Summary
Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.
Abstract
HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.
Introduction
Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) tem sido usada para investigar os aspectos da degeneração da retina exterior em modelos do rato específico de doença12,13,14 . HR-SD-OCT não, no entanto, foi extensivamente usado no contexto da otimização de avaliação dos modelos de rato para determinar a taxa e a uniformidade espacial da degeneração da retina, ou no contexto da avaliação pré-clínica do gene com base terapêutica, por exemplo, a Avalie a extensão espacial do vetor entrega8,15,16, toxicidade ou resgate. Uma vez que um modelo do rato é caracterizado inteiramente, os dados de HR-SD-OCT podem servir como um recurso informativo e confiável para medir o impacto da terapêutica de exercer o resgate ou toxicidade em modelos do rato de degeneração da retina17. Muitos grupos estão usando injeção subretinal como um método de entrega de vetor devido a sua eficiência no transducing fotorreceptores e células do epitélio (RPE) pigmento da retina. No entanto, esta continua a ser um método difícil de dominar, dado que normalmente é feito por cirurgia mão livre da superfície da córnea e muitas vezes é repleta de catarata, sangramento e não intencionais destacamentos retinal ocorrem simplesmente por manipulação de posterior vítreo. Muitos grupos ainda tentam injeções subretinal cegamente e entregam o vírus usando injeções manuais com diâmetro relativamente grande aço inoxidável agulhas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alguns usos óptico tomografia de coerência (OCT) para confirmar a entrega adequada de vetor para a retina8,17, de imagem 20 , 22. algumas melhorias no método recentemente têm sido descritas usando agulhas de microescala, impulsionadas por um micromanipulador22.
Apresentamos uma abordagem integrada que auxilia no posicionamento da agulha, e as injeções são facilitadas por um oftalmoscópio estéreo dirigido personalizado projetado no laboratório especificamente para visualização dentro do olho pequeno do rato17, 23. o uso de vidro puxado micro agulhas em conjunto com o micromanipulador estereotáxica fornecem melhor controle de colocação da agulha com nenhum corte cirúrgico para baixo necessária (ou seja, através da conjuntiva e do tecido conjuntivo) antes de injeção. O uso da pressão regulada injector micro ajuda entregar volumes de injeção consistente, e a injeção pode ser feita com muito maior estabilidade, precisão e muito mais lenta do que injeções manuais realizadas por uma seringa à mão, diminuindo assim o ocorrência de injeção de bolha no olho. A agulha menor ajuda a evitar vazamentos após a retirada da agulha, porque o caminho é auto-selante. Para avaliar a extensão da injeção/entrega, muitos grupos de investigação dependem de encontrar e avaliar a extensão de areal da expressão de proteínas (EGFP) fluorescência verde reforçada na retina (construção de expressão entregada pelo vetor) na extremidade experimental ponto (eutanásia) para confirmar o sucesso injeções11,19,20,24. Esta abordagem (não utilizando OCT) para verificar o sucesso cirúrgico desperdiça uma quantidade enorme de recursos em tempo de procedimento cirúrgico e animais, uma vez que todos os animais com falhas cirúrgicas (desconhecidos) precisam ser mantida, seguido com medidas repetitivas até colheita de eutanásia e olho (quando EGFP é medido). Confirmação do local da injeção na retina pode ser melhorada usando HR-SD-OCT para demonstrar que a injeção está localizada entre as camadas corretas da retina (ou seja, o espaço subretinal). HR-SD-OCT também pode ser usado para delinear imediatamente tentativas (falhas cirúrgicas) para identificar as variáveis relevantes em tempo real cirúrgico para aperfeiçoar a abordagem. Nós achamos que HR-SD-OCT fornece inúmeras vantagens no gene pré-clínicos estudos de terapia, permitindo rápida avaliação quantitativa da degeneração da retina exterior, permitindo a identificação/abate de animais de estudo que não cumpram critérios experimentais ( por exemplo, injeção subretinal incorreta) e para direcionar o follow-up de imagem para a região do olho, onde o vetor foi entregue (onde é mais provável efeito pré-clínicos), bem como controlar as regiões onde o vetor não foi entregue. Desde o seu desenvolvimento, o uso de SD-out tem continuado a ser aceito e utilizado pelos pesquisadores de Oftalmologia e agora é considerada o padrão de imagem da retina em estudos científicos da retina no rato ou roedor modelos13,25. HR-SD-OCT e seus recursos de software foram utilizados em maneiras originais de integrada para promover o objetivo da terapia bem sucedida gene quantitativa em modelos do rato em cada etapa do processo, incluindo a seleção de modelo animal, caracterização de degeneração no escolhido modelos de doença, entrega terapêutica, mapeamento de vetor entrega e avaliação de toxicidade/eficácia. O uso de HR SD-out permite a descoberta de medicamentos mais eficiente em todos os níveis do processo. Aqui descrevemos essas abordagens que são usadas em nosso programa de descoberta de drogas de RNA.
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Protocol
Protocolos de animais foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões de utilização do VA porque HCS e Universidade de Buffalo-SUNY. Os animais foram utilizados de acordo com as estipulações da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e a declaração de Helsinque.
1. Mouse modelos
- Identifica modelos de rato a ser avaliada, incluindo controles.
Nota: Imagem latente foi realizada por um C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, um modelo de degeneração da retina do rato parcialmente humanizado homozigoto para humano mutante RHOP347S hC1 alelos no selvagem-tipo (WT) rato RHO+ + genótipo26 , 27, hC1 x BL/6(J), um modelo humanizado parcialmente com uma única cópia do humano RHOP347S hC1 alelo mutante do mouse WT RHO+ + genótipo (hC1 /-/ / mWT/mWT) (obtidos pelo cruzamento mWT hC1/hC1 / / / mWT com (C57BL/6 Ratos de J)). O acima autossômica dominante retinite pigmentosa (adRP) modelos são no fundo C57BL/6(J). Um modelo de mouse que é homozigoto para duas cópias do gene humano do mouse fundo de nocaute RHO WT RHO foi também usado28,29. Esta linha é no fundo de 129Sv. Quando essa linha foi cruzada com um nocaute de RHO do mouse sobre o fundo de 129Sv, uma dose única de humano RHO ocorre no mouse RHO fundo. - Manter os animais seguindo as condições pertinentes ao projeto experimental.
