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Ultrahigh संकल्प माउस ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी रेटिना जीन थेरेपी अनुसंधान में Intraocular इंजेक्शन सहायता करने के लिए

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/55894
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4,5,6,7
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

Summary

यहां हम उच्च संकल्प वर्णक्रमीय-डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (मानव संसाधन एसडी अक्टूबर) का उपयोग करने के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण प्रदर्शित करने के लिए रेटिना अंतरिक्ष में जीन थेरेपी एजेंटों के वितरण की सहायता, अपने आरईएल कवरेज का आकलन है, और photoreceptor जीवन शक्ति की विशेषता ।

Abstract

HR-SD-OCT के लिए लाइव माउस मॉडल में photoreceptor अध की प्रगति की निगरानी करने के लिए उपयोग किया जाता है, चिकित्सीय एजेंटों के प्रसव के रेटिना अंतरिक्ष में मूल्यांकन, और vivo मेंविषाक्तता और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए. HR-SD-OCT अवरक्त प्रकाश (800-880 एनएम) के पास का उपयोग करता है और प्रकाशिकी विशेष रूप से उप के साथ माउस आंख के अद्वितीय प्रकाशिकी के लिए डिजाइन-2-माइक्रोन अक्षीय संकल्प । बाहरी रेटिना के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (photoreceptor) अध कि पतन और नियंत्रण रोग प्रगति का आकलन करने के लिए छवि थे. निकाला ग्लास microneedles ट्रांस scleral और ट्रांस-धमनियां दृष्टिकोण के माध्यम से adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) या नैनोकणों (एनपी) के उप रेटिना इंजेक्शन देने के लिए इस्तेमाल किया गया था । उपरेटिना अंतरिक्ष में सुई की सावधान स्थिति एक नपे दबाव इंजेक्शन, जो उप रेटिना अंतरिक्ष में तरल पदार्थ उद्धार करने से पहले की आवश्यकता थी । रीयल टाइम उपरेटिना सर्जरी हमारे रेटिना इमेजिंग सिस्टम (RIS) पर आयोजित किया गया था । मानव संसाधन-एसडी OCT एक विषाक्त उत्परिवर्ती मानव उत्परिवर्ती rhodopsin (P347S) (RHOP347S) चूहों में transgene की अभिव्यक्ति के कारण प्रगतिशील वर्दी रेटिना अध कि उत्पादन का प्रदर्शन किया । HR-SD-OCT सभी रेटिना परतों के कठोर ठहराव की अनुमति देता है । बाहरी परमाणु परत (केव) मोटाई और photoreceptor बाहरी खंड लंबाई (OSL) माप photoreceptor जीवन शक्ति, अध कि, या बचाव के साथ सहसंबंधी बनाना । RIS वितरण प्रणाली नवजात (~ P10-14) या वयस्क चूहों में रेटिना इंजेक्शन के वास्तविक समय दृश्य की अनुमति देता है, और HR-SD-OCT तुरंत आरईएल हद तक वितरण और नक्शे की सफलता निर्धारित करता है । HR-SD-OCT, vivo मेंphotoreceptors की जीवन शक्ति को मापने के अलावा चूहों में रेटिना सर्जरी की सफलता का मूल्यांकन कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली उपकरण है । मानव संसाधन-एसडी OCT भी वर्दी पशु साथियों की पहचान करने के लिए रेटिना अध-पतन, विषाक्तता की हद का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और नैदानिक जीन थेरेपी अनुसंधान अध्ययन में चिकित्सीय बचाव ।

Introduction

शोधकर्ताओं ने मानव रोग के लिए उपचार में उपंयास चिकित्सकीय अनुवाद की उंमीद के साथ रेटिना और रेटिना अपक्षयी रोगों की एक किस्म के लिए जीन उपचार विकसित कर रहे है1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. समय डोमेन या वर्णक्रमीय डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT) रोग के विशिष्ट माउस मॉडलों में बाहरी रेटिना अध-पतन के पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है12,13,14 . HR-SD-OCT नहीं है, तथापि, बड़े पैमाने पर माउस मॉडल के मूल्यांकन के अनुकूलन के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया दर और रेटिना अध... के स्थानिक एकरूपता का निर्धारण, उदाहरण के लिए, या जीन आधारित चिकित्सीय परीक्षण के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के संदर्भ में, बचाव, विषाक्तता, या वेक्टर डिलीवरी8,15,16की स्थानिक सीमा का आकलन करें । एक बार एक माउस मॉडल पूरी तरह से विशेषता है, HR-SD-OCT डेटा एक जानकारीपूर्ण और विश्वसनीय संसाधन चिकित्सकीय के प्रभाव को मापने के लिए रेटिना अध: पतन17के माउस मॉडल में बचाव या विषाक्तता लागू करने के लिए के रूप में सेवा कर सकते हैं । कई समूहों transducing photoreceptors और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं में अपनी दक्षता के कारण वेक्टर डिलीवरी की एक विधि के रूप में रेटिना इंजेक्शन का उपयोग कर रहे हैं. हालांकि, यह मास्टर करने के लिए एक कठिन विधि बनी हुई है, यह देखते हुए कि यह आम तौर पर corneal सतह से मुक्त हाथ सर्जरी द्वारा किया जाता है, और अक्सर मोतियाबिंद, खून बह रहा है, और अवांछित रेटिना टुकड़ी के पीछे के हेरफेर से होने वाली बस से भरा है अवलेह. कई समूहों अभी भी आंख बंद करके रेटिना इंजेक्शन का प्रयास और अपेक्षाकृत बड़े व्यास स्टेनलेस स्टील सुई (34G)8,17,18,19 के साथ मैनुअल इंजेक्शन का उपयोग वायरस उद्धार ,20,21,22, और कुछ का उपयोग करता है ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) इमेजिंग करने के लिए सदिश के उचित वितरण की पुष्टि करने के लिए रेटिना8,17, 20 , 22. विधि में कुछ सुधार हाल ही में एक micromanipulator22द्वारा संचालित अतिसूक्ष्म सुई का उपयोग करके वर्णित किया गया है ।

