirdik. Tam olarak Enjeksiyon Makinası sınırları tanımlamak için bir yöntem ölçüm araçları (Çap pergeli) araç (Şekil 5) yazılım paketi kullanılarak geliştirilmiştir. Biz tam olarak bireysel b-fundus görüntüsünü oluşturmak için kullanılan taramaları (üstün retina daha aşağı) incelenerek bleb kenarına teşhis edebilir. Bir kumpas bleb bağlı retina kesiştiği noktada yerleştirirken, Kaliper konumunu otomatik olarak karşılık gelen b-tarama Kaliper neredeydi kesin konum x ekseni boyunca, tr yüz fundus görüntünün üzerine eşleştirilir b-tarama yerleştirilir. Bu işlem yinelenen bir kenarına bir tr yüz fundus resim üzerine bleb izlemek izin verir. Hizalama işlemi her zaman sabit optik sinir göre Retina kan damarları veri segregasyon önce birden çok görüntülerden hizalamak için döndürülecek baş ve görüntüleri gerekebilir, Retina benzer bölgeler yansıma gerektirir. Post enjeksiyon görüntü ve sonraki takip görüntülerin uyum sürecini takiben, enjeksiyon bölgesi Retina dekolmanı ilgili bölgedeki ölçülerini konumunu tanımlamak için veri noktası Kılavuzu üzerinde üst üste. Bu veriler veri noktaları içine alan-in enjeksiyon siteye enjeksiyon sitesinin dışındaki bölgelere göre tanımlamak için görsel bir araç sağlanan bir yüzey harita olarak çizilen.
LNIZCA kalınlığı 3D eşleme
Son olarak, biz dit, OSL veya diğer Retina katmanlardan ölçülerini Retina görüntülü tüm bölgede kaydetmek ve yüzey Arsa (Şekil 5) kullanarak verileri çizmek. Enjeksiyon yeri sınır Haritası superimposing enjekte bölge ve enjeksiyon işlemi sırasında ilişkisi kesildi değil bölgenin de dahil olmak üzere iki veri kümesi ayrım sağlar. Daha fazla işleme ve veri analizi sonra belirli terapötik ajanlar Retina dejenerasyonu kurtarmak veya toksisite neden hipotezler test etmek için iki bu veri setlerinde gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım potansiyel olarak ve aynı göz bölgelerinde enjekte vs Sigara enjekte karşılaştırarak bir tek göz tahsil edilecek veri denetimi Deneysel verir.
Resim 1 : UHR-SD-Ekim cihaz. Kullanılan İK-SD-Ekim aygıt gösterilir. Enstrüman raf(a)içerir (bir) bilgisayar monitörü, klavye ve fare (b), sonda arayüzü kutusu (c), OCT motoru (d), (e) bilgisayar, kontrol cihazı için süper Işıksaçan (g) yayan diyotlar (kızılötesi) (f) ve kesintisiz güç kaynağı. Optik Bank (B) görüntüleme sonda optik kafa (için fare retina) içerir (h), çok eksenli (doğrusal hem de rotasyonel) manipülatör (ı) ve bir fare konu (j). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Progressive dış Retina dejenerasyonu HR-SD-Ekim tarafından ölçülen kısmen insanlaşmış adRP modeli (A)retina görüntülerini HR-SD-Ekim adRP modeli için elde (hC1 x BL/6 (J)) farklı yaş, 14 haftalık C57BL/6(J) kumandayı ve 3 hafta homozigoz hC1 mutant satırında. Dış retina adRP modelinde 3 hafta normal bir görünüm vardı, ama ilerici dit inceltme ve dağınıklığı ve 10 hafta-in yaş ötesinde bir kanıt. 37 hafta tarafından (hC1 gösterdi BL/6(J)) geniş dış Retina dejenerasyonu x. Tüm OCT taramaları optik sinir bölgede vardı. (B) dit kalınlığı (mm) boyunca yatay eksen optik siniri aracılığıyla kontrol (C57BL/6(J)), hC1 ve adRP hayvanlar farklı yaştan. çizildi LNIZCA kalınlıkta kısmen insanlaşmış adRP modeli, ilerici kaybı oldu. LNIZCA kaybı tarafından 37 hafta-in yaş 60 %'den büyük. Hata çubukları ortalama standart hatası =. Kırmızı ölçek çubuğu = 200 µm ve tüm belgili tanımlık imge are aynı ölçek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : HR-SD-Ekim kullanarak dış nükleer tabaka ve dış segment uzunlukta nicel ölçüler (A)fare dit ve OSL önlemler göstermek için kullanılan çizgiler. OCT temsilcisi Images üzerinden 2HRho1T/1T (2 doz HRho) fare RHO nakavt arka plan üzerinde) (sol paneli) ve (bir insan RHO fare RHO nakavt arka plan üzerinde doz) N129R - x 129R-(sağ paneli). (B) Çap pergeli dit (kırmızı) ve OSL (mavi) ölçmek için nasıl yerleştirildi bir örneği gösterilir. (C) verileri elde edilen her satırın üç hayvanlardan yalnız kalınlık N129R - x 129R-ile 2HRho1T/1T çizgi karşılaştırması gösterilen çubuk grafik biçiminde çizildi için (sol kapı aynası). 