Summary
Здесь мы продемонстрировать новаторский подход к использованию высокого разрешения спектральной области оптическая когерентная томография (HR-SD-Окт) для содействия доставке генной терапии агентов в пространство субретинальное, оценить его ареал освещение и характеризуют фоторецепторных жизнеспособность.
Abstract
HR-SD-OCT используется для контролировать прогрессирование фоторецепторных дегенерации в прямом мыши модели, оценить доставки терапевтических агентов в субретинальное пространство и для оценки токсичности и эффективность в естественных условиях. HR-SD-Окт использует около инфракрасного света (800-880 Нм) и имеет оптику специально разработан для уникальных оптики глаза мыши с суб-2-микрон осевой резолюции. Трансгенные мыши модели внешних сетчатки (фоторецепторных) вырождение и контроля были образы оценить прогрессирования заболевания. Вытащил стеклянной микроиглы были использованы для доставки суб сетчатки инъекции аденоассоциированный вирус (AAV) или наночастиц (NP) через транс склеры и транс хориоидеи подход. Тщательно позиционировать кончик иглы в пространство субретинальное требовалось до калиброванный инъекция, которая поставляет жидкость в суб сетчатки пространство. Реальном времени субретинальное хирургии было проведено на нашей сетчатки системы (RIS). HR-SD-Окт продемонстрировал прогрессивного единообразных дегенерации сетчатки вследствие выражение токсичных мутант человека мутантов родопсина (P347S) (РоP347S) трансген мышей. HR-SD-OCT позволяет строгой количественной оценки всех слоев сетчатки. Наружный слой ядерной (ONL) толщина и фоторецепторных измерения длины (OSL) наружный сегмент коррелируют с фоторецепторных жизнеспособность, дегенерация или спасения. Система доставки RIS позволяет в реальном времени визуализации субретинальное инъекции в неонатальной (~ P10-14) или взрослых мышей, HR-SD-Окт немедленно определяет успех доставки и карты и ареал степени. HR-SD-Окт является мощным инструментом, который можно оценить успех субретинальное хирургии в мышей, в дополнение к оценке жизнеспособности фоторецепторов в естественных условиях. HR-SD-Сен также может использоваться для определения единообразных животных когорты для оценки степени дегенерация сетчатки, токсичности и терапевтические спасения в доклинических гена терапии научных исследований.
Introduction
Исследователи разрабатывают генной терапии для различных дегенеративных заболеваний сетчатки и сетчатки с надежды перевода Роман терапии в лечение для болезней человека1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. время домена или спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) был использован для изучения аспектов внешних дегенерации сетчатки в конкретных мыши модели болезни12,13,14 . HR-SD-OCT не, однако, был широко используется в контексте оптимизации оценки моделей мыши для определения темпов и пространственной однородности дегенерации сетчатки, или в контексте доклинических оценки гена на основе терапии, например, к оценить спасения, токсичность или пространственные масштабы векторных доставки8,,1516. После того, как полностью характеризуется модель мыши, HR-SD-Окт данных может служить информативным и надежного ресурса для измерения влияния терапии приложить спасения или токсичности в моделях мыши дегенерации сетчатки17. Многие группы используют субретинальное инъекции как метод доставки векторных благодаря своей эффективности в преобразователя фоторецепторных клеток и клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Однако это остается сложным метод мастер, учитывая, что это обычно делается путем операции свободной рукой от поверхности роговицы и часто сопряжено с катарактой, кровотечение и непреднамеренные отслоения сетчатки происходит просто путем манипуляций задней стекловидного тела. Многие группы по-прежнему пытаются субретинальное инъекции слепо и доставить вирус с помощью ручного инъекции с относительно большого диаметра из нержавеющей стали иглы (34G)8,,1718,19 ,20,21,22и несколько использует оптическая когерентная томография (Окт) imaging для подтверждения надлежащего доставки вектора к сетчатке8,17, 20 , 22. Некоторые улучшения в методе недавно были описаны с помощью иглы микромасштабной, движимый микроманипулятор22.
Мы представляем комплексный подход, который помогает в позиционирования иглы, и инъекции способствуют пользовательских режиссер стерео офтальмоскоп, разработанный в лаборатории специально для визуализации внутри небольшой глаз мыши17, 23. Использование микро иглы вытащил стекла в сочетании с стереотаксического микроманипулятор обеспечивают лучшее управление иглы с не хирургическим сократить требуемый (т.е., через хлогексидином и соединительной ткани) до инъекции. Использование давления регулируется микро инжектор помогает доставить последовательного впрыска томов, и инъекции может быть сделано с гораздо большей стабильностью, точность и гораздо медленнее, чем ручной инъекций, выполняемых ручной шприц, снижая возникновение пузырь инъекции в глаз. Меньшие иглу помогает предотвратить утечки после вывода иглы, потому что путь самоуплотняющийся. Для оценки степени инъекция/доставки, многие следственные группы полагаются на поиске и оценке площадной степени расширение зеленый флуоресценции белков (EGFP) в сетчатке (построить выражение выступил вектор) в конце экспериментального точка (эвтаназия) для подтверждения успешного инъекции11,19,20,24. Этот подход (не используя OCT) чтобы убедиться, что хирургические успеха отходов огромное количество ресурсов в хирургической процедуры время и животных, так как все животные с (неизвестных) хирургические ошибки необходимо сохранить, затем с повторяющихся мер до урожай эвтаназии и глаз (когда измеряется EGFP). Подтверждение местоположения инъекций в сетчатке может быть улучшено с помощью HR-SD-Окт продемонстрировать, что инъекции расположен между правильным слоев сетчатки (т.е. субретинальное пространства). HR-SD-Окт может также использоваться для немедленно разграничить неудачных попыток (хирургические ошибки) для выявления соответствующих переменных в реальных хирургические время улучшить подход. Мы обнаружили, что HR-SD-OCT предоставляет многочисленные преимущества в доклинических ген исследования терапии, позволяя быстрое количественной оценки внешних дегенерация сетчатки, позволяя идентификации/забой животных исследования, которые не отвечают критериям экспериментальных ( Например, неправильный субретинальное инъекций) и для прямой последующей визуализации в регион глаза где вектор был доставлен (где доклинические эффект скорее), а также управления регионами, где вектор не было доставлено. С момента своего развития, использование SD-Окт продолжает быть приняты и использованы исследователями офтальмологии и в настоящее время считается стандартом сетчатки отображения сетчатки научных исследований в мышь или грызун модели13,25. HR-SD-OCT и его возможности программного обеспечения были использованы в уникальных комплексных способов достижения цели успешного количественный генной терапии в моделях мыши на каждом шагу в процессе, включая выбор Животные модели, характеристика дегенерации в выбранной модели заболеванием, терапевтические доставки, отображение вектора доставки, и токсичность/эффективность оценки. Использование HR-SD-OCT позволяет для более эффективных лекарственных препаратов на всех уровнях этого процесса. Здесь мы опишем эти подходы, которые используются в нашей программе РНК лекарственных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животных протоколы были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование комитетами HCS ва площадей и университете Буффало-SUNY. Животные были использованы согласно положениям ассоциации исследований в зрения и офтальмологии (Арво) и Хельсинкской декларации.