हम एक एकीकृत दृष्टिकोण जो सुई की स्थिति में एड्स मौजूद है, और इंजेक्शन एक कस्टम निर्देशित स्टीरियो ophthalmoscope प्रयोगशाला में विशेष रूप से माउस17के छोटे आंख के अंदर visualizing के लिए डिजाइन द्वारा सुविधा है, 23. stereotaxic micromanipulator के साथ संयोजन के रूप में खींचा ग्लास माइक्रो सुइयों का उपयोग करने से पहले कोई शल्य कटौती की आवश्यकता (यानी, conjunctivae और संयोजी ऊतक के माध्यम से) के साथ सुई प्लेसमेंट के बेहतर नियंत्रण प्रदान इंजेक्शन. दबाव विनियमित माइक्रो इंजेक्टर के उपयोग के अनुरूप इंजेक्शन मात्रा देने में मदद करता है, और इंजेक्शन बहुत अधिक स्थिरता, परिशुद्धता के साथ किया जा सकता है, और बहुत धीमी मैनुअल इंजेक्शन से एक हाथ से प्रदर्शन किया-सिरिंज आयोजित, जिससे कम आंख में बुलबुला इंजेक्शन की घटना । छोटे सुई मदद करता है रिसाव को रोकने के बाद सुई वापसी क्योंकि रास्ता स्वयं को सील है । इंजेक्शन/प्रसव की सीमा का आकलन करने के लिए, कई खोजी समूहों को खोजने और रेटिना में बढ़ाया ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EGFP) अभिव्यक्ति की आरईएल सीमा का आकलन करने पर भरोसा (अभिव्यक्ति वेक्टर द्वारा दिया निर्माण) प्रयोगात्मक अंत में बिंदु (इच्छामृत्यु) सफल इंजेक्शन की पुष्टि करने के लिए11,19,20,24. इस दृष्टिकोण (अक्टूबर का उपयोग नहीं) शल्य सफलता की पुष्टि करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया समय और पशुओं में संसाधनों का एक विशाल राशि बर्बाद, (अज्ञात) शल्य विफलताओं के साथ सभी जानवरों के बाद से बनाए रखने की जरूरत है, दोहराए उपायों के बाद जब तक इच्छामृत्यु और नेत्र फसल (जब EGFP मापा जाता है) । रेटिना में इंजेक्शन के स्थान की पुष्टि करने के लिए मानव संसाधन-एसडी-अक्टूबर का उपयोग कर सुधार किया जा सकता है कि इंजेक्शन रेटिना की सही परतों के बीच स्थित है (यानी रेटिना स्थान). HR-SD-OCT भी तुरंत चित्रित असफल प्रयास (शल्य विफलताओं) के लिए वास्तविक शल्य चिकित्सा समय में प्रासंगिक चर की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दृष्टिकोण पर सुधार होगा । हमने पाया है कि मानव संसाधन-एसडी अक्टूबर बाहरी रेटिना अध-पतन के तेजी से मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति द्वारा नैदानिक जीन थेरेपी अध्ययन में कई लाभ प्रदान करता है, की अनुमति/अध्ययन जानवरों जो प्रयोगात्मक मानदंडों को पूरा नहीं करते की पहचान/मुर्गियों ( उदाहरण के लिए, गलत उप रेटिना इंजेक्शन), और प्रत्यक्ष अनुवर्ती इमेजिंग करने के लिए आंख के क्षेत्र के लिए जहां वेक्टर दिया गया था (जहां एक प्रकार का नैदानिक प्रभाव सबसे अधिक होने की संभावना है) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण क्षेत्रों जहां वेक्टर वितरित नहीं किया गया । इसके विकास के बाद से, एसडी अक्टूबर के उपयोग के लिए स्वीकार किए जाते है और नेत्र विज्ञान शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल जारी रखा है और अब माउस या कुतर मॉडल13,25में रेटिना वैज्ञानिक अध्ययन में रेटिना इमेजिंग के मानक माना जाता है । मानव संसाधन-एसडी अक्टूबर और इसके सॉफ्टवेयर क्षमताओं अद्वितीय एकीकृत तरीके में माउस मॉडल में सफल मात्रात्मक जीन थेरेपी के लक्ष्य को आगे की प्रक्रिया में हर कदम, पशु मॉडल चयन सहित, चुना में अध कि पतन के लक्षण वर्णन में उपयोग किया गया रोग मॉडल, चिकित्सकीय वितरण, वेक्टर वितरण के मानचित्रण, और विषाक्तता/ HR-SD-OCT का उपयोग प्रक्रिया के हर स्तर पर अधिक कुशल दवा खोज के लिए अनुमति देता है । यहां हम इन दृष्टिकोण है कि हमारी आरएनए दवा डिस्कवरी कार्यक्रम में उपयोग किया जाता है का वर्णन ।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और VA WNY HCS और भैंस पर विश्वविद्यालय के उपयोग समितियों-SUNY द्वारा अनुमोदित किया गया । पशु दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) और हेलसिंकी की घोषणा में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के शर्तों के अनुसार इस्तेमाल किया गया ।