Nota: Os animais foram mantidos em unidade médica veterinária (VMU) em o VA porque HCS. Os ratos foram alimentados com laboratório padrão chow e crescido abaixo dos 12 h:12 h luz: ciclos escuros com sobrecarga fluorescente suave branco luzes com aproximadamente 300 lux ao nível de gaiola em aproximadamente 72 ˚ f.
2. Mouse Eye Gel
- Prepare o gel ótico usado para a imagem da retina30 e procedimentos cirúrgicos.
- Combinar 2 mg/mL p/v alto peso molecular (4 x 106 g/mol carbomer em estéril 1 x salino de tampão fosfato (PBS).
- Misture à temperatura ambiente até que o gel forma um gel viscoso de opticamente transparente.
- Transferir o gel em pequenos frascos estéreis e centrifugar em uma centrífuga de mesa balançando balde a x 350 g para remover bolhas de ar aprisionado.
- Aplica o gel diretamente a córnea para criar uma interface entre a córnea de rato e um vidro de tampa superior (18 x 18 mm).
3. HR-SD-OCT Imaging
- Consulte o dispositivo HR-SD-OCT (Figura 1).
- Pese o animal para determinar a dose adequada de anestésico. Em seguida, anestesiar o mouse usando 25 µ l/g de peso corporal de 2,5% solução de tampão 2, 2,2-avertina álcool (Avertin) solução através de injeção intraperitoneal (IP) e adicionar que o colírio para dilatar as pupilas, depois que o animal é imobilizado.
- Confirmar que o animal é totalmente anestesiado por uma pitada de dedo do pé e ter a certeza de que o animal não reage.
- Aparar os bigodes e posicione o mouse sobre o trenó HR-SD-OCT.
- Posicione o olho do rato diretamente na frente da lente de capacete e manipular os controles de fase, até que a córnea e a íris estão localizados. Manter a córnea hidratada através da aplicação de lágrimas artificiais.
Nota: Os Micromanipuladores ajuste fino no trenó HR-SD-OCT são usados para colocar o mouse de forma a abertura da pupila é centralizada e orientada. O capacete óptico é então avançado até a retina torna-se visível e o animal é mais ajustado para obter a melhor imagem possível. - Primeiro, abra o programa de software "Mouse" e clique em "paciente/exame". Em segundo lugar, clique em "Adicionar o paciente" e insira as informações pertinentes para identificar o animal na janela nova do paciente e "salvar e sair". Em terceiro lugar, clique em "Adicionar exame" seguido por "Iniciar exame". Em quarto lugar, clique em "adicionar verificação personalizada" e selecione "volume retangular", escolher OD ou so para o olho sendo fotografado, clique "Adicionar exame". Finalmente, começa a apontar o instrumento e o posicionamento do animal para obter a região de interesse. Depois de encontrar a região correta, retire qualquer excesso de líquido da superfície do olho usando um algodão estéril, com ponta aplicadora apenas antes da aquisição de imagens a fim de melhorar ainda mais a qualidade de imagem e, em seguida, clique em "start instantâneo", e se é obtida uma boa imagem, clique em "salvar verificação".
Nota: Parâmetros típicos para imagens de HR-SD-OCT retangulares são 900 a-exames/b-scan e b-exames/imagem 90. Imagens adquiridas são 1,4 x 1,4 mm. A região da retina fotografada depende da experiência específica, mas a maioria das imagens estão centradas sobre a cabeça do nervo ótico (HNO).
4. avaliar a presença, taxa e uniformidade do modelo exterior da retina Espinocerebelares
- Avaliação de modelo de degeneração da retina exterior pela HR-SD-outubro
- Obter animais com um amplo espectro de idades para o controle e disciplinas experimentais para avaliar a presença, taxa e uniformidade de degeneração da retina exterior.
- Execute imagem HR-SD-OCT em vários animais em cada idade de ambas as coortes (doença e normal). Use o método descrito em 3.1.6 para obter as imagens de OCT.
Nota: Os dados podem ser coletados de uma grande coorte de animais ao mesmo tempo, que tem distribuído aniversários, abrangendo um largo período de tempo (1 ano), ou uma pequena coorte de animal pode ser usada para coletar várias imagens durante um longo período de tempo (1 ano) para obter resultados semelhantes. - Abra uma imagem de volume retangular de HR-SD-OCT gravada e identificar o primeiro b-scan para ser medido (idealmente incluirá o HNO ou outro marco identificável) do conjunto de imagens. Amplie a imagem para preencher a tela usando o recurso de zoom no software.
- Clique com o botão direito na imagem do b-scan e em seguida, clicando em "Pinças" e finalmente clique em compassos de calibre como muitos como desejado para abrir o número desejado de pinças (eles são numerados de 1 a 10). Certifique-se de que as pinças aparecem no canto inferior direito da imagem. Usando o recurso de "Configurar Caliper", atribuí-los todos como "vertical" na coluna do bloco de ângulo e ativar o "Display Caliper local" para facilitar a colocação de uniforme através da retina e finalmente, clique em aplicar.
Nota: 1st maxila deve ser colocada no lado esquerdo da imagem quando o olho direito oculus dexter (OD) de processamento e o 1st maxila deve ser colocado no lado direito da imagem, ao processar as imagens de olho esquerdo oculus sinistras (OS). Isso resulta em uma nasal a orientação temporal de todos os dados para ambos os olhos esquerdos e direito ao plotar. - Usando o mouse do computador, movem cada pinça para o local desejado (afastados de 2,0 mm) o b-scan, certificando-se colocar uma pinça no centro da cabeça do nervo óptico, em b-scan de imagens que incluí-lo (conjunto esta pinça para zero). Em seguida, use o mouse para clicar e arrastar o compasso de calibre de comprimento para abranger a região de interesse. Arbitrariamente definido pinças que não sobreposição de regiões mensuráveis do b-scan de comprimento máximo e ignorar durante a análise de dados.