1. мышь модели
- Определение модели мыши должны оцениваться в том числе элементов управления.
Примечание: Визуализация была выполнена для C57BL/6(J), Нс1/Нс1/МВт/МВт, гомозиготных для человека мутантов РоP347S Нс1 аллелей на одичал типа (WT) модель дегенерации сетчатки частично гуманизированные мыши мыши Ро+/ + генотип26 , 27, Нс1 x BL/6(J), частично гуманизированные модель с одной копией аллеля мутанта человека РоP347S Нс1 на WT мыши Ро+/ + генотипа (Нс1 /-/ / МВт/МВт) (получены путем скрещивания Нс1/Нс1/МВт/МВт с (C57BL/6 J) мышах). Выше аутосомно-доминирующей пигментный ретинит (adRP) модели находятся на фоне C57BL/6(J). Модель мыши, гомозиготных по две копии гена человека WT Ро на мыши Ро нокаут фон был также используется28,29. Эта линия — на фоне 129Sv. Когда эта линия была пересекли с маскированием Ро мыши на заднем 129Sv, разовая доза человека Ро происходит на мыши фон Ро . - Поддерживают следующие условия, касающиеся экспериментальный дизайн животных.
Примечание: Животные были сохранены в ветеринарных медицинских подразделения (VMU) в ва площадей HCS. Мышей кормили стандартные лаборатории Чоу и вырос до 12 h:12 h света: Темный циклов с мягкой люминесцентные накладные белые огни с приблизительно 300 люкс на уровне клетки на приблизительно 72 ˚F.
2. Мышь глаз гель
- Подготовьте оптических гель используется для сетчатки изображений30 и хирургических процедур.
- Объединить 2 мг/мл w/v высокой молекулярной массой (4 x 10-6 г/моль карбомер в стерильных 1 x Buffered фосфатный (PBS).
- Перемешивают при комнатной температуре до тех пор, пока гель образует вязкой оптически прозрачный гель.
- Перевести геля в бутылочки стерильные и центрифуги в размахивая настольная центрифуга ведро на 350 x g для удаления пузырьков воздуха.
- Нанести гель непосредственно к роговицы для создания интерфейса между мыши роговицы и премиум покровным стеклом (18 x 18 мм).
3. HR-SD-Окт изображений
- Смотрите HR-SD-Окт устройство (рис. 1).
- Вес животного, чтобы определить правильное дозы анестетика. Затем анестезировать мыши, с использованием 25 мкл/г веса тела 2,5% раствора буферизации 2,2,2-tribromoethyl спирт (Avertin) решение через внутрибрюшинной инъекции (IP) и добавить что глазные капли расширяются зрачки, после того, как животное прикол.
- Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, щепотку мыс и быть уверенным, что животное не реагирует.
- Обрезать усы и поместите курсор мыши на HR-SD-Окт нарты.
- Расположите мышь глаз прямо перед объективом головной убор и манипулировать элементами управления стадии до тех пор, пока роговицей и радужкой расположены. Держите гидратированный, применяя искусственные слезы роговица.
Примечание: Плавная регулировка микроманипуляторов на салазках HR-SD-Окт используются для позиции мыши, что ученик отверстие по центру и ориентированной. Оптических головной убор затем дополнительно до сетчатки становится видимым и животное далее корректируется, чтобы получить наилучшие возможные изображения. - Во-первых откройте программу «Мышь» и нажмите «пациент/экзамен». Во-вторых, нажмите «Добавить пациент» и введите соответствующую информацию для идентификации животных в окне нового пациента и «сохранить и выйти». В-третьих нажмите «Добавить экзамен», следуют «начать экзамен». В-четвертых нажмите «Добавить настраиваемые сканирования» и выберите «прямоугольный объем», выбрать ОД или OS для глаз изображаемого, затем нажмите «Добавить экзамен». Наконец Начните направленный инструмент и позиционирования животное, чтобы получить области интереса. После того, как найти правильный регион, удалите любой избыток жидкости из глаза поверхности с помощью стерильных хлопок наконечником аппликатором до захвата изображений для дальнейшего повышения качества изображения, а затем нажмите кнопку «Старт моментального снимка», и если получается хорошее изображение, нажмите кнопку «Сохранить Проверка».
Примечание: Типичные параметры для прямоугольных HR-SD-Окт изображения являются 900 а сканов/b скан и 90 б сканов/изображения. Полученные изображения являются 1.4 x 1,4 мм. Регионе сетчатки imaged зависит от конкретного эксперимента, но большинство изображений сосредоточены на голове зрительного нерва (БЕЙКЕ).
4. Оценка присутствия, скорость и единообразия модель внешнего дегенерации сетчатки
- Модель оценки внешних дегенерации сетчатки HR-SD-Окт
- Получите животных с широким спектром возрастов для управления и экспериментальной предметов оценки присутствия, скорость и единообразие внешнего дегенерации сетчатки.
- Выполните HR-SD-Окт изображений на нескольких животных в каждом возрасте от обеих когортах (болезни и нормальный). Используйте метод, описанный в 3.1.6 для получения изображений OCT.