2HRho1T/1T çizgi ~ 8 µm vardır kalın dit. OSL farklılıkları göstermek için birden çok ölçümleri (yedi) bir b-taramasından ELM BM B (mavi çizgi) olduğu gibi her fare satırla gelen 9-hafta-yaşlı hayvanlarda (sağ paneli) yapılmıştır. Bu OSL HRho gen kopyalarını 1 vs 2 hayvanlar arasında bir ~ 5 µm fark gösterilmektedir. LNIZCA ve OSL önlemleri istatistiksel olarak anlamlı dit p-değeri = 1.7e-5 ve OSL p-değeri = 6.4e-5. Hata çubukları ortalama standart hatası =. Kırmızı ölçek çubuğu 100 µm = hem 3A'b tarama aynı ölçek var, 3B yakınlaştırılmış Retina katmanları netliğini artırmak için ve nasıl ölçümleri satın alınan bir nitel gösteri sağlamak için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : HR-SD-Ekim tarafından tanımlanan farelerde göz içi enjeksiyonları türleri (A). A (hC1xBL/6(J)) fare enjekte ~ 1 µL Inferonasal transcleral transchoroidal enjeksiyon yoluyla sıvı ile. Elde edilen Retina dekolmanı resmin sağ tarafında bleb öncü, keskin bir sınır oluşturma tr yüz görüntünün yeşil alt sağ bölge olarak görülür. Görüntü tüm b-inceden inceye gözden geçirmek--dan tüm belgili tanımlık retina kalınlık bir derleme olduğundan bir enjeksiyon izi OCT fundus görüntüsünü yalnızca sıvı dolu kavite, pozisyon bağlı olarak ince farklar sergiler. Buna ek olarak, enjeksiyon bleb enjeksiyon yerinde odaklanmamış bir bölge üreten OCT başlığın retina yüzeyine olan uzaklığı değiştirir. (B) OCT b-inceden inceye gözden geçirmek bir sigara enjekte retina gösterilmiştir. ONH olarak adlandırılır. (C) A subretinal enjeksiyon gösterilmiştir. ONH etiketli ve tr yüz görüntü (sağ panelleri) okları dekolmanı posterior kenarlığını göster. (D) A choroidal enjeksiyon bir açık ayrıcalık yükselmesi RPE tabakası (yansıtıcı hiper eğri) retina (oklar) alt kenarını ve hiper-yansıtırlık RPE, önemli kaybına ve choroid katmanları aşağıdaki ile (yukarı doğru deplasman) gösterdi enjekte sıvı. Oklar (C ve D) görüntüleri karşılaştırın. (E) A Retina schisis sinir lifi tabakası gösterilmiştir. RPE için bağlı retina kalır iken enjekte sıvı Kapsüllenen çok ince yansıtıcı hiper zar gözlemlemek. Üç farklı sökümleri arasındaki ince farkları da tr yüz görüntüleri (C, D ve E) görüntülenmeyecektir. Subretinal dekolmanı choroidal enjeksiyon bleb öncü bir bulanık hiper yansıtıcı RIM oluştururken ( c), okları görselleştirmek zor olan bir kenarlığı vardır ve Retina schisis keskin sınır tarafından belirgindir, öncü (E). Her ikisi de kırmızı ölçek çubukları 200 µm 4B =. Tüm görüntüleri 4B 4E üzerinden aynı şekilde ölçeklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Haritalama ve miktarının dış Retina değişiklikleri Subretinal enjeksiyon takip. Bir yöntem takip vektör, subretinal enjeksiyon ile 3D olarak çizme birden çok OCT b-taramaları dit ölçümlerin vardı fareler incelenmesi sırasında ilgi bölgeleri tanımlamak için geliştirilmiştir. 