Summary
כאן אנחנו מדגימים גישה מוזרה לשימוש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (HR-SD-אוקטובר) כדי לסייע משלוח של סוכנים טיפול גנטי לחלל subretinal להעריך את פעולתה אמיתיות, לאפיין את קולט אור חיוניות.
Abstract
HR-SD-אוקטובר מנוצל כדי לעקוב אחר ההתקדמות של ניוון קולט אור במודלים של העכבר בשידור חי, להעריך את המסירה של סוכני טיפולית לחלל subretinal, וכן להעריך רעילות והיעילות ויוו. HR-SD-אוקטובר משתמשת ליד אור אינפרא-אדום (800-880 ננומטר) ויש אופטיקה במיוחד המיועד של אופטיקה ייחודי של העין העכבר עם רזולוציה צירית sub-2-מיקרון. העכבר הטרנסגניים מודלים של ניוון הרשתית החיצונית (קולט אור) ופקדים היו עם תמונה כדי להעריך את התקדמות המחלה. Microneedles זכוכית משך שימשו כדי לספק זריקות ברשתית sub של adeno-הקשורים וירוס (AAV) או חלקיקים (NP) דרך בגישה טרנס-scleral, טרנס-חיבור. מיצוב זהיר של המחט לתוך מרחב subretinal נדרשה לפני זריקה מכויל ללחץ, אשר מספק נוזלים לחלל תת ברשתית. ניתוח subretinal בזמן אמת נערך על הרשתית שלנו מערכת (RIS) הדמיה. HR-SD-אוקטובר הפגינו מתקדמת ניוון הרשתית אחיד עקב ביטוי רעילים מוטציה האנושי מוטציה אופסין # רודופסין (P347S) transgene (RHOP347S) בעכברים. HR-SD-OCT מאפשר כימות קפדני של כל השכבות ברשתית. השכבה החיצונית גרעינית (גרת) בעובי ואת קולט אור מדידות אורך (OSL) קטע החיצוני לתאם עם קולט אור חיוניות, ניוון או הצלה. מערכת משלוח RIS מאפשר הדמיה בזמן אמת של זריקות subretinal במחלקת יולדות (~ P10-14) או עכברים בוגרים, ו- HR-SD-אוקטובר מיד קובע ההצלחה של משלוח ומפות המכסים איזורים. HR-SD-אוקטובר הוא כלי רב עוצמה שיכול להעריך את ההצלחה של הניתוח subretinal בעכברים, בנוסף כדי מדידה החיוניות photoreceptors vivo בתוך. HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי לזהות אחיד גדודים בעלי חיים כדי להעריך את היקף ניוון הרשתית, רעילות, והצלה טיפולית בתוך הגן פרה טיפול מחקרים.
Introduction
חוקרים מפתחים ג'ין טיפולים למגוון רחב של מחלות ניוון רשתית ברשתית עם התקוות של הריפוי לתרגם טיפולים עבור מחלות אנושיות1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ובזמן תחום או תחום ספקטרלי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (SD-אוקטובר) נעשה שימוש כדי לחקור את ההיבטים של ניוון הרשתית החיצונית במודלים של העכבר ספציפיים של המחלה12,13,14 . HR-SD-אוקטובר לא, לעומת זאת, היה נרחב בשימוש בהקשר של אופטימיזציה של הערכה של מודלים העכבר כדי לקבוע את שיעור ואחידות המרחבי של ניוון הרשתית, או בהקשר של הערכת פרה ג'ין מבוסס הרפוי, לדוגמה, ל להעריך הצלה, רעילות או להיקף המרחבי של וקטור משלוח8,15,16. פעם דוגמנית העכבר מאופיין באופן מלא, הנתונים HR-SD-אוקטובר יכול לשמש משאב מקיף ואמין כדי למדוד את ההשפעה של הרפוי להפעיל חילוץ או רעילות במודלים של העכבר של ניוון הרשתית17. קבוצות רבות משתמשים הזרקת subretinal כשיטה של וקטור משלוח בשל היעילות שלה-transducing photoreceptors, תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית. עם זאת, זה עדיין שיטה קשה להתמחות, בהתחשב בכך שזה נעשית בדרך כלל על ידי ניתוח סגנון חופשי ממשטח הקרנית, כרוך לעיתים קרובות עם קטרקט, דימום, לא מכוונות detachments ברשתית מתרחשים על-ידי מניפולציה של הצד האחורי בזגוגית. קבוצות רבות עדיין ניסיון זריקות subretinal בצורה עיוורת ולספק את הווירוס באמצעות זריקות ידנית עם קוטר גדול יחסית פלדת אל-חלד מחטים (34 גר')8,17,18,19 ,20,21,22, ואת מספר שימושים טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) הדמיה כדי לאשר מסירה נכונה של וקטור רשתית8,17, 20 , 22. כמה שיפורים בשיטה לאחרונה תוארו באמצעות מחטים microscale מונע על ידי micromanipulator22.
אנו מציגים גישה אינטגרטיבית אשר מסייע מיקום המחט, הזריקות הן בהנחייתם של ophthalmoscope מותאם אישית סטריאו מכוונת תוכנן במעבדה במיוחד להמחשת בתוך העין קטן של העכבר17, 23. השימוש זכוכית משך מחטים מיקרו בשיתוף עם micromanipulator stereotaxic לספק שליטה טובה יותר של מיקום המחט ללא חיתוך כירורגי למטה נדרש (קרי, דרך conjunctivae, רקמת חיבור) לפני זריקה. השימוש של הלחץ מוסדר מזרק מיקרו מסייע לספק הזרקת עקבי אמצעי אחסון ולאחר הזרקת יכול להיעשות עם יציבות גדול בהרבה, דיוק, איטית יותר מאשר זריקות ידנית המבוצעת על ידי מזרק ידניים, ובכך להקטין מופע של הזרקת קצף לתוך העין. המחט קטן עוזר למנוע את זליגת בעקבות הנסיגה המחט שהנתיב אינו עצמית איטום. כדי להעריך את היקף הזרקה/מסירה, קבוצות חקירה רבות להסתמך על מציאת הערכת מידת אמיתיות פלורסצנטיות ירוק משופרת ביטוי חלבון (EGFP) ברשתית (לבנות ביטוי מועברים על ידי וקטור) בסוף ניסיוני הצבע (המתת חסד) כדי לאשר זריקות מוצלחות11,19,20,24. זה מתקרב (אינו מנצל OCT) כדי לוודא הצלחה ניתוחי מבזבז כמות עצומה של משאבים בעלי חיים, ושעת פרוצדורלי כירורגי מאז כל החיות עם כשלים כירורגי (לא ידוע) צריך להיות מתוחזק, ואחריו עם מידות החוזרות על עצמן עד המתת חסד ועין הקציר (כאשר EGFP נמדדת). אישור על המיקום של הזרקת ברשתית ניתן לשפר באמצעות HR-SD-OCT כדי להדגים כי הזרקת ממוקם בין שכבות הנכון של הרשתית (כלומר החלל subretinal). HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי מיד ניסחו נסיונות כושלים (כישלונות כירורגי) לזהות את המשתנים הרלוונטיים בזמן אמיתי כירורגית כדי לשפר את הגישה. מצאנו כי HR-SD-אוקטובר מספק יתרונות רבים בגן פרה לימודי טיפול על-ידי מתן ראפיד הערכה כמותית של ניוון הרשתית החיצונית, המאפשר זיהוי/ליקוט של מחקר בבעלי חיים אשר אינם עומדים בקריטריונים ניסיוני ( למשל, הזרקת subretinal שגוי), וכדי לכוון ומעקב הדמיה לאזור העין איפה וקטור נמסרה (אפקט פרה איפה הכי סביר), כמו גם לשלוט אזורים שבהם לא נמסרה וקטור. מאז התפתחותו, השימוש SD-אוקטובר המשיכה להיות מקובלים, משמשים חוקרים אופתלמולוגיה ונחשב כיום התקן של הדמיה ברשתית במחקרים מדעיים רשתית העכבר או מכרסם מודלים13,25. HR-SD-אוקטובר ויכולות התוכנה שלה נוצלו בדרכים משולב ייחודי כדי לקדם את המטרה של ריפוי גנטי כמותי מוצלחת במודלים של העכבר בכל שלב בתהליך, כולל הבחירה במודל חיה, אפיון מנוון הנבחר מחלת מודלים, משלוח טיפולית, מיפוי של וקטור משלוח והערכה רעילות/יעילות. השימוש של HR-SD-OCT מאפשר גילוי התרופה יעילה יותר בכל רמה של התהליך. כאן נתאר גישות אלה המשמשים בתוכנית שלנו גילוי תרופות ה-RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים בבעלי חיים היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש ועדות של HCS יורד את VA והאוניברסיטה באוניברסיטה-באפלו. חיות שימשו בהתאם לאמור של האגודה לחקר חזון, רפואת עיניים (ארוו), את הצהרת הלסינקי.