1. माउस मॉडल

  1. नियंत्रण सहित मूल्यांकित किए जाने वाले माउस मॉडलों को पहचानें ।
    नोट: इमेजिंग C57BL/6 (J), hC1/hC1//mWT/mWT के लिए एक आंशिक रूप से मानवतावादी माउस रेटिना अध-पतन मॉडल मानव उत्परिवर्ती homozygous RHO P347S hC1 वंय-प्रकार पर (alleles) माउस WTके लिए किया गया था +/ RHO26 , 27, hC1 x बीएल/6 (जे), उत्परिवर्ती मानव RHOP347S hC1 एलील की एक प्रति के साथ एक आंशिक रूप से मानवतावादी मॉडल पर WT माउस RHO+/+ जीनोटाइप (hC1/-//mWT/mWT) (पार करके प्राप्त hC1/hC1//mWT/mWT के साथ C57BL 6/ J) चूहों). उपरोक्त autosomal प्रमुख रेटनाइटिस pigmentosa (adRP) मॉडल C57BL/6 (जे) पृष्ठभूमि पर हैं । एक माउस मॉडल जो कि मानव WT की दो प्रतियों के लिए homozygous है RHO जीन पर माउस RHO पीटकर पृष्ठभूमि का प्रयोग भी28,29को किया गया था । यह लाइन 129Sv बैकग्राउंड पर है । जब इस लाइन 129Sv पृष्ठभूमि पर एक माउस RHO नॉकआउट के साथ पार किया गया था, मानव RHO की एक खुराक माउस RHO पृष्ठभूमि पर होता है ।
  2. प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए प्रासंगिक शर्तों के बाद जानवरों को बनाए रखने ।
    नोट: पशु चिकित्सा मेडिकल यूनिट (VMU) में VA WNY HCS में बनाए रखा गया था । चूहों मानक लैब चाउ खिलाया और 12 h:12 एच प्रकाश के तहत हो रहे थे: लगभग ७२ ˚ एफ में पिंजरे के स्तर पर करीब ३०० लक्स के साथ नरम फ्लोरोसेंट उपरि सफेद रोशनी के साथ अंधेरे चक्र

2. माउस नेत्र जेल

  1. रेटिना इमेजिंग30 और सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल ऑप्टिकल जेल तैयार करें ।
  2. गठबंधन 2 मिलीग्राम/एमएल डब्ल्यू/वी उच्च आणविक वजन (4 x 106 g/मोल carbomer बाँझ 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) ।
  3. जेल एक चिपचिपा ऑप्टिकली पारदर्शी जेल रूपों जब तक कमरे के तापमान पर मिश्रण ।
  4. छोटे बाँझ बोतलों में जेल स्थानांतरण और फंस हवा बुलबुले को दूर करने के लिए ३५० x g पर एक झूलते बाल्टी तालिका में ऊपर के केंद्रापसारक में केंद्रापसारक ।
  5. माउस कॉर्निया और एक प्रीमियम कवर ग्लास (18 मिमी x 18 मिमी) के बीच एक इंटरफेस बनाने के लिए सीधे कॉर्निया के लिए जेल लागू होते हैं ।

3. HR-SD-OCT इमेजिंग

  1. एचआर-एसडी-OCT डिवाइस (चित्रा 1) देखें ।
  2. संवेदनाहारी की उचित खुराक निर्धारित करने के लिए पशु तौलना. इसके बाद anesthetize के 25 µ एल/जी का उपयोग कर के शरीर के वजन के २.५% के समाधान के बफर 2, 2, 2-tribromoethyl शराब (Avertin) intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से समाधान और आंख बूंदें जोड़ने के बाद विद्यार्थियों को फैली पशु मैटीरियल है ।
  3. पशु पूरी तरह से एक पैर की अंगुली चुटकी द्वारा anesthetized है कि पुष्टि करें, और कुछ जानवर प्रतिक्रिया नहीं करता है ।
  4. मूंछ छांटो और मानव संसाधन-एसडी OCT स्लेज पर माउस जगह है ।
  5. सीधे बुद्धि लेंस के सामने माउस की आंख की स्थिति और कॉर्निया और आईरिस स्थित है जब तक मंच नियंत्रण में हेरफेर । कृत्रिम आँसू लगाने से हाइड्रेटेड कॉर्निया रखो ।
    नोट: एचआर-एसडी-अक्टूबर स्लेज पर ठीक समायोजन micromanipulators माउस की स्थिति के लिए उपयोग किया जाता है कि इस तरह के शिष्य एपर्चर केंद्रित और उन्मुख है । ऑप्टिकल बुद्धि तब तक उंनत है रेटिना दिखाई हो जाता है और पशु आगे के लिए सबसे अच्छा संभव छवि प्राप्त करने के लिए समायोजित है ।
  6. सबसे पहले, सॉफ्टवेयर प्रोग्राम "माउस" को खोलने और "रोगी परीक्षा" पर क्लिक करें । दूसरा, क्लिक करें "रोगी जोड़ें" और उचित जानकारी दर्ज करने के लिए नए रोगी विंडो में पशु की पहचान और "सहेजें और बाहर निकलें" । तीसरे, क्लिक करें "परीक्षा जोड़ें" के बाद "परीक्षा शुरू" । चौथा, क्लिक करें "कस्टम स्कैन जोड़ें" और चुनें "आयताकार मात्रा", छवि जा रहा है के लिए आयुध डिपो या ओएस चुनें, तो क्लिक करें "परीक्षा जोड़ें" । अंत में, उपकरण लक्ष्य और स्थिति पशु हित के क्षेत्र प्राप्त करने के लिए शुरू करते हैं । सही क्षेत्र खोजने के बाद, आँख सतह से किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने एक बाँझ कपास का उपयोग कर applicator इत्तला दे दी बस छवि अधिग्रहण करने से पहले के क्रम में आगे छवि गुणवत्ता बढ़ाने के लिए, तो क्लिक करें "शुरू स्नैपशॉट", और अगर एक अच्छी छवि प्राप्त की है, क्लिक करें "सहेजें स्कैन करें "।
    नोट: आयताकार HR-SD-OCT छवियों के लिए विशिष्ट पैरामीटर ९०० a-स्कैन/b-स्कैन और ९० b-स्कैन/छवि । अधिग्रहीत छवियों १.४ मिमी x १.४ मिमी हैं । रेटिना का क्षेत्र चित्र विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करता है, लेकिन सबसे छवियों ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ONH) पर केंद्रित कर रहे हैं ।