- Medir a espessura ONL usando as ferramentas do compasso de calibre, colocando a parte superior da maxila na membrana limitante externa (ELM) e a inferior da maxila na parte inferior da camada plexiforme externa (OPL). Repita isto para cada pinça através da retina em incrementos de 0,2 mm. Salve as medições.
- Depois de todos os compassos foram colocados e ajustados ao tamanho, clique com o botão direito na imagem e clique em "Salvar dados do compasso de calibre".
- Repita as medições na b-verificações subsequentes (cada 10th digitalizar obras bem) do mesmo volume retangular imagem OCT da retina inteira de inferior para superiores regiões de abrangência. Compassos de calibre devem permanecer aberta e no mesmo local no eixo x. Ajuste o comprimento dos compassos de calibre sem movê-los na direção X.
- Abra o salvar arquivos de dados, clicando no ícone de arquivo pequeno ao lado o b-scan transformado a imagem e clique em "Ir para dados". Clique em "data modificada para organizar os arquivos em ordem com base na hora de salvar e abrir todos os arquivos para cada medida b-scan.
- Compile os dados brutos de cada b-scan em um único arquivo em ordem do mais baixo ao mais alto com base no número do quadro. Selecione as colunas de dados, incluindo o "Nome do compasso de calibre", "Comprimento" e "Centro X".
- Certifique-se de que o centro de X é o mesmo para todos os b-scans medidos para cada imagem de OCT de volume retangular processada. Excluir todos os dados de pinças que não foram usadas para registrar as medições e defina a maxila localizada no centro da cabeça do nervo óptico para zero.
- Plotar os dados para X vs vários conjuntos de dados de Y para obter uma função plot 3D para plotar a espessura total de Oni ou outra medida camada da retina.
- Compare as medições ONL entre controle e animais experimentais com idades correspondentes para determinar a taxa e a uniformidade de qualquer potencial degeneração da retina.
- Repita o processo para medições OSL, usando as mesmas imagens de b-scan. Siga a mesma metodologia usada para medir o ONL, exceto colocação os compassos de calibre entre a membrana de Bruch e ELM (BM).
Nota: Um exemplo de como colocar a pinça é mostrado na seção de resultados de representante (Figura 3B). Isso deve ser feito em uma imagem ampliada para diminuir o erro. - Repeti a análise de dados para vários animais para cada aniversário para ambos experimental e coortes de controle.
- Medição abrangente e mapeamento 3D da espessura ONL ou OSL usando a ferramenta de compassos de calibre do software
- Rever as imagens de OCT de injeção de post e anote qualquer Marcos identificáveis, como o HNO ou vasos sanguíneos na retina. Depois, posicione o mouse para obter um SD-OCT follow-up de uma mesma região e não se esqueça de incluir os mesmos Marcos identificáveis.
Nota: Certifique-se de que a região da retina fotografado e envolvido no descolamento de retina é identificada no post images injeção SD-OCT. Gravar uma imagem de volume retangular SD-OCT e salvá-lo. - Processar as imagens gravadas, como descrito acima em etapas 4.1.3. para 4.1.14. Salve os dados de maxila e trama conforme descrito acima.
Nota: A matriz resultante das medições ONL é usada para criar uma trama 3D retratando a espessura ONL. A posição dos compassos de calibre no eixo permitem replot o gráfico colocando o nervo óptico na origem (0) ao longo do eixo x. O eixo y é plotado usando o número de b-scan e o nervo óptico é usado para definir o ponto de partida, o que permite posicionar corretamente o nervo óptico na origem no eixo y. Identificar o nervo óptico em cada conjunto de dados permite acompanhamento imagens a serem alinhados de forma confiável.
- Rever as imagens de OCT de injeção de post e anote qualquer Marcos identificáveis, como o HNO ou vasos sanguíneos na retina. Depois, posicione o mouse para obter um SD-OCT follow-up de uma mesma região e não se esqueça de incluir os mesmos Marcos identificáveis.
- Mapeando a extensão do local da injeção para a imagem de fundo
- Execute o post injeção volume retangular OCT para confirmar o sucesso da injeção. Siga o método descrito no 3.6.
- Use o recurso de pinça no software para identificar o ponto de inflexão na fronteira do descolamento de retina de um número de b-exames abrangendo toda a imagem da OCT. Use o método para abrir os compassos de calibre descritos no 4.1.4.
- Grave as imagens de fundo com o local mapeado do OCT b-scan e correspondente posição de pinça na imagem do fundo, o que corresponde a sua localização.
- Compile todas as imagens de fundo em uma imagem composta, incluindo as posições do compasso de calibre, que resulta em um mapa preciso do local da injeção para a imagem de fundo (o exemplo na seção de resultados de representante, a Figura 5A).
5. intraocular injeções
Nota: Detalhes sobre utilização do RIS são mais elaborados em um recente estudo23.
- Preparando as agulhas de injeção de vidro
- Autoclave capilar tubos com filamentos em pequenos lotes, usando o ciclo seco.
- Use uma pipeta puller e set-up um programa que irá produzir uma ponta de vidro com o ângulo mais afiado e um diâmetro na faixa de 2 a 5 µm.
Nota: Um programa de amostra 5 passos que produziu agulhas eficazes em nosso extrator de pipeta é mostrado na tabela 1. - Armazene as agulhas de vidro puxado em uma jarra de agulha de pipeta estéril à temperatura ambiente.
- Encha a agulha de injeção com a solução desejada para injeção
- Monte a agulha para o suporte da agulha, deixando aproximadamente 5/8" projetando-se além do final do titular.