1. עכבר מודלים
- לזהות העכבר מודלים להערכה כולל פקדים.
הערה: הדמיה בוצע עבור C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, מודל ניוון רשתית העכבר humanized חלקית homozygous עבור האדם מוטציה רוP347S hC1 אללים-הפראי-סוג (WT) העכבר רו+ + גנוטיפ26 , 27, hC1 x BL/6(J), מודל humanized חלקית עם עותק יחיד של מוטציה האנושי רוP347S hC1 אלל על העכבר WT רו+ + גנוטיפ (hC1 /-/ / mWT/mWT) (מתקבל על ידי מעבר hC1/hC1 / / mWT/mWT עם C57BL/6 ( J) עכברים). מעל אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (adRP) הן על רקע C57BL/6(J). דגם עכבר כי הוא homozygous על שני עותקים של הגן WT רו אנושי על העכבר רו נוקאאוט הרקע היה גם בשימוש28,29. הקו הזה הוא על רקע 129Sv. כאשר הקו הזה היה חצה עם פצצה רו העכבר על רקע 129Sv, מנה אחת של האדם רו מתרחשת על רקע רו העכבר. - לשמור על החיות בעקבות התנאים הקשורה הנבחנים.
הערה: החיות היו שמרו ב וטרינרי רפואי יחידה (VMU)-HCS יורד VA. העכברים קיבלו צ'או מעבדה רגיל ו- h h:12 מתחת לגיל 12 מבוגר אור: אורות עם 300 לאקס ברמה כלוב-˚F כ 72 לבנים, מחזורי כהה עם תקורה פלורסנט רך.
2. העכבר ג'ל לאזור העיניים
- הכינו את הג'ל אופטי המשמש הדמיה ברשתית30 של ניתוחים.
- לשלב משקל מולקולרי גבוה של 2 מ"ג/מ"ל w/v (4 x 106 גר'/מול carbomer עקר 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS).
- מערבבים בטמפרטורת החדר עד הג'ל יוצר ג'ל שקוף אופטית צמיגה.
- להעביר את הג'ל לתוך בקבוקים סטריליות, צנטריפוגה ומפרידה שולחן מתנדנד דלי ב g 350 x כדי להסיר בועות אוויר לכוד.
- להחיל את הג'ל ישירות על הקרנית ליצור ממשק בין הקרנית העכבר פרימיום כיסוי זכוכית (18 מ מ x 18 מ"מ).
3. בית-SD-אוקטובר הדמיה
- לראות את המכשיר HR-SD-אוקטובר (איור 1).
- שוקלים את החיה כדי לקבוע את המינון הנכון של תרופות להרדמה. לאחר מכן עזים ומתנגד העכבר באמצעות 25 µL גרם של משקל הגוף של הפתרון 2.5% של 2,2,2 במאגר-tribromoethyl אלכוהול (Avertin) פתרון באמצעות בקרום הבטן הזרקת (IP), להוסיף שטיפות העיניים להתרחב התלמידים לאחר החיה. הוא מרותק למיטה.
- לאשר החיה הוא מורדם לחלוטין על ידי צביטה הבוהן, ותהיה בטוח שבעל החיים אינו מגיב.
- לקצץ את שפם, מקם את העכבר על המזחלת HR-SD-אוקטובר.
- מקמו את העין של העכבר ישירות מול העדשה סליחה ולטפל הפקדים שלב עד ה קרנית וה איריס ממוקמים. שמור את הקרנית להתייבש על-ידי החלת דמעות מלאכותיות.
הערה: Micromanipulators התאמת משובח על המזחלת HR-SD-אוקטובר משמשות מיקום העכבר כך הצמצם התלמיד הוא במרכז, מונחה. ראש אופטי מתקדם ואז עד הרשתית הופך לגלוי החיה מכוונן נוסף כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר האפשרית. - ראשית, לפתוח את התוכנה "העכבר" ולחץ על "החולה/מבחן". שנית, לחץ על "הוסף את החולה" והזן את המידע הרלוונטי כדי לזהות את החיה החולה בחלון חדש, "שמור וצא". שלישית, לחץ על "הוסף מבחן" ואחריו "התחל מבחן". רביעית, לחץ על "הוסף סריקה מותאמת אישית", בחר "אחסון מלבנית", לבחור יתר או OS עבור העין להיות עם תמונה ולאחר מכן לחץ על "הוסף את הבחינה". לבסוף, להתחיל מכוון המכשיר והמיקום את החיה כדי להשיג את האזור של ריבית. לאחר מציאת האזור הנכון, להסיר את כל הנוזלים העודפים ממשטח העין בעזרת כותנה סטרילי משופעת המוליך בדיוק לפני ייבוא תמונות כדי לשפר עוד יותר את איכות התמונה ולאחר מכן לחץ על התחל בזק, אם מתקבל דימוי טוב, לחץ על "שמור סרוק".
הערה: פרמטרים אופייני לתמונות HR-SD-אוקטובר מלבני 900-סריקות/b-סריקה הינם 90 b-סריקות/תמונה. תמונות נרכשות הן 1.4 מ"מ x 1.4 מ"מ. האזור של הרשתית עם תמונה תלוי בניסוי מסוים, אבל רוב התמונות מרוכזים על ראש עצב הראייה (ONH).
4. הערכת את נוכחות קצב, אחידות של מודל Degenerations ברשתית החיצוני
- ניוון הרשתית החיצונית הערכת דגם HR-SD-אוקטובר
- להשיג חיות עם קשת רחבה של גילאים עבור שליטה והן נושאים ניסיוני כדי להעריך את נוכחות קצב, אחידות של ניוון הרשתית החיצונית.
- לבצע הדמיה HR-SD-אוקטובר על בעלי חיים מרובים בכל גיל של שני גדודים (מחלה, רגיל). השתמש בשיטה המתוארת בעלון 3.1.6 כדי לקבל את התמונות OCT.
הערה: ניתן לאסוף נתונים מתוך קבוצה גדולה של חיות בבת אחת, אשר ההפצה ימי הולדת המתפרסות על-פני פרק זמן (1 שנה) רחב, או קבוצה קטנה של בעלי חיים יכול לשמש כדי לאסוף תמונות מרובות על פני תקופה ארוכה של זמן (1 שנה) כדי להשיג תוצאות דומות. - לפתוח את תמונת אמצעי אחסון מלבנית HR-SD-אוקטובר נרשם, ולזהות את הסריקה-b הראשונה שברצונך למדוד (אידיאלי יכללו את ONH או ציון לזיהוי אחרים) מן ההרכב של תמונות. להגדיל את התמונה כדי שתמלא את המסך באמצעות תכונת הזום בתוכנה.