4. उपस्थिति, दर, और मॉडल बाहरी रेटिना अध की एकरूपता का आकलन

  1. बाहरी रेटिना अध! HR-SD-OCT द्वारा मॉडल मूल्यांकन
    1. उपस्थिति, दर, और बाहरी रेटिना अध की एकरूपता का आकलन करने के लिए दोनों नियंत्रण और प्रयोगात्मक विषयों के लिए उम्र की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ जानवरों को प्राप्त करें ।
    2. दोनों साथियों (रोग और सामान्य) से प्रत्येक उम्र में कई जानवरों पर HR-SD-OCT इमेजिंग प्रदर्शन । OCT छवियां प्राप्त करने के लिए 3.1.6 में वर्णित विधि का उपयोग करें ।
      नोट: डेटा सभी एक ही बार में पशुओं के एक बड़े पलटन से एकत्र किया जा सकता है, जो वितरित किया है जन्मदिन समय की एक विस्तृत अवधि में फैले (1 वर्ष), या पशु के एक छोटे से पलटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता समय की एक लंबी अवधि में कई छवियों को इकट्ठा करने के लिए (1 वर्ष) इसी तरह के परिणाम
    3. एक रिकॉर्डेड HR-SD-OCT आयताकार वॉल्यूम इमेज खोलें, और पहले बी-स्कैन को मापा जाए (आदर्श रूप से ONH या अन्य पहचाने जाने योग्य ऐतिहासिक) छवियों के पहनावे से शामिल होने की पहचान करें । छवि विस्तार सॉफ्टवेयर में ज़ूम सुविधा का उपयोग कर स्क्रीन को भरने के लिए ।
    4. b-स्कैन की छवि पर राइट क्लिक करके कैलिपर्स की इच्छित संख्या खोलें और फिर "कैलिपर्स" पर क्लिक करके और अंत में वांछित के रूप में कई कैलिपर्स पर क्लिक करके (वे 1 से 10 के माध्यम से गिने जाते हैं). सुनिश्चित करें कि कैलिपर्स छवि के निचले दाएँ कोने में दिखाई दे. "कॉन्फ़िगर कैलिपर" सुविधा का उपयोग करना, उन्हें सभी कोण ब्लॉक कॉलम में "ऊर्ध्वाधर" के रूप में आवंटित और रेटिना भर में वर्दी प्लेसमेंट की सुविधा के लिए "प्रदर्शन कैलिपर स्थान" पर बारी और अंत में, लागू करेंक्लिक करें ।
      नोट: 1सेंट कैलिपर छवि के बाईं ओर पर रखा जाना चाहिए जब oculus (OD) दाहिनी आंख और 1सेंट कैलिपर प्रसंस्करण छवि के दाईं ओर रखा जाना चाहिए जब oculus भयावह (ओएस) आंख चित्र छोड़ दिया प्रसंस्करण । दोनों छोड़ दिया और सही आंखें जब साजिश रचने के लिए सभी डेटा के लौकिक अभिविंयास के लिए एक नाक में यह परिणाम है ।
    5. कंप्यूटर माउस का उपयोग करना, प्रत्येक कैलिपर को इच्छित स्थान पर ले जाएं (२.० mm के अलावा) बी-स्कैन में, ऑप्टिक तंत्रिका सिर के केंद्र में एक कैलिपर जगह यकीन किया जा रहा है, बी में छवियों है कि यह शामिल स्कैन (शूंय के लिए इस कैलिपर सेट) । फिर क्लिक करने के लिए माउस का उपयोग करें और कैलिपर लंबाई के लिए खींचें करने के लिए ब्याज के क्षेत्र अवधि । मनमाने ढंग से सेट कैलिपर्स कि बी के औसत दर्जे क्षेत्रों ओवरले नहीं अधिकतम लंबाई के लिए स्कैन, और डेटा विश्लेषण के दौरान उपेक्षा ।
    6. बाहरी कैलिपर परत (plexiform) के तल पर बाह्य सीमित झिल्ली (एल्म) और OPL के नीचे स्थित कैलिपर के ऊपर रखकर, कैलिपर टूल्स का उपयोग करके केव मोटाई को मापने । ०.२ mm वेतन वृद्धि पर रेटिना में प्रत्येक कैलिपर के लिए यह दोहराएं । माप को बचाओ ।
    7. के बाद सभी कैलिपर्स रखा गया है और आकार के लिए समायोजित, छवि पर दायां क्लिक करें और क्लिक करें "सहेजें कैलिपर डेटा" ।
    8. बाद में बी स्कैन पर माप दोहराएँ (हर 10वें स्कैन अच्छी तरह से काम करता है) एक ही आयताकार मात्रा OCT से अवर से पूरे रेटिना में फैले छवि बेहतर क्षेत्रों के लिए. कैलिपर्स और X-अक्ष में एक ही स्थान पर खुला रहना चाहिए । उन्हें एक्स-दिशा में ले जाने के बिना कैलिपर्स की लंबाई समायोजित करें ।
    9. संसाधित b-स्कैन छवि के आगे छोटे फ़ाइल चिह्न पर क्लिक करके डेटा सहेजें फ़ाइलें खोलें और "डेटा पर जाएं" क्लिक करें । क्लिक करें "दिनांक संशोधित फ़ाइलों को समय पर आधारित क्रम में व्यवस्थित करने के लिए सहेजा गया, और प्रत्येक b-स्कैन मापा के लिए सभी फ़ाइलें खोलें ।
    10. प्रत्येक बी से रॉ डेटा संकलित-एक एकल फाइल में स्कैन क्रम में सबसे कम से उच्चतम फ्रेम संख्या के आधार पर । "कैलिपर नाम", "लंबाई", और "Center X" सहित डेटा के स्तंभों का चयन करें.
    11. यह सुनिश्चित करें कि केंद्र एक्स सभी बी के लिए एक ही है स्कैन प्रत्येक आयताकार मात्रा OCT संसाधित छवि के लिए मापा । कैलिपर्स कि माप रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया से किसी भी डेटा को हटाएँ, और शून्य करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर के केंद्र पर स्थित कैलिपर सेट.
    12. प्लॉट के लिए डेटा एक्स बनाम एकाधिक Y डेटा सेट करने के लिए एक 3 डी भूखंड समारोह पाने के लिए केव या एक अंय मापा रेटिना परत की कुल मोटाई प्लॉट ।
    13. दर और किसी भी संभावित रेटिना अध की एकरूपता का निर्धारण करने के लिए इसी उम्र के साथ नियंत्रण और प्रयोगात्मक जानवरों के बीच केव माप की तुलना करें.
    14. एक ही बी स्कैन छवियों का उपयोग OSL माप के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ. एल्म और Bruch की झिल्ली (बीएम) के बीच कैलिपर्स रखने के अलावा, केव को मापने के लिए इस्तेमाल किया उसी पद्धति का पालन करें ।
      नोट: कैसे कैलिपर जगह के लिए एक उदाहरण के प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है (चित्रा 3बी) । यह त्रुटि कम करने के लिए छवि में ज़ूम पर किया जाना चाहिए ।
    15. प्रयोगात्मक और नियंत्रण साथियों दोनों के लिए प्रत्येक जन्मदिन के लिए कई जानवरों के लिए डेटा विश्लेषण दोहराएँ.
  2. केव या OSL मोटाई सॉफ्टवेयर कैलिपर्स उपकरण का उपयोग कर के व्यापक माप और 3 डी मानचित्रण
    1. समीक्षा पोस्ट इंजेक्शन अक्टूबर छवियों और किसी भी पहचान स्थलों के नोट बनाने के लिए, रेटिना में ONH या रक्त वाहिकाओं की तरह । फिर एक ही क्षेत्र से एक अनुवर्ती एसडी-OCT प्राप्त करने के लिए माउस की स्थिति है, और एक ही पहचाने स्थलों को शामिल करने के लिए सुनिश्चित हो ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि रेटिना के क्षेत्र छवि और रेटिना टुकड़ी में शामिल पोस्ट इंजेक्शन एसडी-OCT छवियों में पहचाना जाता है । एक आयताकार वॉल्यूम एसडी-OCT छवि रिकॉर्ड और इसे बचाने के लिए ।
    2. 4.1.3. to 4.1.14 चरणों में ऊपर वर्णित के रूप में दर्ज छवियों को संसाधित करें । ऊपर बताए गए अनुसार कैलिपर डेटा और प्लॉट सहेजें ।
      नोट: केव माप के परिणामस्वरूप सरणी केव मोटाई का चित्रण एक 3d साजिश बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । x-अक्ष के साथ कैलिपर्स की स्थिति एक को मूल (0) के साथ x-अक्ष पर ऑप्टिक तंत्रिका रखने के ग्राफ को पुनर्प्लॉट करने की अनुमति देते हैं । y-अक्ष बी का उपयोग करने की योजना बनाई है-स्कैन संख्या और ऑप्टिक तंत्रिका तो प्रारंभिक बिंदु है, जो एक को ठीक से Y-अक्ष पर मूल पर ऑप्टिक तंत्रिका की स्थिति को परिभाषित किया जाता है । प्रत्येक डेटा सेट में ऑप्टिक तंत्रिका की पहचान का पालन छवियों को मज़बूती से गठबंधन किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
  3. fundus छवि पर इंजेक्शन साइट की हद तक मानचित्रण
    1. प्रदर्शन पोस्ट इंजेक्शन आयताकार खंड इंजेक्शन की सफलता की पुष्टि करने के लिए OCT । ३.६ में वर्णित विधि का पालन करें ।
    2. सॉफ्टवेयर में कैलिपर सुविधा का प्रयोग करें बी के एक नंबर से अलग रेटिना की सीमा पर मोड़ बिंदु की पहचान करने के लिए पूरी OCT छवि फैले स्कैन । 4.1.4 में वर्णित कैलिपर्स खोलने के लिए विधि का उपयोग करें ।
    3. fundus छवियों अक्टूबर बी स्कैन और fundus छवि है, जो इसके स्थान के लिए संगत पर इसी कैलिपर स्थिति के मैप किए गए स्थान के साथ रिकॉर्ड करें ।
    4. fundus छवियों के सभी कैलिपर पदों, जो इंजेक्शन साइट के fundus छवि (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग, चित्रा 5एमें उदाहरण) पर एक सटीक नक्शा में परिणाम सहित एक समग्र छवि में संकलित करें ।