Nota: A distância inferior a 5/8" irá torná-lo difícil alcançar a solução de injeção para preencher a agulha, porque o suporte da agulha não se encaixam facilmente a abertura de tubos de 0,2 mL. Além disso, ter a agulha projetam-se mais do que 5/8" resultados em significativamente maior oscilação ou precessão da ponta, dificultando de imagem em tempo real desde a ponta deixa o plano focal ou o campo de visão (FOV), ao tentar furar o olho. - Prepare a solução de injeção em um tubo estéril de 0,2 mL. Adicionar um 01:10 diluição do sulfato de fluoresceína estéril (10 mg/mL de 1X PBS) para a solução de injeção para obter uma concentração final de fluoresceína em 1 mg/mL.
Nota: O corante exato usado é específico para o usuário e pode ser qualquer coisa que é non-toxic e visível a olho nu, sob iluminação de luz branca para ajudar a facilitar a colocação precisa da ponta da agulha no nível da RPE e espaço subretinal. - Visualize a agulha através do microscópio estéreo enquanto estiver usando os botões de controle do micromanipulador de 3 eixos para posicionar a agulha para que ele esteja alinhado com o centro do tubo contendo a solução de injeção para ser usado para preencher a agulha.
- Cuidadosamente, dirija a ponta da agulha no tubo de 0,2 mL até que a ponta da agulha está submersa no fluido. Elaborar o volume desejado de injeção líquido (por exemplo, 1 µ l) para a necessário para uma única injeção de agulha. Manter o restante da solução no tubo colocado no gelo.
- Monte a agulha para o suporte da agulha, deixando aproximadamente 5/8" projetando-se além do final do titular.
- Preparando o animal para a injeção
Nota: o microscópio RIS é mantido limpo e é um sistema de não-contato. A placa de aquecimento é coberta com uma almofada de limpeza adsorvente e agulhas são esterilizados em autoclave antes de ser puxado. Depois que eles são puxados por uma tira de metal aquecida auto esterilizante, são mantidos em uma câmara fechada esterilizada projetada para armazenar agulhas de vidro puxado. As agulhas são manipuladas apenas usando as mãos enluvadas e cuidados é usado para evitar tocar a ponta da agulha ao montá-lo no suporte. As soluções injetáveis são preparadas utilizando uma técnica estéril e são testadas para a contaminação por estrias uma amostra de preparações de vírus em placas de ágar LB e incubando-os durante a noite em 37 ˚ c.- Pese o animal (g) para determinar a dose adequada de analgésico anestésico.
- Administre o anestésico (solução de 2,5% de álcool no buffer 2, 2,2-avertina (Avertin)) através de injeção intraperitoneal (IP).
- Imediatamente aplica medicamentos anticolinérgicos (por exemplo, cyclopentylate) para ambos os olhos para dilatar as pupilas.
- Aparar os bigodes do animal e número do animal usando soco de orelha ou outro método.
- Lave o olho e a área circundante com betadine diluído.
Nota: Evite qualquer solução em torno do nariz, pois isso pode resultar em afogamento acidental. - Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento, mantida em 39 ˚ c, no suporte de rato argila do modelador pre-moldado com o olho deve ser injetado em direção a agulha.
- Certifique-se que o mouse está respondendo usando um teste do beliscão no pé traseiro.
- Realizando a injeção subretinal
- Use um par de pinças estéreis íris contundente para induzir suavemente proptose do globo, colocando as pontas da pinça no 7 e 10:00 posições sobre as pálpebras enquanto empurra aberto e para baixo ao mesmo tempo.
- Use a pinça para persuadir as pálpebras sob o globo do olho para mantê-lo da tomada durante o processo de injeção.
Nota: Animais de 10 a 14 dias de idade, frequentemente, realizará o olho da tomada mais facilmente do que animais mais velhos. - Direcionar a ponta da agulha cerca de 1-1.5 mm abaixo da borda do limbo corneal e conduzi-lo cuidadosamente para dentro do olho através da conjuntiva até que cria uma depressão escleral como a agulha penetra no tecido da esclera e permite a manipulação do olho.
- Gire o olho para baixo com o micromanipulador Visualizar a depressão escleral através da pupila dilatada com o microscópio estereofónico do RIS.
- Aplique uma gota de gel do olho estéril ou 1 x solução de PBS e cobrir com uma lamela estéril.
- Focar a depressão escleral criada pela ponta da agulha (2-5 µm) e dirigir a agulha para a frente até um pico afiado das formas retina no local da injeção.
- Gire a agulha usando o titular até a ponta entedia através da esclera e da fluoresceína na agulha é visível sob a retina na vizinhança imediata de monocamadas de células o RPE.
- Dirija a ponta da agulha é tangencial ao Globo e em seguida, ativar a bomba de injeção com o interruptor de pedal do pé.
- Após entrega o volume desejado (0,5-1 µ l) para o espaço subretinal, retirar a agulha e verifique se a bolha é estável e esse fluido não vaza fora do local da injeção, que é o primeiro critério de uma injeção de sucesso.
Nota: Mantendo um diâmetro de ponta adequada (2-5 µm de diâmetro) é fundamental para evitar a fuga do local da injeção. - Coloca o animal sobre a plataforma de imagem do instrumento OCT. Siga as instruções para HR-SD OCT Imaging para gravar uma imagem de volume retangular.
- Confirme se o fluido injetado é localizado no espaço subretinal e salvar as imagens para determinar a extensão da bolha.
- Retire o animal do porta e aplicar uma ampla quantidade de pomada antibiótica para os olhos injetados.
- Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até se recupera completamente, então colocá-lo de volta para a gaiola original de onde veio.
Nota: Nossos animais são geralmente injetados antes do desmame, portanto os animais precisam ser devolvidos a gaiola com a mãe.
- Mapeamento da extensão da bolha subretinal usando ferramentas de software de instrumento OCT.
- Obter uma imagem de OCT de volume retangular, usando métodos descritos anteriormente, da bolha e posicioná-lo para incluir um marco reconhecível dentro do olho, tais como o HNO.
Nota: 90 b-exames de gravação funciona bem para mapear a bolha, mas poderia ser usada dependendo da resolução desejada. - Adicionar um compasso único para a figura e coloque-o no ponto de inflexão onde a retina separa o RPE e coroide.