- פתח מספר מחוגה הרצוי על-ידי לחיצה ימנית על התמונה של הסריקה b ו ולחיצה על "מאוזנים" סוף סוף לחיצה על מחוגה רבים לפי הצורך (הם ממוספרים מ-1 עד 10). ודא כי הרכיבים מאוזנים מופיע בפינה הימנית התחתונה של התמונה. באמצעות התכונה "קביעת תצורה של Caliper", להקצות להם כמו "אנכי" זווית בלוק בעמודה, הפעל את "המיקום Caliper התצוגה" כדי להקל על השמה אחיד על פני הרשתית, לבסוף, לחץ על החל.
הערה: Caliperst 1 להניחה על הצד השמאלי של התמונה בעת עיבוד אוקולוס (OD) דקסטר עין ימין, 1סט קליפרים של צריך להיות ממוקם בצד ימין של התמונה בעת עיבוד הדימויים עין שמאל אוקולוס (OS) מאיים. התוצאה מסיכת לכיוון הטמפורלי של כל הנתונים עבור שתי העיניים ימינה ושמאלה בעת התוויית. - שימוש בעכבר המחשב, לעבור כל caliper למיקום הרצוי (2.0 מ מ אחד מהשני) על פני b-הסריקה, הקפד למקם caliper אחד במרכז של ראש עצב הראייה, תמונות b-scan לכלול אותה (מוגדר caliper הזה אפס). ואז להשתמש בעכבר כדי ללחוץ ולגרור את caliper אורך כדי להתפרס באזור עניין. הגדר באופן שרירותי מחוגה לא כיסוי מדיד מחוזות b-scan כדי האורך המרבי, ולא להתעלם במהלך ניתוח הנתונים.
- למדוד את עובי גרת באמצעות הכלים Caliper, על ידי הצבת העליון של caliper קרום המגביל חיצוני (אלם), בתחתית caliper בתחתית השכבה החיצונית plexiform (OPL). חזור על הפעולה עבור כל caliper על פני הרשתית-0.2 מ מ והפרשים קבועים. שמור את המידות.
- לאחר כל מחוגה יש כבר הניח, מותאם לגודל, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על "שמור נתונים Caliper".
- חזור על המידות עוקבות b סריקות (כל 10בתאנון סריקה טוב עובד) מאמצעי האחסון מלבני באותה תמונת OCT המתפרסות על-פני הרשתית כולו מן נחות לאזורים מעולה. מחוגה תישאר פתוחה, באותו מיקום על ציר ה-x. להתאים את האורך של הרכיבים מאוזנים מבלי להזיז אותם X-כיוון.
- פתח שמור קבצי נתונים על-ידי לחיצה על סמל קובץ קטן ליד b-הסריקה מעובד תמונה ולחץ על "ללכת על נתונים". לחץ על "תאריך השתנה כדי לסדר את הקבצים לפי סדר בהתבסס על זמן נשמר ולפתוח כל הקבצים עבור כל סריקה-b נמדד.
- בצע הידור הנתונים הגולמיים של כל b-סריקה לתוך קובץ בודד מהנמוכה הגבוה ביותר בהתבסס על מספר מסגרת. בחר את העמודות של נתונים כולל "Caliper שם", "משך" ו- "מרכז X".
- ודא המרכז X זהה עבור כל b-סריקות נמדד עבור כל תמונה OCT נפח מלבני מעובד. מחיקת נתונים כלשהם מחוגה ששימשו לא להקליט מדידות והגדר את caliper הממוקם במרכז של ראש עצב הראייה לאפס.
- להתוות את הנתונים עבור X לעומת מספר ערכות נתונים Y כדי לקבל פונקציה מגרש תלת-ממד כדי להתוות את עובי הכוללת גרת או אחר שנמדד שכבה ברשתית.
- השווה גרת המידות בין שליטה חיות ניסוי עם הגילאים המתאים כדי לקבוע את קצב ואת אחידות בכל ההשתלות פוטנציאליים.
- חזור על התהליך עבור מדידות OSL באמצעות אותן תמונות b-scan. בצע את המתודולוגיה אותו נהגו למדוד את גרת, למעט הצבת הרכיבים מאוזנים בין קרום אלם אנד של ברוך (מוניטור).
הערה: דוגמה כיצד למקם את caliper מוצג במקטע תוצאות נציג (איור 3ב). זה צריך להיעשות על תמונה מוגדלת ב כדי להקטין את השגיאה. - חזור על ניתוח הנתונים לבעלי מרובים עבור כל יום הולדת עבור שנינו ניסיוני, שליטה גדודים.
- מקיף מדידה ומיפוי תלת-ממד של עובי גרת או OSL באמצעות הכלי מחוגה תוכנה
- סקור את התמונות OCT של הזרקת פוסט ובצע כל ציוני דרך לזיהוי, כמו ONH או כלי הדם ברשתית. אז הצב את העכבר כדי לקבל המשך טיפול SD-אוקטובר באותו האזור, הקפד לכלול ציוני לזיהוי באותה הדרך.
הערה: ודא כי האזור של הרשתית עם תמונה, מעורב את הרשתיות מזוהה של תמונות הזרקת SD-אוקטובר פוסט. תמונת אמצעי אחסון מלבנית SD-אוקטובר להקליט ולשמור אותו. - לעבד תמונות מוקלטות כמתואר לעיל צעדים 4.1.3. כדי 4.1.14. שמור את הנתונים caliper ואת מגרש כמתואר לעיל.
הערה: מערך כתוצאה של מדידות גרת משמש ליצירת מגרש 3D המתארים את עובי גרת. המיקום של הרכיבים מאוזנים לאורך ציר ה-x מאפשרים לאדם replot על הגרף הצבת עצב הראייה על המקור (0) לאורך ציר ה-x. ציר ה-y מותווים באמצעות מספר b-scan, עצב הראייה משמש לאחר מכן כדי להגדיר את נקודת ההתחלה, המאפשר למצב כראוי את עצב הראייה על המקור בציר ה-y. זיהוי עצב הראייה של כל ערכת נתונים מאפשר מעקב תמונות ייושר באופן אמין.
- סקור את התמונות OCT של הזרקת פוסט ובצע כל ציוני דרך לזיהוי, כמו ONH או כלי הדם ברשתית. אז הצב את העכבר כדי לקבל המשך טיפול SD-אוקטובר באותו האזור, הקפד לכלול ציוני לזיהוי באותה הדרך.
- מיפוי היקף ההזרקה על גבי התמונה הפונדוס
- לבצע פוסט הזרקת נפח מלבני OCT כדי לאשר את ההצלחה של הזריקה. יש להשתמש בשיטה המתוארת ב 3.6.
- השתמש בתכונה Caliper בתוכנה לזיהוי נקודת פיתול בגבול של הרשתית מנותקת ממספר b סריקות המתפרסות על-פני התמונה OCT כולה. השתמש בשיטה כדי לפתוח מחוגה המתוארים 4.1.4.
- להקליט את התמונות הפונדוס עם המיקום ממופה של OCT b-סריקה, מיקום caliper המתאים בתמונה הפונדוס, התואם למיקום שלו.
- בצע הידור כל התמונות הפונדוס לתוך תמונה מורכבת, כולל את העמדות caliper, כשהתוצאה היא מפה מדויקת של ההזרקה על גבי התמונה הפונדוס (למשל בסעיף התוצאות נציג, איור 5א).
5. תוך-עיני זריקות
הערה: פרטים על השימוש RIS בהמשך פירט מחקר האחרונות23.