Примечание: Данные могут быть собраны из большой когорты животных все сразу, которые распространены дни рождения, охватывающих широкий период времени (1 год), или небольшой когорты животного может быть использован для сбора нескольких изображений в течение длительного периода времени (1 год), чтобы получить аналогичные результаты. - Откройте записанные изображения прямоугольный объем HR-SD-Окт и определить первый b скан измеряться (в идеале будет включать БЕЙКЕ или другой личной вехой) от ансамбля изображений. Увеличьте изображение для заполнения экрана с помощью функции масштабирования в программном обеспечении.
- Откройте нужное количество суппортов, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении b скан и затем нажав на «Зажимов» и наконец нажав на столько суппортами нужным (они пронумерованы от 1 до 10). Убедитесь, что суппорта Показать в правом нижнем углу изображения. Используя функцию «Настроить суппорта», назначить их все как «вертикальной» на угол блока и включите «Места отображения суппорта», чтобы облегчить единый расстановки кадров через сетчатки и, наконец, нажмите Применить.
Примечание: 1st суппорта должны находиться на левой стороне изображение, при обработке oculus dexter (OD) правый глаз и 1st суппорта следует находиться на правой стороне изображения при обработке изображений зловещий левый глаз (OS) oculus. Это приводит к носовой временной ориентации всех данных для левого и правого глаза при печати. - С помощью компьютерной мыши, переместите каждый суппорта в нужное место (2,0 мм) через b скан, будучи уверенным, чтобы разместить один суппорта в центре головы зрительного нерва, b Скан изображений, которые включают его (этот штангенциркуль равным нулю). Затем с помощью мыши щелкните и перетащите суппорта длины для региона интерес. Произвольно установить суппорты, которые не overlay измеримые регионах b скан до максимальной длины и игнорировать в ходе анализа данных.
- Измерения толщины ONL, используя инструменты суппорта, путем размещения в верхней части суппорта на внешних ограничивающих мембраны (вяз) и нижней части суппорта в нижней части внешний сплетениевидный слой (ОБН). Повторите это для каждого суппорта через сетчатку с шагом 0,2 мм. Сохраните измерения.
- После того, как все суппорты были помещены и скорректировать размер, щелкните правой кнопкой мыши на изображение и нажмите кнопку «Сохранить данные суппорта».
- Повторите измерения на последующих б сканам (каждые 10й сканирования работает хорошо) от того же объема прямоугольного изображения OCT, охватывающих всю сетчатку от уступает Улучшенный регионов. Суппорты должны оставаться открытым и в том же месте по оси x. Отрегулируйте длину суппорта, не перемещая их в X-направлении.
- Откройте сохранить файлы данных, щелкнув значок рядом с обработанных b Скан небольшой файл изображения и нажмите кнопку «Перейти к данные». Нажмите кнопку «Дата изменения организовать файлы в порядке, основанном на экономию времени, и открыть все файлы для каждого b скан измеряется.
- Необработанные данные от каждого b скан Скомпилируйте в один файл в порядке от низшего к высоким основанные на номер кадра. Выберите столбцы данных, включая «Суппорта имя», «Длина» и «Центр X».
- Убедитесь, что центр X является одинаковым для всех б сканов, измеренная для каждого изображения OCT прямоугольный объем обработки. Удалить все данные из зажимов, которые не были использованы для записи измерения и установите суппорта, расположен в центре головы зрительного нерва до нуля.
- Печать данных для X против нескольких наборов данных Y чтобы получить функцию 3D печати для печати Общая толщина ONL или другой измеряется сетчатки слой.
- Сравните ONL измерений между элементом управления и экспериментальных животных с соответствующих возрастов, чтобы определить скорость и единообразия любых потенциальных дегенерации сетчатки.
- Повторите этот процесс для измерения OSL, используя те же б скан изображения. Следуйте той же методологии, используемые для измерения ONL, за исключением размещения суппорта между вяз и Бруха мембраны (BM).
Примечание: Пример того, как поставить суппорт показано в разделе представитель результаты (рис. 3B). Это должно быть сделано на увеличенном в изображении для уменьшения ошибок. - Повторите анализ данных для нескольких животных для каждый день рождения для обеих экспериментальных и управления когорты.
- Всеобъемлющей оценки и 3D отображение толщины ONL или OSL, используя средство суппортами программного обеспечения
- Обзор пост инъекции OCT изображений и запишите любой идентифицируемой достопримечательности, как БЕЙКЕ или кровеносных сосудов на сетчатке. Затем поместите указатель мыши для получения последующих SD-Окт из того же региона и не забудьте включить же идентифицируемой достопримечательности.
Примечание: Обеспечения, выявления региона сетчатки образы и занимается отслойка в пост инъекции SD-Окт изображений. Запишите образ прямоугольный объем SD-OCT и сохраните его. - Обрабатывать записанные изображения, как описано выше 4.1.3. к 4.1.14. Сохраните данные суппорта и сюжет, как описано выше.
Примечание: Результирующий массив ONL измерений используется для создания 3D сюжет, изображающие ONL толщины. Положение суппорта вдоль оси позволяют replot граф, поместив зрительного нерва в начале координат (0) вдоль оси x. Ось y строится с использованием числа b скан и зрительного нерва используется для определения отправной точкой, что позволяет правильно позицию зрительного нерва в начале координат по оси y. Выявление зрительного нерва в каждом наборе данных позволяет последующие изображения надежно выровнены.
- Обзор пост инъекции OCT изображений и запишите любой идентифицируемой достопримечательности, как БЕЙКЕ или кровеносных сосудов на сетчатке. Затем поместите указатель мыши для получения последующих SD-Окт из того же региона и не забудьте включить же идентифицируемой достопримечательности.
- Картирование масштабов укола на глазном дне изображение
- Выполняйте пост инъекции прямоугольный объем OCT для подтверждения успешного проведения инъекций. Выполните метод, описанный в 3.6.
- Используйте функцию суппорта в программное обеспечение определить точку перегиба на границе отслоенной сетчатки от ряда б сканов, охватывающих весь образ OCT. Используйте метод для открытия суппортов, описанных в 4.1.4.
- Запись изображений глазного дна с сопоставленного расположения OCT б скан и соответствующее положение суппорт на глазном дне изображение, которое соответствует расположению.