5. Intraocular इंजेक्शन

नोट: RIS के उपयोग पर विवरण और हाल ही में एक अध्ययन23में सविस्तार हैं ।

  1. ग्लास इंजेक्शन सुई की तैयारी
    1. आटोक्लेव छोटे बैचों में रेशा के साथ केशिका ट्यूबों, शुष्क चक्र का उपयोग कर ।
    2. एक पिपेट खींचने का प्रयोग करें और सेट अप एक प्रोग्राम है कि तेज कोण के साथ एक गिलास टिप का उत्पादन होगा, और 2-5 µm की सीमा में एक व्यास ।
      नोट: एक नमूना 5 कदम कार्यक्रम है जो हमारे पिपेट खींचने पर प्रभावी सुइयों का उत्पादन 1 तालिकामें दिखाया गया है ।
    3. कमरे के तापमान पर एक बाँझ पिपेट सुई जार में खींच लिया गिलास सुई की दुकान.
  2. इंजेक्शन के लिए वांछित समाधान के साथ इंजेक्शन सुई भरें
    1. सुई धारक में सुई माउंट, लगभग 5/8 जा रहा है "धारक के अंत से परे फैलाने ।
      नोट: एक दूरी से कम 5/8 "यह मुश्किल इंजेक्शन समाधान तक पहुंचने के लिए सुई को भरने, क्योंकि सुई धारक ०.२ मिलीलीटर ट्यूबों के उद्घाटन में आसानी से फिट नहीं कर देगा । इसके अलावा, सुई होने से अधिक 5/8 "काफी बड़ा दोलन या टिप के हिमायत में परिणाम, वास्तविक समय इमेजिंग मुश्किल बनाने के बाद से टिप फोकल विमान या देखने के क्षेत्र (FOV) छोड़ देता है, जबकि आंख पंचर करने का प्रयास.
    2. एक बाँझ ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में इंजेक्शन समाधान तैयार करें । 1 मिलीग्राम/एमएल में fluorescein की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन समाधान करने के लिए बाँझ fluorescein सल्फेट (10 मिलीग्राम/एमएल 1x में) की एक 1:10 कमजोर पड़ने जोड़ें ।
      नोट: सटीक डाई का इस्तेमाल किया उपयोगकर्ता के लिए विशिष्ट है और कुछ भी हो सकता है कि गैर विषैले और सफेद प्रकाश रोशनी के तहत नग्न आंखों के लिए दृश्यमान करने में मदद RPE और रेटिना अंतरिक्ष के स्तर पर सुई टिप की सटीक स्थान की सुविधा ।
    3. यह सुई भरने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इंजेक्शन समाधान युक्त ट्यूब के केंद्र के साथ गठबंधन किया है ताकि सुई की स्थिति के लिए 3 अक्ष micromanipulator के नियंत्रण knobs का उपयोग करते हुए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के माध्यम से सुई कल्पना.
    4. सुई की नोक द्रव में जलमग्न है जब तक ध्यान से ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में सुई टिप ड्राइव । इंजेक्शन द्रव (उदाहरण के लिए 1 µ एल) की वांछित मात्रा एक इंजेक्शन के लिए आवश्यक सुई में ड्रा । बर्फ में रखा ट्यूब में शेष समाधान बनाए रखें ।
  3. इंजेक्शन के लिए पशु तैयार करना
    नोट:     RIS माइक्रोस्कोप साफ़ रखा जाता है, और एक गैर-संपर्क सिस्टम है । हीटिंग प्लेट एक साफ adsorbent पैड के साथ कवर किया जाता है और सुई खींच लिया जा रहा से पहले autoclaved हैं । के बाद वे एक स्व द्वारा खींच रहे है गर्म धातु पट्टी निष्फल, वे एक बंद निष्फल को खींच लिया गिलास सुई पकड़ कक्ष में रखा जाता है । सुई केवल दस्ताने हाथों का उपयोग कर संभाला रहे हैं, और देखभाल के लिए सुई की नोक को छूने को रोकने जबकि यह धारक में बढ़ते प्रयोग किया जाता है । इंजेक्शन समाधान बाँझ तकनीक का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं, और पौंड आगर प्लेटों पर वायरस की तैयारी का एक नमूना लकीर और उन्हें ३७ ˚ सी पर रात में मशीनिंग द्वारा संदूषण के लिए परीक्षण कर रहे हैं
    1. पशु (जी) संवेदनाहारी एनाल्जेसिक के उचित खुराक का निर्धारण करने के लिए वजन ।
    2. intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से संवेदनाहारी (buffered 2, 2, 2-tribromoethyl शराब (Avertin)) के २.५% समाधान प्रशासन ।
    3. तुरंत कोलीनधर्मरोधी दवाओं (जैसे, cyclopentylate) लागू करने के लिए दोनों आंखों के विद्यार्थियों को फैली हुई है ।
    4. जानवर की मूंछों और कान पंच या अन्य विधि का उपयोग पशु संख्या ट्रिम कर दीजिए ।
    5. आंख और आसपास के क्षेत्र को पतला betadine से धोएं ।
      नोट: नाक के आसपास किसी भी समाधान हो रही से बचें, क्योंकि यह अनैच्छिक डूब में परिणाम कर सकते हैं ।
    6. हीटिंग पैड पर माउस प्लेस, ३९ ˚ सी पर बनाए रखा, पूर्व में मोल्ड मॉडलर क्ले माउस धारक आंख के साथ सुई की ओर इंजेक्ट किया जा करने के लिए ।
    7. सुनिश्चित करें कि माउस हिंद पैर के एक चुटकी परीक्षण का उपयोग कर अप्रतिसादी है ।
  4. प्रदर्शन रेटिना इंजेक्शन
    1. बाँझ कुंद आइरिस संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए धीरे से 7 में संदंश के सुझावों रखकर ग्लोब के proptosis प्रेरित और आंख ढक्कन पर 10 बजे स्थिति जबकि एक ही समय में खुले और नीचे धक्का ।