Nota: O software automaticamente mapeia um ponto correspondente a uma linha para a imagem de fundo que representam o compasso e o b-scan sendo avaliada. - Capturar a tela após a colocação dos compassos de calibre e compilar as imagens para mapear efetivamente a fronteira da bolha de injeção para a imagem de fundo, que precisamente mapeia o local da injeção. Salve a imagem compilada para referência ajudar na localização das regiões de interesse durante a imagem latente de acompanhamento.
Nota: Como alternativa, os dados da maxila podem ser salvos, respeitado e plotagem usando um método semelhante para conjuntos de dados 3D plotagem de espessura ONL.
- Obter uma imagem de OCT de volume retangular, usando métodos descritos anteriormente, da bolha e posicioná-lo para incluir um marco reconhecível dentro do olho, tais como o HNO.
- Injeção intravitreal
- Coloque a ponta da agulha usando uma abordagem cirúrgica semelhante como injeção da retina sub, exceto que a agulha é dirigida inteiramente através da esclera na pars plana cerca de 0,25 mm para trás ao limbo da córnea e para o vítreo.
- Após a colocação da agulha, aplica o pulso de injeção com o pedal.
Nota: Observa-se uma rápida difusão do corante fluoresceína em todo o vítreo da viseira, encher a abertura pupila dilatada com fluorescência.
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Representative Results
Avaliar a presença, a taxa e a uniformidade da degeneração da retina exterior do modelo
Medições de Oni foram gravadas desde o OPL para o ELM, definindo os limites da Oni usando a ferramenta paquímetro fornecida no software do instrumento. O objetivo era mapear a progressão da degeneração da retina exterior em um modelo do rato de adRP parcialmente humanizado. Imagens comparáveis de um rato C57BL/6(J) de controle e um mWT hC1/hC1 / / / modelo de mouse mWT, expressando duas cópias dos genes mutantes humanos haste opsina (RHOP347S), foram mostrados para expor os resultados de controle da retina e aqueles de um grave e rapidamente progressiva condição degenerativa da retina. AdRP a 3 semanas (hC1 x BL/6(J)) animal, tendo apenas uma única cópia do gene mutante humano RHOP347S e duas cópias dos genes do rato WT RHO , tinha perto de espessura normal ONL. No entanto, o acompanhamento HR-SD-OCT varreduras em 10 e 37 semanas demonstraram progressiva temporalmente e espacialmente uniformes degeneração da retina que resultou na perda de aproximadamente 60% dos FOTORRECEPTORES reconhecido como ONL desbaste durante este período de tempo. O hC1 x BL/6(J) adRP modelo, a degeneração da retina tem uma constante de tempo aproximado (1/e) de 13 semanas. Animais homozigotos hC1, com duas doses do transgene humano mutante tóxico no mouse WT RHO fundo, sofrem uma degeneração mais rápida, como demonstrado pela extensa afinamento retinal e essencialmente completa perda de todos os fotorreceptores por 3 semanas de idade (Figura 2).
A medida Oni é apenas um componente de normalidade da retina exterior como um índice de vitalidade fotoreceptor. A OSL dos FOTORRECEPTORES e o segmento a segmento interior/exterior (IS / OS) linha ou linha elipsoide fornecer evidências para apoiar tanto vitalidade fotoreceptor e função. Comparações em animais que foram criados para conter um (N129R - x 129R-) ou duas cópias (2HRho 1T1T) (doses) dos genes humanos WT RHO no fundo do mouse WT RHO nocaute foram medidas para a espessura da retina exterior. Observou-se um aumento estatisticamente significativo de ~ 8 µm em Oni em camundongos com duas cópias do gene WT RHO humano em comparação com ratos com apenas uma cópia do gene humano. Observou-se um aumento estatisticamente significativo de ~ 5 µm na OSL em camundongos com dois vs. uma cópia do gene humano sobre o fundo de nocaute de RHO rato WT WT RHO . Um exemplo de como o ONL e OSL medições foram feitas é mostrado na Figura 3. A alta resolução das imagens capturadas com o sistema HR-SD-OCT permitem medições precisas do ONL ou OSL, permitindo a discriminação de pequenas diferenças com fiabilidade estatística sólida nos modelos do rato WT RHO humanizados.
Gama de cirúrgica resultados detalhados por OCT quando tentativa apresentam injeção
HR-SD-OCT avaliação de injeções subretinal tentativas resultou em uma variedade de resultados. Em primeiro lugar, a experiência mais comum foi confirmação de que o fluido injetado foi entregue com êxito dentro do espaço sub retiniana. A abertura do espaço subretinal implícito (o que fecha durante o desenvolvimento) criou uma bolha que pode ser claramente visualizada na exibição de rosto pt da HR-SD-OCT e em b-scan de imagens. O fluido hipo-reflexivo fazia fronteira com a retina neural acima e a camada de células RPE hiper-reflexivo ainda contra a BM, abaixo (Figura 4). A extensão da injeção subretinal poderia ser determinada se o animal foi fotografado por HR-SD-OCT imediatamente após a injeção (veja abaixo). Em segundo lugar, a injeção pode ocorrer no espaço da coroide (abaixo de BM), em vez de no espaço subretinal. Isto resultou em uma camada de hiper-reflexivo (RPE) delimitadora da cúpula da região fluido deslocadas da retina, e não hiper-refletividade no limite posterior do olho na OCT b-tomografias. Terceiro, outro resultado potencial que poderia ocorrer durante a tentativa de injeção subretinal foi um schisis da retina (divisão) na camada de fibras nervosas. Esse resultado rendeu uma anatomia normal retina exterior, mas a camada interna da retina encapsulado a bolha, que pode ou não pode ter invadido o vítreo. Em princípio, tal padrão schisis pode ocorrer com injeção em qualquer lugar dentro as laminações da retina neural adequada, mas só vimos schisis de camada de fibras nervosas até à data. Em quarto lugar, uma injeção intravitreal também pode ocorrer, que não tem impacto na OCT. Todas estas falhas resultam o extravio inicial da ponta da agulha vidro, ou talvez um pequeno movimento da agulha durante a injeção, devido a cabeça de pressão do dispositivo de injeção de fluxo comutada.