2HRho1T/1T hayvan GFP ve kurşun aday çekiç ribozyme (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) ifade öz-tamamlayıcı adeno ilişkili virüs enjekte ettiler (OS göz) toksisite ekranda. (A)yansıma, hemen yanında duvar ilanı Çap pergeli bleb nerede dış segmentleri RPE b-taramaları (sol paneli (kırmızı Kaliper)) üzerinden ayrı noktada öncü, enjeksiyon alansal ölçüde eşlendi. Kaliper aracın konumunu fundus görüntüye otomatik olarak eşleştirilir ve bu tekrarlanan ve çok sayıda b-inceden inceye gözden geçirmek için gerektiği gibi istediğiniz çözünürlüğü (her 5inci inceden inceye gözden geçirmek (A) (doğru kapı aynası)) üzerine bağlı derlenmiş. Sonraki OCT çalışmaları (her 2 hafta) retina superimposition izin vermek için aynı bölgenin görüntüsü; ONH ve retina damarları Kartezyen veya döngüsel ayarlamayı kolaylaştırmak için yerler vardır. (OPL ve ELM) gerekli sınırları görünür sağlanan tüm bölgenin Retina dit kalınlığı için ölçüldü. (Yalnız uzunluğu Kaliper pozisyonlar (renk kodlu) tekrar fundus görüntü üzerine eşlenen ve Birleşik bir resim derlenmiş enjekte yüzey üzerinde eşleştirmek içinB). Her 5inci b-tarama OCT görüntülerden retina arasında en çok on noktalarda yerleşik kaliperler ölçüldü. Görüntü Bindirmesi tarafından belirlenecek müstakil Retina bölge retina içinde veri noktaları sağlar ve ayrılmış Retina damarlara hizalamak için görüntüleme yazılımı kullanarak (C) öncesi ve sonrası derlenmiş görüntüleri döndürülür. (D) veri kümesi içine tablo biçiminde, fundus görüntü dizisine aynı eşlenmiş ve (ölçüler içinde bleb (kırmızı parlak nokta) ve olmayanlar) iki gruba ayrılır. (E) veri görselleştirme dit kalınlıkta tüm görüntülü bölge üzerinde sağlayan bir 3B yüzey çizim özelliği, kullanarak sunulmaktadır. Bu göz enjekte ve sigara enjekte bölgeler arasındaki kantitatif farklılıklar değerlendirmesini sağlar. 3D Arsa (E) yarık dit ölçümleri müstakil retinanın hemen ardından enjeksiyon ekli kaldı bölge bölge içinde veri kümesi ayırmak için kullanışlı bir yol sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Program kullanılan cam iğne yapacak. Cam yararlı iğneler subretinal için trans-scleral, transchoroidal yaklaşım tarafından elde etmek için programı parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-Ekim hayvan modellerinin potansiyel potansiyel therapeutics test kullanışlılığı belirlemek için insan hastalık karakterizasyonu için basit bir yöntem sağlar. Tedavi edici ilaç keşif (Örneğin, yerine gen tedavisi, ribozyme veya shRNA devirme gen tedavisi, kombine gen terapisi) işlemi için kritik hızla ve güvenle potansiyel bir hayvan model insan hastalığı karakterize etmek için yeteneğidir. HR-SD-Ekim karakterize ve hemen hemen her fare modelinde Retina dejenerasyonu ilerlemesini izlemek için kullanılan Retina sağlık değerlendirmek için basit, hızlı ve non-invaziv bir yöntem sağlar. OCT görüntüler herhangi bir veya tüm farklı katmanları zamanla bir dış Retina (photoreceptor) dejenerasyonu ayrıntılı bir değerlendirme veya tedavi kurtarma girişimlerinin etkisini dejenerasyon üzerinde sağlayabilir Retina ölçülerini elde etmek için kullanılabilir kapsam veya kinetik zaman çizelgesi. HR-SD-Ekim teslim vektör veya malzeme toksisitesi değerlendirmek için de kullanılabilir. Photoreceptor Retina dejenerasyonu araştırma programı üzerindeki en önemli etkisi zaman içinde canlı hayvan dit rafine ölçümleri yapmak için yeteneğidir. Bir etkinlik ve aday therapeutics aynı modelleri toksisite tedavi fırsat zamansal bir pencere üzerinde değerlendirmek için kritik bir ilk adım bir zaman sabit ayıklamak için bir retina dejenerasyonu zaman çizelgesi çizebilirsiniz. Bu teknoloji aynı zamanda değerli kaynakları (hayvanlar ve saat) önemli bir tasarruf için klasik bitiş noktası Histoloji göre araştırmacı izin vererek bir çalışma girme ve hayvanlar ortadan kaldırmak önce hayvan kohort anormallikleri tanıtılmasına olanak sağlar bu deneysel (Örneğin, başarılı subretinal teslim) ölçütlerine uymayan.