- הכנת מחטים הזרקת זכוכית
- אוטוקלב צינורות קפילר זיריהם בקבוצות קטנות, באמצעות מחזור יבש.
- השתמש הגדרת תוכנית אשר יפיקו טיפ זכוכית עם הזווית החדה, קוטר בטווח של 2-5 מיקרומטר והגדוד פיפטה.
הערה: תוכנית שלב דגימת 5 אשר הפיק מחטים יעיל על פולר פיפטה שלנו מוצג בטבלה 1. - אחסן את המחטים זכוכית משך בצנצנת מחט סטרילית פיפטה בטמפרטורת החדר.
- למלא את המחט הזרקת הפתרון הרצוי עבור הזרקה
- לטעון את המחט לתוך למחזיק המחט, עוזב כ "5/8 בולטות שמעבר לקצה של בעל.
הערה: א מרחק של פחות מ- 5/8 זה יהיה קשה להגיע הפתרון הזרקת כדי למלא את המחט, כי בעל מחט אינה מתאימה בקלות לתוך הפתח של צינורות 0.2 מ"ל. כמו כן, יש את המחט בולטות יותר מ- 5/8 תוצאות תנודה גדולים משמעותית או נקיפת של הקצה, מקשה על הדמיה בזמן אמת מאז הטיפ משאיר את מטוס מוקד או את שדה הראיה (FOV), תוך ניסיון ניקוב העין. - להכין את הפתרון הזרקת בשפופרת סטרילי 0.2 מ"ל. להוסיף 1:10 דילול של fluorescein סטרילי סולפט (10 מ"ג/מ"ל ב- 1 x PBS) לפתרון של הזרקת בריכוז הסופי של fluorescein-1 מ"ג/מ"ל.
הערה: הצבע המדויק נעשה שימוש ספציפיים למשתמש, יכול להיות דבר שהוא רעיל וגלוי לעין בתאורה אור לבן כדי לעזור להקל על המיקום המדויק של קצה המחט ברמה של RPE ומרחב subretinal. - דמיינו את המחט דרך המיקרוסקופ סטריאו תוך שימוש בידית הבקרה של micromanipulator 3-ציר כדי למקם את המחט כך שיהיה מיושר עם המרכז של הצינור המכיל הפתרון הזרקת כדי לשמש ממלא את המחט.
- לנהוג בזהירות קצה המחט לתוך הצינור 0.2 מ"ל, עד קצה המחט הוא שקוע בתוך הנוזל. לצייר את עוצמת הקול הרצוי של הזרקת נוזל (למשל 1 µL) לתוך המחט הדרושות זריקה אחת. לשמור על הפתרון הנותרים בצינור הכניסו קרח.
- לטעון את המחט לתוך למחזיק המחט, עוזב כ "5/8 בולטות שמעבר לקצה של בעל.
- הכנת החיה להזרקה
הערה: המיקרוסקופ RIS נשמר נקי והוא מערכת ללא מגע. הצלחת חימום מכוסה משטח נקי adsorbent, מחטים בלוק לפני נמשכת. לאחר שהם נמשכים על ידי רצועה מתכת מחוממת עצמית לחיטוי, הם שמרו על תא סטיריליים סגור המיועד להכיל זכוכית משך מחטים. המחטים מטופלות רק באמצעות הידיים בכפפה, טיפול משמש למניעת לגעת את קצה המחט בזמן זה גובר לתוך למחזיק. הפתרונות מוזרק מוכנות תוך שימוש סטרילי טכניקה, והם נבדקו עבור זיהום על ידי ומבטא מדגם של ההכנות וירוס על פלטות אגר LB המקננת בהם במשך הלילה-הלעפה תרוטרפמט 37.- שוקלים את החיה (g) כדי לקבוע את המינון המתאים של שיכוך כאב הרדמה.
- לנהל הרדמה (2.5% תמיסת כוהל 2,2,2 במאגר-tribromoethyl (Avertin)) באמצעות בקרום הבטן הזרקה (IP).
- מיד להחיל תרופות אנטיכולינרגיות (למשל, cyclopentylate) בשתי העיניים להתרחב לתלמידים.
- לקצץ שפם של החיה, מספר החיה באמצעות ניקוב האוזן או שיטה אחרת.
- לשטוף את העין ואת האזור שמסביב עם betadine מדולל.
הערה: להימנע מקבלת כל פתרון סביב האף, כמו התוצאה יכולה להיות לא מכוונת טובע. - הצב העכבר על משטח חימום, ומתוחזק על הלעפה תרוטרפמט 39, קליי מחזיק של המעצב מעוצבת מראש עכבר עם העין כדי להיות מוזרק לעבר המחט.
- ודא שהעכבר אינו מגיב באמצעות מבחן קמצוץ של כף הרגל האחוריות.
- ביצוע הזרקת subretinal
- השתמש זוג מלקחיים איריס בוטה סטרילי לזירוז בעדינות proptosis של כדור הארץ על-ידי הצבת קצות המלקחיים-7 ו- 10 o ' שעון עמדות על בעפעפיים תוך דחיפת פתוח וכלפי מטה באותו זמן.
- השתמש המלקחיים לפתות את העפעפיים תחת העולם העין לשמור אותו מהחשמל במהלך תהליך ההזרקה.
הערה: בעלי חיים בן 10 עד 14 ימים לעיתים קרובות תקיים את העין מהחשמל בקלות רבה יותר מאשר בעלי חיים בוגרים. - לכוון את קצה המחט כ 1-1.5 מ מ מתחת לקצה של לימבוס הקרנית, בזהירות לנהוג את זה לתוך העין דרך הלחמית, עד שהיא יוצרת גומה scleral כפי המחט חודרת לתוך הרקמה בסקלרה, מאפשר מניפולציה של העין.
- לסובב את העין כלפי מטה עם micromanipulator כדי להמחיש את הדיכאון scleral דרך האישון מורחבים עם המיקרוסקופ סטריאו RIS.
- החל טיפת ג'ל עיניים סטרילי או 1 x PBS פתרון ולכסות עם coverslip עקר.
- מתמקדים הדיכאון scleral שנוצרו על-ידי קצה מחט (2-5 מיקרומטר) והעברה כונן המחט עד לשיא חדה של הרשתית הטפסים באתר הזרקת.
- לסובב את המחט באמצעות בעל עד הקצה משעמם דרך בסקלרה, fluorescein במחט מוצגת מתחת הרשתית בסביבה הקרובה של טפט תאי RPE.
- כונן את קצה המחט אז היא סוטה העולם ולאחר מכן הפעל את משאבת הזרקה עם המתג דוושת רגל.
- לאחר האחסון הרצוי נמסרה (0.5-1 µL) למרחב subretinal, לשלוף את המחט ולבדוק אם bleb יציב, את הנוזלים אינה דולפת מהאתר בהזרקה, אשר הוא הקריטריון הראשון של זריקה מוצלחת.
הערה: שמירה על קוטר עצה נכונה (2-5 מיקרומטר קוטר) הוא קריטי כדי למנוע זליגות ההזרקה. - במקום החיה על פלטפורמת הדמיה של המכשיר OCT. בצע את ההוראות HR-SD OCT הדמיה כדי להקליט תמונת אמצעי אחסון מלבנית.
- לאשר כי הנוזל מוזרק ממוקם בחלל subretinal, ולשמור את התמונות לצורך קביעת היקף bleb.
- הסר את החיה ממחזיק ולהחיל סכום נכבד של אנטיביוטית לעיניים מוזרק.
- במקום החיה על גבי כרית החימום עד שהוא לחלוטין משחזרת, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה לתוך הכלוב המקורי. מאיפה זה הגיע.