Caracterizando o local de injeção apresentam
Um fator crítico na determinação da eficácia ou toxicidade das terapias do candidato é a capacidade de comparar regiões da retina que receberam vector contra aqueles que não tenham. Nós dirigido esforços significativos no desenvolvimento de um meio para marcar a região da retina envolvidos em subretinal injeções para que durante os exames de acompanhamento, poderíamos identificar a extensão de areal da retina onde terapias foram aplicadas, e, portanto, onde transdução era viável. NPs de ouro permitiu um alto nível de confiança na identificação de regiões da retina que foram ou não foram injetadas. No entanto, as partículas específicas ou sua formulação aparenta ser tóxico e resultou em uma grave localizada degeneração da retina no local da injeção subretinal por injeção de pós de 24 horas (dados não mostrados). Portanto, nós desenvolvemos um método alternativo de mapeamento local da injeção, diretamente a partir dos dados de imagem de HR-SD-OCT. Um método para identificar precisamente as fronteiras do local de injeção foi desenvolvido utilizando as ferramentas de medição (pinças) no pacote de software do instrumento (Figura 5). Identificássemos a borda da bolha precisamente examinando os individuais b-scans (de inferior para superior retina) usados para criar a imagem de fundo. Ao colocar um paquímetro no ponto onde a bolha intercepta a retina anexada, a posição da maxila é automaticamente mapeada para o b-scan correspondente da imagem do fundo rosto pt na posição exacta ao longo do eixo x, onde a maxila foi colocado sobre o b-scan. Repetindo este processo permite traçar a borda da bolha para uma imagem de fundo do cara do pt . O processo de alinhamento exige que semelhantes regiões da retina são fotografaram cada vez, em relação ao nervo óptico constante cabeça e as imagens podem precisar de ser rodado para alinhar os vasos sanguíneos da retina as imagens múltiplas antes da segregação de dados. Após o processo de alinhamento da imagem de injeção de post e imagens de acompanhamento subsequentes, a região de injeção foi sobreposta sobre a grade de ponto de dados para identificar a posição das medições dentro da região envolvida no descolamento de retina. Esses dados poderiam ser plotados como um mapa de superfície, que forneceu uma ferramenta visual para identificar pontos de dados, inclusive o local da injeção em relação a regiões fora do local da injeção.
Mapeando a espessura ONL em 3D
Finalmente, podemos gravar medições da Oni, OSL ou outras camadas da retina de em toda a região imagem da retina e então plotar os dados usando um plano de superfície (Figura 5). Sobrepor o mapa da fronteira do local da injeção permite a segregação de dois conjuntos de dados, incluindo a região injetada e a região que não foi desligada durante o processo de injeção. Mais processamento e análise de dados pode então proceder por estes dois conjuntos de dados para testar hipóteses que agentes terapêuticos específicos podem resgatar a degeneração da retina ou induzir toxicidade. Esta abordagem potencialmente permite experimental e controlar os dados a serem coletados a partir de um único olho, comparando regiões vs injetado não injectada do olho mesmo.
Figura 1 : Dispositivo UHR-SD-OCT. O dispositivo de HR-SD-OCT usado é mostrado. O rack de instrumento (A) contém o monitor de computador (um), o teclado e rato (b), caixa de interface de sonda (c), o motor de OCT (d), o computador (e), o dispositivo de controle para o super luminescentes diodos emissores (infravermelhos) (f) e no-break fonte (g). O banco ótico (B) contém a imagem cabeça ótica de sonda (para a retina do rato) (h), o manipulador multi-eixo (linear e rotacional) (eu) e um assunto de rato (j). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Degeneração progressiva da retina de exterior no modelo adRP parcialmente humanizado medida pelo HR-SD-outubro de (A) imagens de HR-SD-OCT da retina foram obtidas para o modelo adRP (hC1 (J) x BL/6) em diferentes idades, o controle C57BL/6(J) de 14 semanas e a linha mutante hC1 homozigotos em 3 semanas. A retina exterior tinha uma aparência normal em 3 semanas no modelo adRP, mas não havia evidência de progressiva ONL afinamento e desorganização no e para além de 10 semanas de idade. Por 37 semanas, a (hC1 x BL/6(J)) demonstrada extensa exterior degeneração da retina. Todos os scans OCT estavam na proximidade do nervo óptico. (B) a espessura de Oni (em mm) ao longo da horizontal eixo através do nervo óptico foi plotado para controle (C57BL/6(J)), hC1 e adRP animais de diferentes idades. Houve perda progressiva da espessura ONL no modelo adRP parcialmente humanizado. ONL perda foi superior a 60% por 37 semanas de idade. Barras de erro = erro padrão da média. Barra de escala vermelha = 200 µm e todas as imagens são a mesma escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Medidas quantitativas do comprimento do segmento de camada Nuclear exterior e exterior usando HR-SD-outubro de (A) Mouse linhas usadas para demonstrar as medidas ONL e OSL. Representante de OCT imagens do 2HRho1T/1T (2 doses HRho) sobre fundo de nocaute do rato RHO ) (painelesquerdo ) e N129R - x 129R-(uma dose humana RHO sobre fundo de nocaute do rato RHO ) (paineldireito ). (B) um exemplo de como os compassos de calibre foram colocados para medir o ONL (vermelho) e OSL (azul) é mostrado. (C) os dados obtidos de três animais de cada linha para espessura ONL foi plotada em formato de gráfico de barras mostrando a comparação da linha de 2HRho1T/1T e N129R - x 129R-(painel esquerdo). A linha de 2HRho1T/1T tem ~ 8 µm ONL mais espessa. Para demonstrar as diferenças no OSL, várias medições (sete) foram feitas de um b-scan de cada rato linha de partir o Olmo para o BM como em B (linha azul) em animais de 9 semanas (paineldireito ). Isto demonstrou uma diferença de ~ 5 µm na OSL entre animais com 1 vs 2 cópias do gene HRho. ONL tanto as medidas OSL eram estatisticamente significativas, ONL p-valor = 1.7e-5 e OSL p-valor = 6.4e-5. Barras de erro = erro padrão da média. Barra vermelha escala = 100 µm tanto os b-exames na 3A têm a mesma escala, 3B é ampliado para melhorar a clareza das camadas da retina e para fornecer uma demonstração qualitativa da forma como as medições foram