    2. संदंश के लिए आंखों ग्लोब के नीचे पलकें मनाना इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सॉकेट से बाहर रखने के लिए उपयोग करें ।
      नोट: पशु 10 से 14 दिन पुराने अक्सर आंख से बाहर सॉकेट के बड़े पशुओं की तुलना में आसानी से पकड़ जाएगा ।
    3. corneal limbus के किनारे से नीचे 1-1.5 mm के बारे में सुई की नोक प्रत्यक्ष और ध्यान से यह कंजाक्तिवा के माध्यम से आंख में ड्राइव जब तक यह सुई श्वेतपटल के ऊतकों में प्रवेश के रूप में एक scleral अवसाद बनाता है, और आंख के हेरफेर की अनुमति देता है ।
    4. micromanipulator के साथ आंख नीचे घुमाएं RIS स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ फैली हुई पुतली के माध्यम से scleral अवसाद कल्पना ।
    5. बाँझ नेत्र जेल या 1x पंजाबियों समाधान की एक बूंद लागू करें और एक बाँझ coverslip के साथ कवर ।
    6. सुई की नोक के द्वारा बनाई गई scleral अवसाद पर ध्यान केंद्रित (2-5 µm), और इंजेक्शन साइट पर रेटिना रूपों की एक तेज चोटी तक सुई आगे ड्राइव ।
    7. श्वेतपटल के माध्यम से टिप बोर और सुई में fluorescein RPE सेल monolayer के तत्काल आसपास के क्षेत्र में रेटिना के नीचे दिखाई देता है जब तक धारक का उपयोग कर सुई घुमाएँ.
    8. सुई की नोक ड्राइव तो यह दुनिया के लिए स्पर्श है, और फिर पैर पेडल स्विच के साथ इंजेक्शन पंप सक्रिय करें ।
    9. के बाद वांछित मात्रा (0.5-1 µ एल) के लिए उप रेटिना अंतरिक्ष में वितरित किया गया है, सुई वापस लेने और जांच अगर bleb स्थिर है और द्रव इंजेक्शन साइट है, जो एक सफल इंजेक्शन का पहला मानदंड है के बाहर रिसाव नहीं करता है ।
      नोट: एक उचित टिप व्यास (2-5 µm व्यास) को बनाए रखने के इंजेक्शन साइट से रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    10. अक्टूबर इंस्ट्रूमेंट के इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर जानवर लगाएं । एक आयताकार वॉल्यूम छवि रिकॉर्ड करने के लिए HR-SD OCT इमेजिंग के लिए निर्देशों का पालन करें ।
    11. पुष्टि करें कि इंजेक्शन द्रव रेटिना अंतरिक्ष में स्थित है, और bleb की सीमा का निर्धारण करने के लिए छवियों को बचाने के ।
    12. धारक से पशु निकालें और इंजेक्शन आंखों के लिए एंटीबायोटिक मरहम की एक पर्याप्त राशि लागू होते हैं ।
    13. एक हीटिंग पैड पर जानवर प्लेस जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो, तो यह मूल पिंजरे में वापस जगह है जहां से आया था ।
      नोट: हमारे जानवरों को आमतौर पर प्रातः से पहले इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए जानवरों को मां के साथ पिंजरे में वापस जाने की जरूरत है ।
  5. अक्टूबर साधन सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर रेटिना bleb की हद तक मानचित्रण.
    1. एक आयताकार मात्रा OCT छवि प्राप्त करें, पहले वर्णित तरीकों का उपयोग कर, bleb और स्थिति यह ऐसी ONH के रूप में आंख के भीतर एक पहचानने योग्य मील का पत्थर शामिल करने के लिए ।
      नोट: रिकॉर्डिंग ९० बी स्कैन bleb मानचित्रण के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन वांछित संकल्प के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. चित्रा के लिए एक एकल कैलिपर जोड़ें और यह मोड़ बिंदु जहां रेटिना RPE और रंजित से अलग करता है पर जगह है ।
      नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से fundus छवि कैलिपर और बी स्कैन का प्रतिनिधित्व करने पर एक लाइन के लिए एक इसी बिंदु नक्शे मूल्यांकन किया जा रहा है ।
    3. कैलिपर्स की नियुक्ति के बाद स्क्रीन पर कब्जा है, और प्रभावी ढंग से इंजेक्शन साइट जो ठीक नक्शे fundus छवि पर इंजेक्शन bleb की सीमा को मैप करने के लिए छवियों को संकलित । अनुवर्ती इमेजिंग के दौरान रुचि के क्षेत्रों का पता लगाने में मदद के संदर्भ के लिए संकलित छवि को सहेजें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कैलिपर डेटा बचाया जा सकता है, अनुपालन, और केव मोटाई के 3 डी डेटा सेट की साजिश रचने के लिए एक समान विधि का उपयोग कर साजिश रची ।
  6. Intravitreal इंजेक्शन
    1. सुई के टिप प्लेस उप रेटिना इंजेक्शन के रूप में एक समान शल्य दृष्टिकोण का उपयोग कर, सिवाय इसके कि सुई पूरी तरह से श्वेतपटल के माध्यम से पार्स में प्लाना corneal limbus के पीछे के बारे में ०.२५ mm और अवलेह में संचालित है.
    2. सुई प्लेसमेंट के बाद, पैर पेडल के साथ इंजेक्शन पल्स लागू होते हैं.
      नोट: eyecup के अवलेह भर में fluorescein डाई का एक तेजी से प्रसार मनाया जाता है, प्रतिदीप्ति के साथ फैली हुई पुतली एपर्चर भरने ।