הערה: החיות שלנו מוזרקים בדרך כלל לפני הגמילה, לכן בעלי החיים צריך להחזיר את הכלוב עם האמא.
- מיפוי היקף bleb subretinal באמצעות כלי תוכנה מכשיר OCT.
- להשיג תמונת OCT אמצעי אחסון מלבנית, תוך שימוש בשיטות שתוארו לעיל, של bleb ומקם אותה כדי לכלול נקודת ציון לזיהוי בתוך העין כמו ONH.
הערה: הקלטה 90 b סריקות עובד טוב זמן התגובה. ממפה את bleb, אך יכול לשמש בהתאם הרזולוציה הרצויה. - להוסיף caliper יחיד של הדמות ומניחים אותו על נקודת פיתול איפה הרשתית לניתוק מן RPE דמית העין.
הערה: התוכנה ממפה אוטומטית נקודה המקביל לקו על גבי התמונה הפונדוס המייצגים את caliper b-הסריקה חישובו. - ללכוד את המסך בעקבות הצבת הרכיבים מאוזנים, ולעבד את התמונות למפות ביעילות על גבול bleb הזרקת על גבי התמונה הפונדוס, הממפה בדיוק ההזרקה. לשמור את התמונה הידור לעיון לסייע באיתור אזורי עניין במהלך ומעקב הדמיה.
הערה: לחלופין, הנתונים caliper ניתן לשמור נענו, המותווה באמצעות שיטה דומה עבור ערכות נתונים תלת-ממדיים ההתווייה של עובי גרת.
- להשיג תמונת OCT אמצעי אחסון מלבנית, תוך שימוש בשיטות שתוארו לעיל, של bleb ומקם אותה כדי לכלול נקודת ציון לזיהוי בתוך העין כמו ONH.
- הזרקת Intravitreal
- מניחים את קצה המחט באמצעות ניתוח בגישה דומה כמו זריקה ברשתית sub, חוץ מזה המחט מונעת לחלוטין דרך בסקלרה- pars plana כ 0.25 מ מ מאחור את הקרנית לימבוס ולתוך את הזגוגיות.
- בעקבות מיקום המחט, להחיל את הדופק הזרקה עם דוושת רגל.
הערה: דיפוזיה מהירה של לצבוע fluorescein ברחבי הזגוגיות של עיינית הוא ציין, ממלא את הצמצם תלמידו מורחבים עם זריחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכת את הנוכחות, קצב ואת אחידות של ניוון הרשתית החיצונית מודל
מדידות של גרת נרשמו מ- OPL בוקיצה, הגדרת גבולות גרת באמצעות הכלי caliper הניתנים התוכנה כלי נגינה. המטרה הייתה למפות את ההתקדמות של ניוון הרשתית החיצונית במודל של עכברים adRP humanized חלקית. תמונות דומות בין עכבר C57BL/6(J) הבקרה של mWT hC1/hC1 / / / דגם העכבר mWT, המבטאת שני עותקים של הגנים אופסין (RHOP347S) רוד האנושי מוטציה, הוצגו שהפגינו הממצאים ברשתית שליטה והן אלה של חמור, במהירות ברשתית ניוונית פרוגרסיבית. AdRP בת שבוע-3 (hC1 x BL/6(J)) חיה, יש רק עותק אחד של גן המוטציה רוP347S האנושי ואת שני עותקים של הגנים רו העכבר WT, היה ליד עובי גרת נורמלי. עם זאת, מעקב HR-SD-OCT סורק-10 ו- 37 שבועות והפגינו חנותם מתקדמת ואחידה במרחב ניוון הרשתית שתוצאתם היתה כ- 60% אובדן photoreceptors הוכרו גרת דליל על מסגרת זמן זו. HC1 x BL/6(J) adRP מודל, ניוון הרשתית יש את קבוע הזמן המשוער של (1/e) של 13 שבועות. חיות homozygous hC1, עם שתי מנות של רעילים transgene אנושי המוטציות על העכבר רקע WT רו , סובל מהתנוונות הרבה יותר מהירה כפי שמתואר על ידי דילול ברשתית מקיף לאובדן מוחלט ביסודו של כל photoreceptors ב- 3 שבועות של גיל (איור 2).
המדד גרת הוא רק מרכיב אחד של נורמליות הרשתית החיצונית כמו אינדקס של קולט אור חיוניות. OSL את photoreceptors, על קטע קטע פנימי/חיצוני (IS / OS) קו או קו אליפסואיד לספק ראיות כדי לתמוך קולט אור חיוניות ותפקוד. השוואות בבעלי חיים אשר יש כבר וגדל כדי להכיל אחד (N129R - x 129R-) או שני עותקים (2HRho 1T1T) (מינונים) של גנים WT רו אנושי על רקע נוקאאוט רו העכבר WT נמדדו על עובי הרשתית החיצונית. עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של ~ 8 מיקרומטר ב גרת נצפתה אצל עכברים עם שני עותקים של הגן WT רו האנושית בהשוואה לעכברים עם עותק אחד בלבד של הגן האנושי. עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של ~ 5 מיקרומטר ב OSL נצפתה אצל עכברים עם שניים לעומת עותק אחד של הגן WT רו אנושי על רקע נוקאאוט רו העכבר WT. דוגמה של איך נעשו מדידות גרת ו OSL מוצג באיור3. הרזולוציה הגבוהה של תמונות שנלכדו באמצעות מערכת HR-SD-אוקטובר אפשר מדידות מדויקות של גרת או OSL ומאפשר אפליה של הבדלים קטנים עם מוצק סטטיסטיות אמינות במודלים העכבר humanized WT רו .
טווח של ניתוח תוצאות מפורט על-ידי OCT בעת ניסיון הזרקה Subretinal
HR-SD-אוקטובר הערכה של זריקות subretinal ניסיון הניב מגוון תוצאות. ראשון, החוויה הנפוץ ביותר היה אישור כי הנוזל מוזרק נמסרה בהצלחה בתוך החלל התת ברשתית. הפתח של החלל subretinal מרומזת (אשר נסגר במהלך הפיתוח) יצר bleb זה יכול להיות דמיינו בבירור פנים en התצוגה של ה-HR-SD-OCT והן של תמונות b-scan. הנוזל היפו-רעיוני היה גובל הרשתית עצבית לעיל, לבין השכבה תא RPE hyper-רעיוני עדיין מתנגד BM, להלן (איור 4). היתה אפשרות לקבוע את היקף הזריקה subretinal אם החיה הגלקסיה צולמה על ידי HR-SD-אוקטובר מיד לאחר ההזרקה (ראו להלן). שנית, הזריקה יכולה להתרחש בחלל חיבור (מתחת מוניטור) ולא לחלל subretinal. כתוצאה מכך שכבת hyper-רעיוני (RPE) תוחמת את הכיפה של האזור שנעקרו נוזל של הרשתית, אין hyper-השתקפות בקצה האחורי של העין ב- OCT b סריקות. שלישית, תוצאה נוספת פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ניסיון הזרקת subretinal היה schisis ברשתית (פיצול) בשכבת סיבי עצב. תוצאה זו הניבה האנטומיה של הרשתית החיצונית נורמלי, אבל השכבה הפנימית של הרשתית אנקפסולציה bleb, אשר עשוי או עלול לא פלשו את הזגוגיות. בעקרון, לדפוס schisis כזה יכול להתרחש עם הזרקת מכל מקום בתוך laminations של הרשתית עצבית נאותה, אבל ראינו רק סיבי עצב schisis שכבה עד כה. רביעית, זריקה intravitreal עלול להתרחש גם, אשר שאין לה השפעה על ה-OCT. כל כשלים אלה כתוצאה מוזרים הראשונית של קצה המחט זכוכית, או אולי קצת תנועה קטנה של המחט במהלך זריקה, עקב לחץ ראש המכשיר הזרקת זרם ממותג.