adquiridas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Tipos de injeções intra-oculares em camundongos identificados por HR-SD-outubro de (A). A (hC1xBL/6(J)) rato foi injetado com ~ 1 µ l de líquido através da injeção de transchoroidal de transcleral Inferonasal. O descolamento de retina resultante é visto como verde inferior direita da imagem a cara do pt , criando uma borda afiada na vanguarda da bolha no lado direito da imagem. A imagem de fundo de OCT de uma injecção exibe apenas sutis diferenças, dependendo da posição da cavidade preenchida fluida, porque a imagem é uma compilação de todos os b-exames de toda espessura da retina. Além disso, a bolha de injeção altera a distância da superfície da retina de boné a OCT, produzindo uma região fora de foco no local da injeção. (B) o OCT b-scan de um não injectada retina é demonstrado. O HNO é rotulado. (C) A injeção subretinal é demonstrada. O HNO é rotulado e setas na imagem do rosto de pt (painéis de direita) mostram a borda posterior do desapego. (D), A injeção da coroide é demonstrada com uma clara elevação (deslocamento para cima) da camada de RPE (hiper-reflexiva curva) da borda inferior da retina (setas) e perda significativa de hiper-refletividade do RPE e coroide camadas abaixo do líquido injetado. Compare as setas nas imagens (C . vs. D). (E) A schisis da retina é demonstrado perto da camada de fibras nervosas. Observe a muito fina membrana hiper-reflexiva, encapsulando o fluido injetado, enquanto o retina permanece anexado para o RPE. Diferenças sutis entre os três destacamentos diferentes também podem ser visualizadas nas imagens de rosto de pt (C, D e E). O destacamento subretinal tem uma borda que é difícil Visualizar (setas em C), enquanto a injeção da coroide cria uma borda reflexiva hiper turva na vanguarda da bolha, e a retina schisis manifesta-se pela demarcação nítida da sua Leading edge (E). Ambos de vermelho escala barras = 200 µm em 4B. Todas as imagens 4B através de 4E são dimensionados igualmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Mapeamento e quantificar alterações da retina exterior após injeção apresentam. Foi desenvolvido um método para identificar regiões de interesse durante exames de ratos que tinha injeção subretinal do vetor, com 3D-plotagem de medições ONL de múltiplos OCT b-scans. Um animal de 2HRho1T/1T foi injetado com um vírus adeno-associado autocomplementares expressando GFP tanto a chumbo candidato ribozima (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (olho OS) em uma tela de toxicidade. (A) Imaged imediatamente a seguir, a extensão de areal da injeção foi mapeada pela colocação de pinças na vanguarda da bolha no ponto onde os segmentos exteriores separam o RPE nos b-scans (painel da esquerda (pinça vermelha)). A posição da ferramenta paquímetro é automaticamente mapeada para a imagem de fundo do olho, e isto é repetido e compilado para como muitos b-exames, se necessário, que dependem da resolução desejada (cada 5th varredura no (A) (painel direito)). Estudos posteriores de OCT (a cada 2 semanas) fotografaram a mesma região da retina para permitir a sobreposição; o HNO e vasos da retina são marcos para facilitar os ajustamentos cartesianos ou rotacionais. Toda a região da retina foi medida para espessura ONL desde os limites necessários (OPL e ELM) eram visíveis. (B) para mapear o comprimento ONL sobre a superfície injetada as posições de maxila (cores) são novamente mapeadas para a imagem de fundo e compiladas em uma imagem composta. Cada 5th b-digitalização de imagens OCT foi medido com pinças de built-in em até dez pontos em toda a retina. Imagens de pré e pós-compiladas (C) são giradas, usando o software de imagem para alinhar a vascularização da retina, o que permite que os pontos de dados dentro da retina isolada região da retina para ser identificado pela superposição de imagem e separados. Conjunto de (D) os dados é mapeado em um formato de tabela, idêntico à matriz da imagem de fundo e dividido em dois grupos (medições dentro da bolha (destaque vermelho) e aqueles que não são). (E) dados apresentados usando um recurso de plotagem superfície 3D, que permite a visualização de espessura ONL em toda a região de imagem. Isto permite a avaliação das diferenças quantitativas entre regiões injetadas e não injectada do olho. A fenda na trama 3D (E) fornece uma maneira conveniente de segregar o conjunto de dados de medições de ONL dentro da região o descolamento de retina da região que permaneceu associada imediatamente após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: programa usado para puxar as agulhas de vidro. Parâmetros do programa conseguir agulhas de vidro útil para apresentam ao trans-escleral, abordagem de transchoroidal.
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Discussion
HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene "knockdown" ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, rápido e não-invasivo para avaliar a saúde da retina que pode ser usada para caracterizar e monitorar a progressão da degeneração da retina em quase qualquer modelo do rato. As imagens de OCT podem ser usadas para obter medições de qualquer ou todas as diferentes camadas da retina, que pode fornecer uma avaliação detalhada de uma degeneração da retina exterior (fotorreceptor) ao longo do tempo ou o impacto das tentativas de resgate terapêutico sobre a degeneração medida ou cinética timeline. HR-SD-OCT também pode ser usado para avaliar a toxicidade do vetor entregue ou materiais. O impacto mais significativo sobre um programa de pesquisa do fotoreceptor degeneração da retina é a capacidade de fazer medições refinadas de ONL ao longo do tempo em animais vivos. Um pode traçar uma linha do tempo da degeneração da retina para extrair uma constante de tempo, que é um primeiro passo fundamental para avaliar a eficácia e a toxicidade da terapêutica de candidato nos mesmos modelos em uma janela temporal de oportunidade terapêutica. Esta tecnologia também permite uma economia significativa de recursos preciosos (animais e tempo) em relação à histologia clássica de ponto de extremidade, permitindo que o pesquisador para identificar anormalidades na coorte animal antes de entrar em um estudo e eliminação de animais que Não critérios experimentais (por exemplo, entrega bem sucedida subretinal).