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Representative Results

उपस्थिति, दर और मॉडल बाहरी रेटिना अध की एकरूपता का आकलन
केव की माप OPL से एल्म करने के लिए दर्ज किए गए थे, साधन सॉफ्टवेयर में प्रदान कैलिपर उपकरण का उपयोग केव की सीमा को परिभाषित. लक्ष्य के लिए एक आंशिक रूप से मानवीय adRP माउस मॉडल में बाहरी रेटिना अध की प्रगति का नक्शा था । एक नियंत्रण C57BL से तुलनीय छवियां/6 (जे) माउस और एक hC1 hC1//mWT/mWT माउस मॉडल, उत्परिवर्ती मानव रॉड opsin (RHOP347S) जीन की दो प्रतियां व्यक्त, दोनों नियंत्रण रेटिना निष्कर्षों और एक गंभीर के उन प्रदर्शन दिखाया गया है और तेजी से प्रगतिशील रेटिना अपक्षयी हालत । 3 सप्ताह पुराने adRP (hC1 x बीएल/6 (जे)) पशु, उत्परिवर्ती मानव RHOP347S जीन की केवल एक ही प्रति और माउस WT RHO जीन की दो प्रतियां, सामांय केव मोटाई के पास था । हालांकि, अनुवर्ती HR-SD-OCT स्कैन 10 और ३७ सप्ताह में अस्थाई रूप से प्रगतिशील और स्थानिक वर्दी रेटिना अध कि लगभग ६०% इस समय सीमा पर thinning केव के रूप में मांयता प्राप्त photoreceptors के नुकसान के परिणामस्वरूप प्रदर्शन किया । hC1 x बीएल/6 (जे) adRP मॉडल में, रेटिना अध... 13 सप्ताह के एक अनुमानित समय लगातार (1/ Homozygous hC1 जानवरों, माउस WT RHO पृष्ठभूमि पर विषाक्त उत्परिवर्ती मानव transgene की दो खुराक के साथ, एक बहुत अधिक तेजी से अध: पतन व्यापक रेटिना thinning द्वारा प्रदर्शन किया और सभी photoreceptors की अनिवार्य रूप से पूर्ण नुकसान के रूप में 3 से पीड़ित उंर के सप्ताह (चित्रा 2) ।