- Скомпилируйте все изображения глазного дна в составное изображение, включая суппорта позиции, что приводит к точную карту укола на глазном дне изображения (например, в разделе результаты представитель, рис. 5A).
5. внутриглазных инъекций
Примечание: Подробная информация об использовании RIS получили дальнейшее развитие в последние исследования23.
- Подготовка стекла инъекций иглами
- Автоклав капиллярные трубки с нитями небольшими порциями, с использованием сухого цикла.
- Использование пипетки съемник и настройки программы, которая будет производить кончик стекла с острым углом и диаметром в диапазоне от 2-5 мкм.
Примечание: В таблице 1показан пример 5 шаг программы, которая производится эффективное иглы на нашей пипеткой съемник. - Храните вытащил стекла иглы в сосуд иглы стерильные пипетки при комнатной температуре.
- Заполнить инъекционной иглы с желаемой раствор для инъекций
- Установите иглу в иглодержатель, оставив примерно 5/8" выступающие за пределами конца держателя.
Примечание: А расстояние меньше чем 5/8" будет сделать его трудно достичь инъекционного раствора для заполнения иглы, потому что иглодержатель не легко вписываются в открытии 0,2 мл пробирок. Кроме того имея выступать более чем на 5/8" результаты в значительно больших колебаний или прецессии кончика, затрудняя визуализации реального времени так как кончик оставляет фокальной плоскости или поле зрения (FOV), при попытке прокол глаз иглы. - Подготовьте инъекционного раствора в стерильных 0,2 мл трубку. Добавление 1:10 разрежения сульфат стерильный флюоресцеином (10 мг/мл в однократном ПБС) для инъекционного раствора для получения конечной концентрации флуоресцеин на 1 мг/мл.
Примечание: Точное краситель, применяемый для пользователя и может быть что угодно, что не токсичен и видимым невооруженным глазом под белый свет освещение для облегчения точное размещение кончик иглы на уровне ПЭС и субретинальное пространства. - Визуализируйте иглы через стерео Микроскоп при использовании ручки управления 3-оси микроманипулятор для позиционирования иглы, таким образом, чтобы он выравнивается с центром трубка, содержащая инъекционного раствора, который будет использоваться для заполнения иглы.
- Аккуратно водите кончик иглы в 0,2 мл трубку до тех пор, пока кончик иглы погруженным в жидкость. Составить желаемый объем впрыска жидкости (например 1 мкл) в необходимые для одной инъекции иглу. Поддерживать оставшийся раствор в трубки помещены в лед.
- Установите иглу в иглодержатель, оставив примерно 5/8" выступающие за пределами конца держателя.
- Подготовка животного для инъекций
Примечание: Микроскоп RIS содержится в чистоте и это бесконтактная система. Нагревательная пластинка покрыта площадку чистые адсорбента и иглы газобетона до тянет. После того, как они тянут по самостоятельной стерилизации с подогревом металлической полосы, они хранятся в закрытой камере стерилизованные, предназначенный для хранения вытащил стеклянных иголок. Иглы только обрабатываются с помощью перчатках, и ухода используется для предотвращения прикосновения кончика иглы во время установки его в держатель. Вводят решения готовятся с использованием стерильных и тестируются для загрязнения мелирование образец вируса препаратов на плиты агара LB и инкубации их на ночь в 37 градусов.- Вес животного (g) для определения соответствующей дозы обезболивающий обезболивающее.
- Администрировать анестезии (2,5% раствор спирта буферизации 2,2,2-tribromoethyl (Avertin)) через внутрибрюшинной инъекции (IP).
- Сразу же применить антихолинергические препараты (например, cyclopentylate) на оба глаза, чтобы разбавить учеников.
- Обрезать усы животного и число животных, с использованием штампа уха или другой метод.
- Промойте глаз и окрестности с разбавленным Бетадин.
Примечание: Избегайте попадания любое решение вокруг носа, как это может привести к непреднамеренному утопления. - Поместите курсор мыши на грелке, составляла 39 ° c, в предварительно формованного modeler глины мыши держатель с глазом для инъекций на иглу.
- Убедитесь, что мышь перестает отвечать на запросы, с помощью теста щепотку задние ноги.
- Выполнение субретинальное инъекций
- Используйте пару стерильных тупым Ирис щипцами осторожно побудить экзофтальм земного шара, поместив советы щипцы на 7 и 10 часов позиции на веки прижимая открытых и вниз в то же время.
- Используйте щипцы уговорить на веках под глаз шара, чтобы держать его из розетки во время процесса впрыска.
Примечание: Животные 10-14 дней часто проведет глаз из розетки более легко, чем пожилых животных. - Прямой наконечник иглы около 1-1,5 мм ниже края роговицы лимба и тщательно водить его в глаз через конъюнктивы, до тех пор, пока он создаёт склеры депрессии, как игла проникает в ткани склеры и позволяет манипулирование глаза.
- Поворот глаз вниз с микроманипулятор для визуализации склеральным депрессии через расширение зрачка с стерео Микроскоп RIS.
- Примените капли стерильные глаз гель или 1 x PBS решения и накрыть стерильные coverslip.
- Сосредоточиться на склеры депрессии, созданные кончик иглы (2-5 мкм) и диск иглу вперед до острый пик сетчатки форм в месте инъекции.
- Поверните иглу с помощью держателя до тех пор, пока кончик отверстия через склеры и флюоресцеином в иглу видна под сетчаткой в непосредственной близости от НПП монослоя клеток.
- Привод кончик иглы, так что это касательной к миру, а затем активировать ТНВД с ногой педали.
- После произнесения нужного тома (0.5-1 мкл) субретинальное пространства, снять иглу и проверить если пузырь является стабильным и что жидкость не вытекать из укола, который является первым критерии успешного внедрения.
Примечание: Поддержание надлежащего наконечник диаметром (диаметр 2-5 мкм) имеет решающее значение, чтобы избежать утечки из места инъекции. - Поместите животное на платформе изображений инструмента OCT. Следуйте инструкциям для HR-SD OCT Imaging для записи образа тома прямоугольной.
- Подтвердите, что закачиваемой жидкости находится в субретинальное пространстве и сохранить изображения для определения степени пузырь.