A necessidade de entrega precisa de certas terapêuticas no espaço subretinal do olho do rato é um desafio, e HR-SD-OCT fornece uma confirmação visual precisa de injeções subretinal sucesso como critério de inclusão em curso dos animais na projeto de estudo pré-clínico. Amplo esforço é necessário para seguir frequentemente animais injetados em estudos de terapia do gene ao longo do tempo, desde que esses modelos frequentemente simulam humanas doenças degenerativas da retina onde doença cronogramas emergem ao longo de décadas. Inúmeros exames de seguimento são necessários para determinar a eficácia terapêutica ou para avaliar a toxicidade. Uma solução para este desafio crítico é ter a capacidade de identificar e remover os animais a partir de desenhos de estudo, que são falhas cirúrgicas para a entrega do vetor terapêutico. 90% da capacidade de entregar uma injeção bem sucedida para um técnico bem treinado com anos de experiência se aproximou e se injetando um olho por animal e cerca de 80% de sucesso se injetando ambos os olhos. Com este nível de eficiência, remoção do projeto estudo dos animais com injeções mal sucedidas é vantajosa para testes de hipóteses. Isto não só economiza tempo crítico, mas também permite resultados mais consistentes e previsíveis. Além disso, HR-SD-OCT permite diminuir o número de animais necessários para qualquer experiência, permitindo que os mesmos animais para ser seguido ao longo do tempo, o que diminui a variabilidade de animal para animal em ambos experimental e grupos de controle e permite que mais avaliação estatística robusta de hipóteses sobre a eficácia e a toxicidade da terapêutica de candidatos potenciais.
A extensão da cobertura da retina por uma injeção subretinal normalmente não é 100%, que em si pode ser tóxico31,32,33,34. Portanto, a capacidade de distinguir entre regiões transduzidas e não transfectadas é fundamental para adequado teste de hipóteses de resgate e toxicidade para um determinado candidato terapêutico. O uso criativo de ferramentas de software disponíveis permite mapeamento preciso do subretinal injeções no olho do rato. A imagem imediata do olho injetado fornece direção para acompanhamento de imagem de regiões de interesse e a capacidade de comparar as regiões que têm sido transfectadas para regiões que não foram tratadas dentro do mesmo mundo. Dependendo da precisão do mapeamento desejado, este processo pode ser executado para cada b-scan ou periodicamente de amostragem do conjunto de b-exames coletados imediatamente pós injeção e compilando todas as imagens de fundo em uma única imagem usando softwares gráficos tão que a em trechos borda contínua é cuidadosamente mapeada para a imagem de fundo. Comparando as imagens de imediatamente após injeção de follow-up imagens requer que as imagens ser alinhados para que as posições de medição podem ser mapeadas para a imagem de fundo, e os pontos de dados podem ser agrupados em injecção e regiões não injectada do retina. O mapeamento da cabeça do nervo óptico e os vasos sanguíneos da retina também pode ser realizado usando esta mesma metodologia, que auxilia na orientação do olho ao tentar alinhar as imagens pós-injeção com imagens de acompanhamento subsequentes. Esta informação pode ser usada em imagens subsequentes para identificar a região da retina onde ocorreu a injeção. Claro, quando os animais são sacrificados, o local de expressão EGFP, entregado por um vetor de vírus adeno-associados também contendo um gene terapêutico do candidato (por exemplo, ribozima), pode também ser usado para comparar a localização de transdução com superfície determinada por mapeamento de imagem que depende da localização dos vasos sanguíneos. Isto permitirá a identificação de difusão do vetor no espaço subretinal posteriormente fechado além de áreas de descolamento anatômico.
Nosso sucesso com o uso de ouro NPs para rotular a bleb subretinal foi limitada devido à toxicidade induzida pelos materiais usados. Incentivamos outras investigações de tais materiais para rotular a extensão do subretinal blebs, se preparações alternativas (diferentes dimensões, modificações de superfície) podem ser encontradas que não induzir toxicidade.
HR-SD-OCT fornece uma quantidade enorme de informações com significativamente menos tempo e recursos e pode ser quantificado para fornecer mais informações sobre a eficácia e a toxicidade da terapêutica potencial em comparação com as metodologias tradicionais como histologia. O uso desta tecnologia permite que o pesquisador aliviar um dos graves gargalos na droga da retina pré-clínicos descoberta35. O rato RIS e HR-SD-OCT são ferramentas poderosas para auxiliar estudos de terapia do gene da retina pré-clínicos como um componente de nosso programa de descoberta de drogas de RNA. Estas ferramentas podem ser aplicadas amplamente.
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Disclosures
Relações comerciais: MCB: nenhum; JMS: nenhum. A imagem do sistema (RIS)23 utilizado neste estudo da retina é um dispositivo inovador de uso substancial a qualquer grupo buscando a realização de estudos de entrega de terapia de gene em ratos, roedores ou pequenos animais. Embora os autores não tenham nenhum conflito para declarar com relação a este dispositivo, neste momento, da Universidade de Buffalo - SUNY e a administração de veteranos têm direitos de propriedade intelectual e pode tentar comercializar este instrumento no futuro.
Acknowledgments
Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R01 conceder EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (centro de infraestrutura de visão de UB, PI: M abate, diretor - Biophotonics módulo: JMS), uma concessão irrestrita para a departamento de Oftalmologia/Universidade Búfalo de investigação para evitar cegueira (Nova Iorque, NY) e uma bolsa da Fundação Oishei (Buffalo, NY). Reconhecemos o dom da linha deP347S de hC1 transgénica RHOe o mouse do exon 1 RHO nocaute do Dr. Janis Lem (centro médico de Tufts Nova Inglaterra, Boston, MA) e o dom do modelo no estado heterozigoto transgene NHR-E sobre o rato exon 2 RHO nocaute segundo plano de DRS G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
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