אפיון המיקום של הזרקת Subretinal
גורם קריטי בקביעת יעילות או רעילות של המועמד טיפולים הוא היכולת להשוות ברשתית אזורים שקבלו וקטוריים לעומת אלה שלא. אנו מכוונים מאמצים משמעותיים לתוך פיתוח אמצעים כדי לסמן את האזור של הרשתית מעורב זריקות subretinal כך במהלך בדיקות מעקב, נוכל לזהות את היקף הרשתית בו טיפולים הוחלו, אריאל, ומכאן שם התמרה חושית היה ריאלי. NPs זהב מותר רמה גבוהה של ביטחון בזיהוי אזורים של הרשתית או לא הוזרקו. עם זאת, החלקיקים ספציפי או ניסוח שלהם הופיע כדי להיות רעילים הביא חמור מקומי ניוון הרשתית באתר של הזרקת subretinal על ידי זריקה פוסט 24 שעות (נתונים לא מוצג). לכן, פיתחנו שיטה חלופית של מיפוי ההזרקה ישירות מתוך נתוני הדמיה HR-SD-אוקטובר. שיטה לזיהוי במדויק את הגבולות באתר הזרקת פותחה באמצעות כלי מדידה (מחוגה) בחבילת התוכנה של המכשיר (איור 5). נוכל לזהות קצה bleb בדיוק על ידי בחינת בודדים b-הסריקות (מנחות לרשתית מעולה) נעשה שימוש כדי ליצור את התמונה הפונדוס. בשעת מיקום של caliper בנקודה בו bleb חותך הרשתית המצורפת, המיקום של caliper ממופה באופן אוטומטי אל b-הסריקה המתאימה של התמונה הפונדוס פנים en במיקום מדויק לאורך ציר ה-x שבו היה קליבר דגש על b-הסריקה. חזרה על תהליך זה מאפשר לעקוב אחר קצה bleb על גבי תמונה הפונדוס פנים en . תהליך יישור מחייב כי אזורים דומים של הרשתית נמצאים עם תמונה, כל פעם ביחס עצב הראייה קבוע הראש, ואת התמונות ייתכן שיהיה עליך לסובב כדי ליישר את כלי הדם ברשתית מתמונות מרובות לפני הפרדה בין נתונים. בעקבות תהליך היישור של התמונה הזרקת פוסט והתמונות מעקב עוקבות, באזור ההזרקה נגמרה-גבי הרשת נקודת נתונים כדי לזהות את המיקום של המדידות בתוך אזור מעורב הרשתיות יכול ניתן להתוות נתונים אלה כמפה פני השטח, אשר סיפקה כלי חזותי כדי לזהות את נקודות הנתונים כולל ההזרקה ביחס לאזורים מחוץ ההזרקה.
מיפוי העובי גרת תלת-ממד
לבסוף אנחנו הקלט מדידות את גרת, OSL או אחרים שכבות הרשתית מ ברחבי האזור תמונה שלמה של הרשתית, ואז להתוות נתונים באמצעות מגרש פני השטח (איור 5). Superimposing את מפת הגבול של ההזרקה מאפשר ההפרדה בין שתי סדרות הנתונים, כולל האזור מוזרק, האזור שבו לא היה מנותק בעת תהליך ההזרקה. עוד עיבוד וניתוח נתונים יכול להתבצע ואז על אלה בשתי ערכות נתונים כדי לבדוק את ההשערות כי סוכני טיפולית מסוימת יכול להציל ניוון הרשתית או זירוז רעילות. גישה זו מאפשרת ניסיוני פוטנציאל ושליטה נתונים שנאספו יש עין אחת, השוואת vs מוזרק ללא הזרקת מחוזות אותה העין.
איור 1 : התקן הגנה-SD-OCT. המכשיר HR-SD-אוקטובר בשימוש מוצג. ארון כלי התקשורת (A) מכיל את צג המחשב (), המקלדת, העכבר (b), תיבת ממשק המכשיר (c), המנוע OCT (d), המחשב (e), בהתקן בקרת עבור סופר זורח (אינפרא אדום) דיודות פולטות (f), אל-פסק וספק הכוח (g). הספסל אופטי (B) מכיל את הראש דימות אופטי בדיקה (עבור רשתית העכבר) (h), ורב ציר (ליניארי, המסתובבת) manipulator (אני), ונושא העכבר (j). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : פרוגרסיב ניוון הרשתית החיצונית במודל adRP חלקית humanized כפי שהיא נמדדת HR-SD-אוקטובר (א) בית-SD-אוקטובר תמונות של הרשתית התקבלו עבור המודל adRP (hC1 x BL/6 (J)) בגילאים שונים, הפקד C57BL/6(J) ב- 14 שבועות, ואת הקו homozygous hC1 מוטציה ב- 3 שבועות. הרשתית החיצונית היה מראה נורמלי בגיל 3 שבועות במודל של adRP, אבל היו ראיות דליל גרת מתקדמת, חוסר ארגון- ומעבר בגיל 10 שבועות. בגיל 37 שבועות (hC1 x BL/6(J)) הפגינו נרחב ניוון הרשתית החיצונית. כל הסריקות OCT היו בסביבה של עצב הראייה. (B) העובי גרת (במ מ) לאורך הציר האופקי ציר דרך עצב הראייה סומן לשליטה (בעלי חיים C57BL/6(J)), hC1 ו- adRP של גילאים שונות. היה אובדן הדרגתי של עובי גרת במודל adRP humanized חלקית. גרת הפסד היה גדול מ-60% על ידי גיל 37 שבועות. קווי שגיאה = שגיאת התקן של הממוצע. סולם אדום בר = 200 מיקרומטר ו כל הדימויים הם באותו הסולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מדדים כמותיים של אורך קטע השכבה החיצונית גרעינית ו החיצון באמצעות HR-SD-אוקטובר (א) העכבר קווים המשמשים כדי להדגים אמצעי גרת OSL. נציג OCT תמונות מן 2HRho1T/1T (2 מנות HRho) על רקע נוקאאוט רו העכבר) (החלוניתהימנית ), N129R - x 129R-(אחד מנה האנושי רו על העכבר רו נוקאאוט רקע) (החלוניתהימנית ). (B) מוצגת דוגמה של איך מחוגה הוצבו כדי למדוד את גרת (אדום) ואת OSL (כחול). (ג) הנתונים המתקבלים שלוש חיות של כל שורה עבור עובי גרת סומן בתבנית גרף עמודות מציג השוואה של 2HRho1T/1T קו ו N129R - x 129R-(החלונית הימנית). הקו 2HRho1T/1T יש ~ 8 מיקרומטר גרת עבה יותר. כדי להדגים את השוני OSL, נעשו מדידות מרובות (7) מ b-scan אחד מכל שורה העכבר מ עץ הבוקיצה ויטביע כמו B (קו כחול) בבעלי חיים בן בשבוע-9 (החלוניתהימנית ). זה הוכיח את ההבדל ~ 5 מיקרומטר OSL בין בעלי חיים 1 לעומת 2 עותקים של הגן HRho. גרת והן האמצעים OSL היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית, גרת ערך-p = 1.7e-5 ו- OSL ערך-p = 6.4e-5. קווי שגיאה = שגיאת התקן של הממוצע. סולם אדום בר = 100 מיקרומטר לשניהם הסריקות. b ב- 3A יש באותו הסולם, 3B היא תקריב כדי לשפר את בהירות של השכבות ברשתית וכדי לספק הפגנה איכותי של איך המדידות נרכשו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : סוגים של זריקות תוך-עיני בעכברים המזוהה על-ידי בית-SD-אוקטובר (א). א (hC1xBL/6(J)) העכבר