- Выньте из держателя животного и применить достаточное количество антибиотик мазь вводят глаз.
- Поместите животное на грелку, до тех пор, пока он полностью восстанавливается, а затем поместить его обратно в оригинальный Кейдж, откуда она взялась.
Примечание: Наши животные обычно вводят до отъема, поэтому животные должны быть возвращены в клетке с матерью.
- Картирование масштабов субретинальное пузырь с помощью OCT инструмент программного обеспечения.
- Получать прямоугольный объем октября изображение, с помощью методов, описанных ранее, в пузырь и расположите его включить узнаваемые вехой в глаза как БЕЙКЕ.
Примечание: Записи 90 б сканов работает хорошо для сопоставления пузырь, но могут быть использованы в зависимости от желаемого резолюции. - Добавьте один суппорт на рисунке и поместите его в точке перегиба, где Сетчатка отсоединяется от НПП и сосудистое.
Примечание: Программное обеспечение автоматически сопоставляет соответствующую точку линии на изображение глазного дна, представляющие суппорта и b скан оцениваются. - Захват экрана, после размещения суппорта и скомпилируйте изображения для эффективного сопоставления границы инъекции пузырь на изображение глазного дна, который точно карты укола. Сохраните скомпилированный образ для справки, чтобы помочь в поиске областей интерес во время последующей обработки изображений.
Примечание: Кроме того суппорта данные могут быть сохранены, выполнил и с помощью аналогичного метода для построения 3D наборов данных ONL толщины.
- Получать прямоугольный объем октября изображение, с помощью методов, описанных ранее, в пузырь и расположите его включить узнаваемые вехой в глаза как БЕЙКЕ.
- Интравитреальные инъекций
- Место кончике иглы, используя аналогичный хирургический подход как sub сетчатки инъекции, за исключением того, что игла приводится полностью через склеры в pars plana около 0,25 мм позади роговицы лимба и в стекловидное тело.
- После иглы применять импульса впрыска с педали.
Примечание: Наблюдается быстрое распространение краски флуоресцеин во всем стекловидного тела наглазник, заполнение расширенных ученик диафрагмы с флуоресценцией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка присутствия, скорость и единообразия модель внешнего дегенерации сетчатки
Измерения ONL были записаны от ОБН в ELM, определение границ ONL, с помощью средства суппорта в инструмент программного обеспечения. Цель заключалась в карте прогрессирование внешних дегенерации сетчатки в мышиной модели частично гуманизированные adRP. Сопоставимых изображения от управления C57BL/6(J) Мышь и Нс1/Нс1/МВт/модель мыши МВт, выражая двух копий генов опсин (РоP347S) мутант человеческий род, были продемонстрированы выставлять сетчатки выводы управления и тех серьезных и быстро прогрессивных сетчатки дегенеративные состояния. 3-недели старый adRP (Нс1 x BL/6(J)) животное, имея только одной копии мутантного гена человека РоP347S и две копии мыши WT Ро генов, было около нормальной толщины ONL. Однако последующие HR-SD-Окт сканирует на 10 и 37 недель продемонстрировали височно прогрессивного и пространственно единообразных дегенерация сетчатки, привело к потере приблизительно 60% фоторецепторов, признан ONL истончение за этот период времени. В Нс1 x BL/6(J) adRP модель дегенерация сетчатки имеет приблизительное время константа (1/e) 13 недель. Гомозиготная Нс1 животных, с двух доз токсичных мутант человека трансген мыши фон WT Ро , страдают гораздо более быстрого дегенерации, как свидетельствует обширный истончение сетчатки и практически полная потеря всех фоторецепторов 3 возраст (рис. 2) недель.
ONL мерой является лишь одним из компонентов внешних сетчатки нормальность как индекс жизнеспособности фоторецептор. OSL фоторецепторы и внутренний сегмент/наружный сегмент (IS / OS) или эллипсоид линии предоставляют доказательства в обоснование фоторецепторных жизнеспособность и функции. Сравнения в животных, которые были выведены, содержат одно (N129R - x 129R-) или две копии (2HRho 1T1T) (доз) генов человека WT Ро на фоне нокаут Ро мыши WT были измерены для толщины наружной сетчатки. Статистически значимое увеличение ~ 8 мкм в ONL наблюдалось у мышей с две копии гена человека WT Ро , по сравнению с мышей с только одной копии гена человека. В мышей с двумя против одной копии гена человека WT Ро на фоне нокаут Ро мыши WT было отмечено статистически значимое увеличение ~ 5 мкм в OSL. На рисунке 3приведен пример того, как были сделаны ONL и OSL измерения. Высокое разрешение изображения, снятые с HR-SD-Окт системы позволяют точных измерений ONL или OSL, позволяя дискриминации небольшие различия с прочной статистической надежности в моделях мыши гуманизированные WT Ро .
Диапазон от хирургического результаты подробного Окт при попытке Subretinal инъекции
HR-SD-Окт оценку попытке субретинальное инъекции принесли различные результаты. Во-первых наиболее распространенными опыт был подтверждение того, что закачиваемой жидкости было успешно доставлено в пространстве югу сетчатки. Открытия неявным субретинальное пространства (которая закрывается во время разработки) создал пузырь, который может быть четко визуализируется как в представлении en лицом HR-SD-OCT, так и в b Скан изображений. Гипо Светоотражающий жидкость была граничит с нейронных сетчатки выше и гипер Светоотражающий слой НПП клетки по-прежнему возражает против BM, ниже (Рисунок 4). Можно определить степень субретинальное инъекции, если животное было imaged HR-SD-Окт сразу же после инъекции (см. ниже). Во-вторых, инъекции может произойти в пространстве хориоидеи (под BM), а не в субретинальное пространство. Это привело к гипер отражающий слой (ПЭС), ограничивающий купол жидкость перемещенных региона сетчатки, а не гипер-отражательной способности на задней пределов глаз в OCT б сканов. В-третьих, другой потенциальный результат, которые могут произойти при попытке субретинальное инъекции был сетчатки schisis (расщепление) на слой нервных волокон. Этот результат принесли обычный внешний сетчатки анатомии, но внутренний слой сетчатки инкапсулированные пузырь, который может или не может иметь вторгся в стекловидное тело. В принципе такой шаблон schisis может произойти с инъекций в пределах наслоений нейронных надлежащего сетчатки, но мы видели только schisis слой нервных волокон на сегодняшний день. В-четвертых интравитреальные инъекции может также возникать, который не оказывает влияния на Окт. Все эти неудачи в результате первоначального неправильного кончик иглы стекла, или возможно некоторое небольшое движение иглы во время инъекции, благодаря напорные устройства инъекции переключенное потока.