Bazı tedavi kesin teslim fare göz subretinal boşluğa ihtiyacını meydan okuyor ve HR-SD-Ekim başarılı subretinal enjeksiyonları doğru bir görsel doğrulama devam eden hayvanlarda eklenmesi için bir kriter olarak sağlar önceden klinik çalışmada tasarım. Yoğun çaba bu modeller genellikle insan Retina Dejeneratif hastalıkları nerede hastalık zaman çizelgeleri on yıl içinde ortaya taklit beri zamanla, gen terapisi çalışmalarında enjekte hayvanlar sık sık takip etmek gereklidir. Çok sayıda izleme sınavları tedavi edici etkinliği belirlemek için veya toksisitesi değerlendirmek için gereklidir. Bu kritik challenge için çözüm belirlemek ve tedavi edici vektör olarak gönderilmesi için cerrahi hataları vardır çalışma tasarımlardan hayvanlar kaldırmak için yetenek sahip olmaktır. Yeteneği yıllık tecrübesi ile iyi eğitimli bir teknisyen için başarılı bir enjeksiyon sunmak için % 90 Eğer hayvan başı yaklaşık % 80 başarı bir gözün her iki gözde enjekte Eğer enjekte yaklaştı. Bu verimlilik düzeyi ile çalışma tasarım kaldırılması başarısız enjeksiyonları ile hayvanların hipotez testleri için avantajlıdır. Bu sadece kritik zaman kazandırır ama da için daha tutarlı ve öngörülebilir sonuçları sağlar. Ayrıca, HR-SD-Ekim bir hayvanlar için her bir denemede aynı hayvanlar izin vererek hem de deneysel hayvan hayvan değişkenliği azaltır zaman içinde takip edilmesi için gereken sayısını azaltmak ve grupları denetlemek izin verir ve daha fazla verir potansiyel etkinlik ve aday therapeutics toksisitesi hakkında hipotezler sağlam istatistiksel değerlendirilmesi.
Subretinal enjeksiyonla Retina kapsama ölçüde genellikle % 100, hangi-ebilmek var olmak kendisi zehirli31,32,33,34değil. Bu nedenle, transduced ve transduced olmayan bölgeler arasında ayırt etmek için uygun kurtarma ve toksisite hipotezler için bir verilen aday tedavi test için kritik yeteneğidir. Fare gözünde subretinal enjeksiyonları kesin haritalama için kullanılabilir yazılım araçları yaratıcı kullanımı sağlar. Enjekte göz hemen görüntüleme bölgelere takip görüntüleme için yönünü ilgi ve aynı dünyanın içinde tedavi değil bölgelere transduced bölgeler karşılaştırmak için yeteneği sağlar. İstenen eşleme hassas bağlı olarak bu işlem her b tarama için gerçekleştirilebilir veya düzenli olarak b-inceden inceye gözden geçirmek topluluğu örnekleme hemen sonrası enjeksiyon ve grafik yazılımı kullanarak tek bir resim halinde tüm fundus görüntüler derleme toplanan Bu piecewise sürekli sınır dikkatle fundus yansımayı eşleştirilir. Hemen-den sonra enjeksiyon görüntülerden takip görüntüleri karşılaştırarak gerektirir görüntüleri böylece ölçüm pozisyonlar fundus görüntü üzerine eşlenen ve veri noktaları enjeksiyon yeri ve sigara enjekte bölgelerinde ayrılmış olabilir hizalanmasını Retina. Eşleme optik sinir başı ve Retina kan damarları da göz yönde sonraki takip görüntüleri ile sonrası enjeksiyon görüntüleri hizalamak çalışırken yardımcı olur bu aynı yöntemi kullanarak yapılabilir. Bu bilgileri sonraki Imaging'de enjeksiyon oluştuğu retina bölgesini tanımlamak için kullanılabilir. Hayvanlar are euthanized, tabii ki, EGFP ifade, aynı zamanda bir aday terapötik genin (Örneğin, ribozyme), içeren bir AAV vektör tarafından teslim konumunu da iletim konumunu tarafından belirlenen alan ile karşılaştırmak için kullanılabilir kan damarları konumunda dayanır görüntü eşleme. Bu alanlarda ve daha sonra kapalı subretinal alanı anatomik dekolmanı vektörde difüzyon tanımlaması sağlayacaktır.