הזריקו ~ 1 µL של נוזל באמצעות הזרקת transchoroidal transcleral Inferonasal. הרשתיות וכתוצאה מכך הוא לראות באזור הירוק התחתון הימני של התמונה פנים en , יצירת גבול חד בחוד החנית של bleb בצד ימין של התמונה. התמונה הפונדוס OCT של אתר הזרקת מוצגים רק ההבדלים הדקים בהתאם המיקום של חלל מלא נוזלים, כי התמונה היא אוסף של כל b הסריקות של כל עובי הרשתית. בנוסף, bleb הזרקת משתנה המרחק של המשטח ברשתית ראש OCT, בהפקת אזור לא ממוקד באתר הזרקת. (B) OCT b-הסריקה של שאינם מוזרק הרשתית הוא הפגין. ONH מסומן. הזרקת subretinal (ג) A הוא הפגין. ONH תווית, ולהראות החצים בתמונה en הפנים (לוחות נכון) הגבול האחורי של הניתוק. הזרקת חיבור (D) A הוכח נקה בעדיפות גבוהה (תזוזה כלפי מעלה) של השכבה RPE (hyper-רעיוני עיקול) של הגבול התחתון של הרשתית (חיצים), אובדן משמעותי של היפר-השתקפות של RPE ושכבות דמית העין למטה מוזרק נוזל. השווה חצים של תמונות (C לעומת D). (E) A schisis ברשתית הוא הפגינו ליד בשכבת סיבי עצב. להתבונן קרום דק מאוד היפר-רעיוני לבצע את הנוזל מוזרק, בעוד השרידים הרשתית מחוברת RPE. בנוסף, ניתן לאבחן את ההבדלים הדקים בין והעלה את שלוש שונים היטל המיסים של תמונות פנים en (C, D, ו- E). הניתוק subretinal יש גבול שקשה לדמיין (חיצים ב- C), בזמן הזריקה חיבור יוצר שפה מעורפלת רפלקטיביים hyper בחוד החנית של bleb, schisis ברשתית הוא ברור על-ידי להבחנה חדה של שלה הקצה המוביל (E). שניהם אדום גודל ברים = מיקרומטר 200 ב-4. בי. כל תמונות 4B דרך 4E ישנו את גודלם באופן שווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מיפוי ושינויים לכימות החיצוני רשתית בעקבות הזרקת Subretinal. שיטה פותחה כדי לזהות אזורים של עניין במהלך הבדיקה מעקב של עכברים שהיו subretinal הזרקת וקטור, עם 3D-התווית של מידות גרת OCT b סריקות מרובות. חיים 2HRho1T/1T הוזרק עם וירוס adeno-הקשורים העצמי-משלימים לבטא GFP והן של ריבוזים האמרהאד המועמד המוביל (hhRz ad6 scAAV-GFP 725) (עין OS) במסך רעילות. Imaged (א) מיד לאחר, במידה אמיתיות של הזריקה מופה על-ידי הצבת מחוגה בחוד החנית של bleb בנקודת איפה הקטעים החיצוניים להפריד RPE b-סריקות (פאנל שמאלי (אדום caliper)). המיקום של הכלי caliper ממופה באופן אוטומטי על התמונה הפונדוס, וזה חוזר על עצמו להדר עבור רבים b סריקות לפי הצורך, אשר תלויים הרזולוציה הרצויה (כל 5th סריקה (A) (לוח נכון)). מחקרים מאוחרים יותר OCT (כל שבועיים) עם תמונה באותו האזור של הרשתית כדי לאפשר superimposition; ONH ואת כלי הדם ברשתית הם ציוני דרך להקל את ההתאמות קרטזי או המסתובבת. האזור כולו של הרשתית נמדדה על עובי גרת בתנאי הגבולות הנדרשים (OPL ואלם) היו גלויים. (B) כדי למפות את אורך גרת על פני מוזרק העמדות caliper (צבע מקודד) שוב ממופה על גבי התמונה הפונדוס, לאגד תמונה מורכבת. כל 5ה b-סריקה מן התמונות OCT נמדדה בעזרת מחוגה מובנה-עד 10 נקודות על פני הרשתית. (ג) קדם ותמונות שלאחר קומפילציה מסובבות, באמצעות תוכנת הדמיה כדי ליישר להערכת ברשתית, אשר מאפשר נקודות נתונים בתוך הרשתית אזור ברשתית מנותקת להיות מזוהה על ידי כיסוי תמונה והפריד. סט (D) הנתונים שמופו לתוך תבנית טבלה, זהה מערך התמונה הפונדוס, חולקו לשתי קבוצות (מידות בתוך את bleb (פסים אדום) ואת אלה שאינן נמצאות). (E) הנתונים מוצג באמצעות 3D שטח ההתוויה תכונה, המאפשר ויזואליזציה של גרת עובי מעל האזור כולו בתמונות. פעולה זו מאפשרת הערכה של הבדלים כמותיים בין אזורים מוזרק והזריק הלא העין. האתר נמצא בחלקה תלת-ממד (E) מספק דרך נוחה כדי לארגן את ערכת הנתונים של מדידות גרת בתוך האזור של הרשתית מנותקת מן האזור נשאר צמוד מיד לאחר ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: תוכנית המשמשים למשוך את המחטים זכוכית- פרמטרים תוכנית להשיג מחטים זכוכית שימושי עבור subretinal על-ידי גישה טרנס-scleral, transchoroidal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-אוקטובר מספק שיטה פשוטה פלואורסנציה פוטנציאליים מודלים חייתיים של מחלות אנושיות כדי לקבוע את התועלת שלהם בבדיקת פוטנציאל הרפוי. היכולת לאפיין במהירות ובאמינות מודל בעלי פוטנציאל של מחלות אנושיות חיוני לתהליך של גילוי תרופות טיפוליות (למשל, ריפוי גנטי חלופי, ריפוי גנטי תמונות ציפורים ריבוזים או shRNA, ריפוי גנטי משולב). HR-SD-אוקטובר מספק שיטה פשוטה, מהירה, לא פולשנית להערכת בריאות הרשתית יכול לשמש כדי לאפיין ולעקוב אחר ההתקדמות של ניוון רשתית במודל עכבר כמעט בכל. הדימויים OCT יכול לשמש כדי להשיג את המידות של כל שכבות שונות של הרשתית, אשר עשויים לספק הערכה מפורטת של ניוון הרשתית החיצונית (קולט אור) לאורך זמן או את ההשפעה של ניסיונות הצלה טיפולית על ניוון או במידה או ציר הזמן קינטי. HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי להעריך את רעילות של וקטור ומסר או חומרים. ההשפעה המשמעותית ביותר על תכנית מחקר ניוון הרשתית קולט אור הוא היכולת לבצע מדידות מעודן של גרת במשך הזמן בבעלי חיים. אחד באפשרותך להתוות ניוון הרשתית ציר זמן כדי לחלץ זמן קבוע, אשר הוא שלב ראשוני חשוב הנחוץ כדי להעריך את יעילות ורעילות של המועמד הרפוי במודלים אותו מעל חלון הטמפורלי של הזדמנות טיפולית. טכנולוגיה זו גם מאפשרת חיסכון משמעותי של המקורות (בעלי חיים וזמן) ביחס היסטולוגיה קצה קלאסית על-ידי מתן החוקר כדי לזהות חריגות במדגם בעלי חיים לפני הזנת מחקר ולהיפטר חיות זה לא בקריטריונים ניסיוני (למשל, מסירה subretinal מוצלחת).