Характеризующих местоположение субретинальное инъекций
Решающим фактором в определении эффективности или токсичность кандидата терапии является возможность сравнения сетчатки регионов, которые получили вектора против тех, которые не. Мы направлены значительные усилия в разработке средств для обозначения региона сетчатки участвующих в субретинальное инъекции, таким образом, чтобы во время последующих экзаменов, мы могли бы определить площадной степени сетчатки, где были применены процедуры, и следовательно где трансдукция осуществима. Золото NPs допускается высокий уровень уверенности в идентификации областей сетчатки, которые были или не были введены. Однако конкретных частиц или их формулировка, как представляется, быть токсичными и привели к тяжелой локализованных дегенерации сетчатки на сайте поле субретинальное инъекции инъекции пост 24 часа (данные не показаны). Поэтому мы разработали альтернативный метод картирования инъекции непосредственно из HR-SD-Окт визуализации данных. Метод для точного выявления границ сайта инъекции был разработан с использованием инструментов измерения (зажимов) в программный пакет инструмента (рис. 5). Мы могли бы определить края пузырь именно путем изучения отдельных б сканам (от уступает Улучшенный сетчатки), используется для создания изображения глазного дна. При размещении суппорт в точке, где пузырь пересекается прилагаемый сетчатки, позиция суппорта автоматически отображается на соответствующий b скан en лицом глазного дна изображения в точное положение вдоль оси x, где была суппорта размещены на b скан. Повторяя этот процесс позволяет отслеживать край пузырь на изображение глазного дна en лицом . Процесс выравнивания требует, что аналогичные регионов сетчатки отражаются каждый раз, когда относительно постоянного зрительного нерва голову и изображения может потребоваться быть повернуты для выравнивания сетчатки сосудов из нескольких изображений перед данных сегрегации. После процесса выравнивания пост инъекции изображения и последующих последующей изображений инъекции регион был накладывается через точки сетки данных для определения позиции измерений в пределах региона, участвующих в отслоения сетчатки. Эти данные могут отображаться как поверхности карта, которая предоставляет визуальный инструмент для определения точек данных с учетом относительно регионов за пределами инъекции инъекции.
Отображение толщины ONL в 3D
Наконец мы записать измерения ONL, OSL или других слоев сетчатки от всего образа региона сетчатки и затем отобразить данные, используя участок поверхности (рис. 5). Накладывалась на карте границы инъекции позволяет разделение двух наборов данных, включая вводят региона и региона, которая не была отсоединена во время процесса впрыска. Дальнейшей обработки и анализа данных затем может быть выполнена на этих двух наборов данных для проверки гипотез, конкретных терапевтических агентов может спасти дегенерации сетчатки или вызвать токсичность. Такой подход потенциально позволяет для экспериментальных и контролировать данные должны быть собраны из одного глаза, сравнивая регионы введенного против не вводили же глаза.
Рисунок 1 : Устройство UHR-SD-Окт. Показано устройство HR-SD-Окт. Инструмент rack (A) содержит монитор компьютера (), клавиатура и мышь (b), поле интерфейс зонда (c), двигатель OCT (d), компьютер (e), устройства управления для супер светящиеся светоиспускающие диоды (ИК) (f) и источники бесперебойного питания (g). Оптическая скамья (B) содержит изображения Оптическая головка зонда (для мыши сетчатки) (h), многоосевые (линейные и ротационные) манипулятора (я) и предметом мыши (j). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Прогрессивной внешней дегенерации сетчатки в частично гуманизированные adRP модель как измеряется HR-SD-Октябрь (A) для модели adRP были получены изображения HR-SD-Окт сетчатки (Нс1 x BL/6 (J)) в разных возрастов, C57BL/6(J) управления на 14 недель и гомозиготных Нс1 мутант линии на 3 недели. Внешний сетчатки нормальный вид на 3 недели в adRP модели, но было свидетельством прогрессивного ONL истончение и дезорганизации в и за пределами 10-недельного возраста. От 37 недель, (Нс1 x BL/6(J)) продемонстрировала обширные внешние дегенерации сетчатки. Все OCT проверки были в близости от зрительного нерва. (B) ONL толщина (в мм) вдоль горизонтальной оси через зрительный нерв был заговор для управления (C57BL/6(J)), Нс1 и adRP животных различных возрастов. Там был прогрессирующая потеря толщины ONL в частично гуманизированные adRP модели. 37 недель возраста ONL потери был больше чем 60%. Планки погрешностей = Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Красные шкалы бар = 200 мкм и все образы являются же шкале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Количественные меры ядерной слой и космического сегмента длины с помощью HR-SD-октября (A) мыши линии используется для демонстрации ONL и OSL мер. Представитель октября фото от 2HRho1T/1T (2 дозы HRho) на фоне нокаут Ро мышь) (левая панель) и N129R - x 129R-(одна доза человека Ро на фоне нокаут мыши Ро ) (правой панели). (B) показан пример того, как были помещены суппорта для измерения ONL (красный) и OSL (синий). (C) данные, полученные от трех животных каждой линии для ONL толщина была печать в формате гистограммы, показаны сравнения 2HRho1T/1T линии и N129R - x 129R-(Левая панель). 2HRho1T/1T линия имеет ~ 8 микрон толще ONL. Чтобы продемонстрировать различия в OSL, несколько измерений (семь) были сделаны из одной b скан из каждой мыши линии вяз-BM как B (синяя линия) в 9-недельных животных (правой панели). Это продемонстрировано в OSL мкм ~ 5 разница животных с 1 vs 2 копии гена HRho. ONL и OSL меры были статистически значимыми, ONL p значение = 1.7e-5 и OSL p значение = 6.4e-5. Планки погрешностей = Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Красные шкалы бар = 100 мкм и б сканов в 3A имеют такой же масштаб, 3B увеличена для повышения ясности слоев сетчатки и предоставлять качественные демонстрация как измерения были приобретены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Типы внутриглазных инъекций в мышей, выявленные HR-SD-октября (A). A (hC1xBL/6(J)) мыши вводили с ~ 1 мкл жидкости через Inferonasal transcleral transchoroidal инъекции. Результате отслоения сетчатки рассматривается как