Başarımızın altın kullanımı ile NPs subretinal bleb etiketlemek için kullanılan malzemelerin tarafından indüklenen toksisite nedeniyle sınırlı. Bu toksisite teşvik değil alternatif ürünleri (boyutları, yüzey değişiklikleri değişen) bulunabilir Eğer daha fazla araştırma bu tür malzemelerin subretinal blebs ölçüde etiketlemek için teşvik edecek.
HR-SD-Ekim önemli ölçüde daha az zaman ve kaynakları ile çok büyük miktarda bilgi sağlar ve etkinlik ve potansiyel therapeutics Histoloji gibi geleneksel yöntemleri ile karşılaştırıldığında toksisitesi hakkında daha fazla bilgi sağlamak için quantitated. Bu teknolojinin kullanımı preklinik Retina ilaç keşif35şiddetli darboğazları birini hafifletmek araştırmacı sağlar. Fare RIS ve HR-SD-Ekim preklinik Retina gen terapisi çalışmaları bizim RNA ilaç bulma programı bir bileşeni olarak yardımcı olmak için güçlü araçlardır. Bu araçları genel olarak uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ticari ilişkiler: MCB: None; JMS: yok. Retina görüntüleme sistemi (RIS)23 Bu çalışmada kullanılan fareler, kemirgenler, ya da küçük hayvan gen terapisi teslim çalışmalarda yapmak isteyen herhangi bir grup için önemli kullanım roman bir cihazdır. Yazarlar bu cihaz ile ilgili olarak şu anda bildirmek için çakışma varken, SUNY Buffalo - ve Gaziler İdaresi üniversitede fikri mülkiyet haklarına sahip ve gelecekte bu araç ticari isteyebilir.
Acknowledgments
Bu malzeme, kısmen, Gaziler Bakanlığı işleri (VA), Gaziler Sağlık İdaresi, Office araştırma ve geliştirme (Biyomedikal Laboratuvarı araştırma ve geliştirme) tarafından desteklenen çalışma üzerine kurulmuştur (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS, kısmen, personel hekim-bilim adamı olarak, göz hastalıkları, VA WNY tarafından istihdam edilmektedir; MCB kısmen, VA WNY tarafından istihdam edilmektedir. Çalışma yapılan ve kısmen Gaziler yönetim Western New York sağlık sistemi, (Buffalo, NY) desteklediği. İçeriği Department of Veterans Affairs veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini temsil etmemektedir. Ayrıca desteklenen, büyük bölümünde NIH/NEI R01 tarafından EY013433 vermek (PI: JMS), NIH/NEI R24 vermek EY016662 (UB görme altyapı Merkezi, PI: M katliam, yönetmen - Biophotonics modülü: JMS), sınırsız ödenekle için bölümü, göz hastalıkları/Üniversitesi nde Araştırma Buffalo'dan önlemek körlük (New York, NY) ve Oishei Vakfı (Buffalo, NY) hibe. Hediye hC1 transgenik RHOP347S hat ve exon 1 fare RHO nakavt Dr Janis Lem (Tufts New England Tıp Merkezi, Boston, MA) üzerinden ve NHR-E transgene modeli Heterozigoz devlet hediye üzerinde anıyoruz fare exon 2 RHO nakavt kökenli Drs. G. Jane Farrar ve Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