הצורך מסירה מדויקת של מסוימים הרפוי לתוך מרחב subretinal של העין העכבר הוא מאתגר ומספק HR-SD-אוקטובר אישור חזותי מדויק של זריקות subretinal מוצלח כקריטריון עבור הכללה מתמשכת בבעלי תכנון לימודים קליניים. מאמץ נרחב נדרש לעקוב לעתים קרובות חיות מוזרק בלימודי טיפול גנטי לאורך זמן, מאז מודלים אלה לעיתים קרובות לדמות האדם מחלות ניווניות ברשתית שבו המחלה צירי זמן להגיח במשך עשרות שנים. בדיקות מעקב רבים נדרשים כדי לקבוע יעילות טיפולית או כדי לאמוד את רעילות. פתרון אתגר קריטי זה הוא צריך את היכולת לזהות ולהסיר חיות מחקר עיצובים, אשר הם כשלים כירורגי עבור משלוח של וקטור טיפולית. היכולת לספק זריקה מוצלחת עבור טכנאי מיומן עם ניסיון של שנים פנה 90% אם הזרקת עין אחת לכל בעל חיים, כ- 80% הצלחה אם הזרקת בשתי העיניים. עם רמת יעילות זו, הסרה של תכנון המחקר של חיות עם זריקות לא מוצלח הוא יתרון בדיקת השערות. זה לא רק חוסך זמן קריטי אך מאפשרת גם לתוצאות יותר עקבי וצפוי. בנוסף, HR-SD-OCT מאפשר לנו להקטין את מספר בעלי חיים נדרש עבור כל ניסוי אחד על-ידי מתן החיות באותה להיות אחריו לאורך זמן, אשר מפחית את ההשתנות בעלי חיים-אל-חיה בשני ניסויי ולשלוט קבוצות, ומאפשר יותר הערכות סטטיסטיות חזקים של השערות לגבי יעילות ורעילות פוטנציאלי של המועמד הרפוי.
היקף הכיסוי הרשתית על ידי זריקת subretinal הוא בדרך כלל לא 100%, אשר עצמו עשוי להיות רעיל31,32,33,34. לפיכך, היכולת להבחין בין אזורים transduced ו- transduced הינה קריטית בדיקה נאותה של השערות של חילוץ ורעילות מועמדת נתון טיפולית. שימוש יצירתי בכלים תוכנה זמין מאפשר מיפוי מדויק של זריקות subretinal בעיניים העכבר. ההדמיה הקרובה של העין מוזרק מספקת כיוון ומעקב הדמיה לאזורים של עניין, את היכולת להשוות בין אזורים אשר יש כבר transduced לאזורים אשר לא טופלו בתוך העולם אותו. בהתאם מיפוי הדיוק הרצויה, ניתן לבצע תהליך זה עבור כל סריקה-b או מעת לעת דגימה מן ההרכב של b-סריקות שנאספו באופן מיידי כל התמונות הפונדוס פוסט הזרקת והידור לתמונה אחת באמצעות תוכנת גרפיקה אז זה piecewise הגבול רציפה ממופה בזהירות על גבי התמונה הפונדוס. השוואת תמונות מ מיד לאחר הזרקת לתמונות מעקב דורש כי התמונות ליישר כך שלא מדידת עמדות יכול למפות על גבי התמונה הפונדוס של נקודות הנתונים יכול להיות הפרדה ההזרקה ואזורים שאינם המוזרק של הרשתית. המיפוי של ראש עצב הראייה, כלי הדם ברשתית ניתן גם להשיג באמצעות מתודולוגיה זו זהה, אשר מסייע הכיוון של העין כאשר מנסים ליישר תמונות שלאחר ההזרקה עם תמונות עוקבות להמשך טיפול. מידע זה יכול לשמש הדמיה הבאים לזיהוי האזור של הרשתית שבו אירע הזריקה. כמובן, כאשר בעלי החיים מורדמים, המיקום של ביטוי EGFP, נמסר על ידי וקטור AAV מכיל גם המועמד גנים טיפוליים (למשל, ריבוזים), יכול לשמש גם כדי להשוות את המיקום של התמרה חושית עם האזור נקבע על ידי מיפוי תמונות המסתמך על המיקום של כלי הדם. זה יאפשר זיהוי דיפוזיה של וקטור במרחב subretinal סגור לאחר מכן מעבר אזורים של ניתוק אנטומיים.
ההצלחה שלנו עם השימוש של זהב NPs לתייג את bleb subretinal היה מוגבל בשל רעילות הנגרמת על ידי החומרים אשר השתמשו בהם. אנו ממליצים חקירה נוספת של חומרים כאלה לתייג את מידת subretinal מגדלים פורחים, אם תכשירים חלופיים (שונים, מידות, שינויים משטח) ניתן למצוא את זה אל תגרום / רעילות.
HR-SD-OCT מספק כמות עצומה של מידע באופן משמעותי פחות זמן ומשאבים, יכול להיות quantitated כדי לספק מידע נוסף אודות יעילות ורעילות של פוטנציאל הרפוי לעומת שיטות מסורתיות כמו כפפות. השימוש בטכנולוגיה זו מאפשרת החוקר להקל על אחד ביצועיהן חמור של גילוי סמים ברשתית פרה35. העכבר RIS על HR-SD-אוקטובר הם כלים רבי-עוצמה לסיוע לימודי טיפול גנטי ברשתית פרה כמרכיב של תוכנית גילוי תרופות RNA שלנו. כלים אלה ניתן להחיל באופן כללי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יחסים מסחריים: MCB: כלום; JMS: אף אחד. רשתית הדמיה מערכת (RIS)23 השתמשו במחקר זה הוא מכשיר הרומן של שימוש משמעותי לקבוצה כלשהי המבקשים לבצע מחקרים משלוח של טיפול גנטי עכברים, מכרסמים או חיות קטנות. בעוד המחברים אין התנגשויות להכריז לגבי המכשיר הזה בשלב זה, אוניברסיטת ב באפלו - SUNY וניהול ותיקי יש זכויות הקניין הרוחני ומחפשים עשויים למסחר המכשיר הזה בעתיד.
Acknowledgments
חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת, בחלקו, על-ידי המחלקה של ותיקי פרשיות (וי אי), בריאות למינהלה, Office של מחקר ופיתוח (מחקר מעבדה ביו ופיתוח) (מענק הצטיינות VA 1I01BX000669). JMS מועסק, בחלקו, כמו צוות רופא-מדען, רפואת עיניים, על-ידי VA יורד; MCB הוא מועסק, בין השאר, על ידי VA יורד. המחקר שנערך, והוא נתמך בחלקה על ידי, ותיקי המינהל ווסטרן ניו יורק בריאות המערכת (באפלו, ניו יורק). תוכן אינם מייצגים את נופי המחלקה לענייני חיילים משוחררים או ממשלת ארצות הברית. גם נתמך, בחלק גדול, על-ידי NIH/NEI R01 הענק EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 להעניק EY016662 (UB חזון תשתית מרכז, PI: מ' שחיטה, מנהלת מודול ביו-פוטוניקה: JMS), גרנט בלתי מוגבלת כדי המחלקה של רפואת עיניים/אוניברסיטת ב תאו מן המחקר כדי למנוע עיוורון (ניו יורק), ומענק של הקרן Oishei (באפלו, ניו יורק). אנו להכיר את המתנה של הקוP347S hC1 רוהטרנסגניים והעכבר אקסון 1 נוקאאוט רו מ ד ר לם ג'ניס (המרכז הרפואי טאפטס ניו אינגלנד, בוסטון) ולאחר המתנה של המודל transgene NHR-E במדינה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים על העכבר אקסון 2 רו נוקאאוט רקע של ד"ר ג. ג'יין פאראר ו פיטר המפריז (בטריניטי קולג ', דבלין, חמתו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