зеленый нижней правой области en лицом изображения, создавая резкий границы на переднем крае пузырь в правой части изображения. Окт глазного дна изображение места инъекции только экспонаты тонкие различия в зависимости от позиции жидкости заполнены полости, потому что изображение представляет собой сборник всех б-сканов из всей толщине сетчатки. Кроме того инъекции пузырь меняет расстояние от поверхности сетчатки от октября головной убор, производство нецеленаправленных региона в месте инъекции. (B) OCT б скан не вводили сетчатки продемонстрировал. БЕЙКЕ обозначено. (C) A субретинальное инъекции проявляется. БЕЙКЕ обозначена, и стрелки в лице en изображения (правой панели) показывают задней границы отряда. (D) A хориоидеи инъекции проявляется с четкой высота (перемещение вверх) НПП слоя (гипер Светоотражающий кривая) нижней границы сетчатки (стрелки) и значительные потери гипер-отражательной способности ПЭС и сосудистое слоев ниже закачиваемой жидкости. Сравните стрелки в изображениях (C и D). (E) A сетчатки schisis продемонстрировал возле слой нервных волокон. Наблюдать за очень тонкие гипер светоотражающая мембрана, инкапсуляции закачиваемой жидкости, а остается сетчатки придают ПЭС. Тонкие различия между тремя различными отрядами также могут быть визуализированы в лице en изображений (C, D и E). Субретинальное отряд имеет границы, который трудно визуализировать (стрелки в C), в то время как хориоидеи инъекции создает размытые гипер Светоотражающий ОПРАВЫ на переднем крае пузырь, и сетчатки schisis проявляется резким демаркации ее передней кромки (E). Оба красных масштаб баров = 200 мкм в 4В. Все изображения 4B через 4E масштабируются одинаково. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Картирование и количественной оценки внешних сетчатки изменения после инъекции субретинальное. Метод был разработан для выявления областей, представляющих интерес в ходе последующей экспертизы мышей, которые были субретинальное инъекции вектора, с 3D-печати ONL измерений из нескольких OCT б сканов. 2HRho1T/1T животных вводили с self взаимодополняющие аденоассоциированный вирус, выражая GFP и ведущий кандидат молот рибозима (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (OS глаз) на экране токсичности. (A) Imaged сразу же после, площадной степени инъекции был сопоставлен, поместив суппортов на переднем крае пузырь в точке, где внешние слои отдельно от НПП в б сканам (левая панель (красный суппорта)). Положение суппорта инструмент автоматически сопоставляется изображение глазного дна, и это повторяется и скомпилированы для как много б сканов в случае необходимости, которая зависит от желаемого резолюции (каждые 5й сканирования (A) (правая панель)). Последующие исследования OCT (каждые 2 недели) образ того же региона сетчатки, чтобы разрешить наложение; БЕЙКЕ и сетчатки сосудов являются вехами для облегчения декартовой или вращательного изменения. Весь регион сетчатки была измерена на толщину ONL условии необходимые границы (ОБН и Элм) были видны. (B) для сопоставления ONL длина над поверхностью вводят суппорта позиции (цветом) снова отображаются на изображение глазного дна и компилируются в составное изображение. Каждый 5th b Скан изображений Сен был измерен с встроенным суппортами до десяти точках через сетчатку. (C) до и после скомпилированного изображения поворачиваются, с использованием изображений программное обеспечение для выравнивания сетчатки сосудистую, который позволяет точек данных в пределах сетчатки отдельностоящий сетчатки региона будут определены накладываемое изображение и отделены. Набор (D) данных в формате таблицы, идентичен массива изображения глазного дна и разделили на две группы (измерения в пределах пузырь (красный моменты) и те, которые не являются). (E) данные представлены с помощью 3D поверхности построения функции, которая позволяет визуализировать ONL толщина над всем регионом образа. Это позволяет оценки количественных различий между регионами вводили и не вводили глаза. Щели в 3D печати (E) обеспечивает удобный способ отделить набор данных ONL измерений в пределах региона отслоенной сетчатки из региона, который оставался прилагаемый сразу же после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: программа используется для тянуть стеклянных иголок. Параметры программы для достижения стекла иглы полезно для subretinal транс склеры, transchoroidal подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-OCT предоставляет простой метод для определения характеристик потенциальных животных моделей болезней человека, чтобы определить их полезность в тестировании потенциальные терапии. Способность быстро и надежно характеризуют потенциальной модели животных болезней человека имеет решающее значение для процесса терапевтических лекарственных препаратов (например, замена генной терапии, рибозим или индуцируемый нокдаун генной терапии, комбинированных генной терапии). HR-SD-OCT предоставляет простой, быстрый и неинвазивный метод для оценки сетчатки здравоохранения, который может использоваться для характеристики и контролировать прогрессирование дегенерации сетчатки в почти любой модели мыши. Окт изображения могут использоваться для получения измерения любой или все из различных слоев сетчатки, которая может предоставить подробную оценку внешних сетчатки (фоторецепторных) дегенерации с течением времени или воздействие терапевтического спасательные попытки на вырождение степени или кинетическим timeline. HR-SD-Сен также может использоваться для оценки токсичности поставленный вектор или материалов. Наиболее значительное влияние на фоторецептор дегенерации сетчатки исследовательской программы является способность сделать изысканный измерения ONL со временем в живых животных. Один можно построить график дегенерации сетчатки для извлечения времени константа, которая является важнейшим первым шагом для оценки эффективности и токсичности кандидата терапии в той же модели над височной окно терапевтические возможности. Эта технология также позволяет для значительной экономии ценных ресурсов (животных и времени) по отношению к классической конечной гистологии, позволяя исследователя для выявления аномалий животных когорты до ввода исследование и устранение животных, не критериям экспериментальных (например, успешная субретинальное доставка).
Потребность в точной доставки некоторых терапевтических средств в пространство субретинальное мыши глаза является сложной задачей, и HR-SD-Окт обеспечивает точное визуальное подтверждение успешного субретинальное инъекции как критерий для постоянного включения животных в Доклинические исследования дизайн. Обширные усилия требуется часто следовать животных вводили в исследованиях генной терапии со временем, поскольку эти модели часто имитировать человека дегенеративных заболеваний сетчатки, где сроки болезни возникают в течение десятилетий. Многочисленные последующие осмотры необходимы для определения терапевтической эффективности или для оценки токсичности. Решение этой важнейшей задачей является способность идентифицировать и удалить животных из исследования конструкций, которые являются хирургические ошибки для доставки терапевтических вектора. Способность доставлять успешный инъекции для хорошо обученный техник с многолетним опытом подошел 90% если инъекций один глаз каждого животного и примерно 80% успеха, если инъекционных оба глаза. С этого уровня эффективности удаление от дизайна исследования животных с неудачной инъекции выгодно для проверки гипотез. Это не только сохраняет критическое время, но также позволяет для более последовательной и предсказуемой исходов. Кроме того HR-SD-OCT позволяет уменьшить количество животных, необходимых для любого одного эксперимента, позволяя же животных следует с течением времени, что снижает изменчивость животных и животных в обеих экспериментальных и контрольных групп и позволяет более Надежная статистическая оценка гипотезы о потенциальной эффективности и токсичности кандидатов-терапевтических средств.
Степень охвата сетчатки субретинальное инъекции обычно не является 100%, который сам может быть токсичных31,,3233,34. Следовательно способность различать между transduced и не преобразованы регионов имеет решающее значение для надлежащего тестирования гипотез, спасения и токсичности для данного кандидата терапевтических. Творческое использование имеющихся программных средств позволяет для точного сопоставления субретинальное инъекции в мышь глаз. Непосредственной визуализации вводят глаз обеспечивает направление для последующей обработки изображений в регионы интереса, и возможность сравнения регионов, которые были преобразованы в регионы, которые не были обработаны в том же мире. В зависимости от точности картирования желаемого этот процесс может выполняться для каждого b скан или периодически выборки из ансамбля б-сканов собраны сразу пост инъекций и компиляции всех изображений глазного дна в единое изображение с помощью графических программ, так что кусочно-непрерывной границы тщательно сопоставлены на изображение глазного дна. Сравнение изображений от сразу после инъекции для последующей изображений требует согласования изображения, так что измерения позиции могут быть сопоставлены на изображение глазного дна, и точки данных можно подразделить на месте инъекции и не вводили регионов сетчатки. Отображение головку зрительного нерва и сетчатки сосудов также может быть выполнено с использованием этой же методологии, которая помогает в ориентации глаза, пытаясь выровнять изображения впрыск с последующей последующих изображений. Эта информация может использоваться в последующих imaging для идентификации области сетчатки, где имели место инъекции. Конечно когда животные умерщвлены, расположение выражения EGFP, поставляемые вектора AAV, также содержащий кандидат терапевтических генов (например, рибозим), могут также использоваться для сравнить расположение трансдукция с области определяется Отображение изображения зависит от расположения кровеносных сосудов. Это позволит идентификации диффузии вектора в впоследствии закрытое субретинальное пространство за пределами области анатомической отряда.
Наш успех с использованием золота NPs на этикетке субретинальное пузырь был ограничен из-за токсичности, вызванных используемых материалов. Мы хотели бы призвать дальнейшее расследование таких материалов для обозначения степени субретинальное шелесту, если альтернативные препараты (различные размеры, поверхностных модификаций) можно найти, не вызвать токсичность.
HR-SD-OCT предоставляет огромное количество информации с значительно меньше времени и ресурсов и может быть предел предоставлять больше информации об эффективности и токсичности потенциальных терапевтических средств, по сравнению с традиционной методологии как гистологии. Использование этой технологии позволяет исследователю для облегчения одной из серьезных проблем в доклинических сетчатки наркотиков обнаружения35. Мышь RIS и HR-SD-Окт являются мощными инструментами для помощи исследования терапии доклинических сетчатки ген как компонент нашей программы РНК лекарственных препаратов. Эти инструменты могут широко применяться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Коммерческие отношения: MCB: нет; JMS: нет. Сетчатки, визуализации системы (RIS)23 , используемые в данном исследовании — Роман устройство существенного использования какой-либо группе, желающих проводить исследования доставки терапии гена в мышей, грызунов и мелких животных. Хотя авторы имеют конфликты не объявить что касается это устройство в данный момент, университет в Буффало - SUNY и ветеранов администрации имеют права интеллектуальной собственности и могут стремиться к коммерциализации этого инструмента в будущем.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, в частности, поддерживается Департаментом по делам ветеранов (VA), ветеранов здравоохранения администрации, управления исследований и развития (биомедицинские лаборатории исследования и развития) (Грант заслуги ва 1I01BX000669). JMS используется, в частности, как врач-научный сотрудник, офтальмологии, ва площадей; MCB используется, в частности, ва площадей. Исследование было проведено на и частично поддерживается система здравоохранения ветеранов администрации Западной Нью-Йорка (Буффало, Нью-Йорк). Содержание не отражает мнения Департамента по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов. Также поддерживается, в основную часть, по NIH/НЭЙ R01 Грант EY013433 (PI: JMS), NIH/НЭЙ R24 Грант EY016662 (UB видение инфраструктуры центр, PI: M убоя, директор - биофотоники модуль: JMS), неограниченный Грант для кафедры офтальмологии/университета в Буффало от исследования, чтобы предотвратить слепоту (Нью-Йорк, Нью -Йорк) и Грант от Фонда Oishei (Буффало, Нью-Йорк). Мы признаем дар Нс1 трансгенных РоP347S линии и мыши экзона 1 Ро нокаут от д-р Янис Lem (медицинский центр Новой Англии Тафтса, Бостон, штат Массачусетс) и дар НПЧ-E трансген модель в состоянии гетерозиготных на мышь экзона 2 Ро нокаут фон от Drs. G. Джейн Фаррар и Питер Humphries (Тринити-колледж, Дублин, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