केव उपाय photoreceptor जीवन शक्ति के एक सूचकांक के रूप में बाहरी रेटिना के सामान्य होने का केवल एक घटक है । OSL photoreceptors और भीतरी खंड/बाहरी खंड (है/ओएस) लाइन या ellipsoid लाइन दोनों photoreceptor जीवन शक्ति और समारोह के समर्थन में सबूत प्रदान करते हैं । जानवरों में तुलना जो या तो एक (N129R-x 129R-) या दो (2HRho 1T1T) मानव WT RHO जीन की प्रतियां (खुराक) को शामिल करने के लिए पैदा किया गया है माउस WT पर RHO नॉकआउट पृष्ठभूमि बाहरी रेटिना मोटाई के लिए मापा गया । केव में ~ 8 µm की एक सांख्यिकीय उल्लेखनीय वृद्धि मानव जीन की केवल एक प्रतिलिपि के साथ चूहों की तुलना में मानव WT RHO जीन की दो प्रतियां के साथ चूहों में मनाया गया. OSL में ~ 5 µm के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि चूहे WT RHO नॉकआउट पृष्ठभूमि पर मानव WT RHO जीन की एक प्रतिलिपि बनाम दो के साथ चूहों में मनाया गया । कैसे केव और OSL माप किए गए का एक उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है । मानव संसाधन-एसडी-अक्टूबर प्रणाली के साथ कब्जा कर लिया छवियों के उच्च संकल्प केव या OSL मानवीय WT RHO माउस मॉडल में ठोस सांख्यिकीय विश्वसनीयता के साथ छोटे मतभेदों के भेदभाव की अनुमति सटीक माप की अनुमति देते हैं ।

सर्जिकल परिणामों की रेंज अक्टूबर तक विस्तृत जब उपरेटिना इंजेक्शन का प्रयास
एचआर-एसडी-अक्टूबर का प्रयास किया उप रेटिना इंजेक्शन का मूल्यांकन परिणाम की एक किस्म उपज । पहले, सबसे आम अनुभव पुष्टि की थी कि इंजेक्शन द्रव सफलतापूर्वक उप रेटिना अंतरिक्ष के भीतर दिया गया था । अंतर्निहित रेटिना अंतरिक्ष के उद्घाटन (जो विकास के दौरान बंद कर देता है) एक bleb है कि स्पष्ट रूप से दोनों मानव संसाधन-एसडी अक्टूबर और बी स्कैन छवियों में एन चेहरा देखने में visualized हो सकता है बनाया । hypo-चिंतनशील द्रव तंत्रिका रेटिना ऊपर से सीमा थी, और हाइपर-चिंतनशील RPE सेल परत अभी भी बीएम के लिए विरोध किया, नीचे (4 चित्रा) । यदि पशु HR-SD-OCT द्वारा तुरंत इंजेक्शन के बाद छवि थी (नीचे देखें)-रेटिना इंजेक्शन की सीमा निर्धारित किया जा सकता है । दूसरा, इंजेक्शन धमनियां अंतरिक्ष में (बीएम के नीचे) के बजाय उपरेटिना अंतरिक्ष में हो सकता है । यह एक हाइपर-चिंतनशील परत (RPE) के परिणामस्वरूप तरल पदार्थ-रेटिना के विस्थापित क्षेत्र के गुंबद, और कोई हाइपर-अक्टूबर बी में आंख के पीछे सीमा पर भावना-स्कैन करता है ।. तीसरे, एक और संभावित परिणाम है कि हो सकता है जबकि रेटिना इंजेक्शन के प्रयास में तंत्रिका फाइबर परत पर एक रेटिना schisis (बंटवारे) था. यह परिणाम एक सामांय बाहरी रेटिना एनाटॉमी उपज है, लेकिन रेटिना की भीतरी परत bleb, जो या हो सकता है अवलेह पर हमला नहीं किया है encapsulated । सिद्धांत रूप में, इस तरह के एक schisis पैटर्न इंजेक्शन के साथ कहीं भी तंत्रिका रेटिना के टुकड़े के भीतर उचित हो सकता है, लेकिन हम सिर्फ तारीख को तंत्रिका फाइबर परत schisis देखा है. चौथा, एक intravitreal इंजेक्शन भी हो सकता है, जो OCT पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है । इन विफलताओं कांच सुई, या शायद इंजेक्शन के दौरान सुई के कुछ छोटे गति, स्विच प्रवाह इंजेक्शन डिवाइस के दबाव सिर के कारण की नोक के प्रारंभिक विस्थापन से परिणाम के सभी ।

निस्र्पक इंजेक्शन का स्थान
की प्रभावकारिता या उंमीदवार के उपचार की विषाक्तता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है रेटिना क्षेत्रों है कि वेक्टर प्राप्त किया है उन है कि नहीं है बनाम तुलना करने की क्षमता है । हम एक के क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए एक साधन विकसित करने में महत्वपूर्ण प्रयासों का निर्देशन रेटिना इंजेक्शन में शामिल है ताकि अनुवर्ती परीक्षाओं के दौरान, हम रेटिना की आरईएल सीमा की पहचान सकता है जहां चिकित्सा लागू किया गया है, और इसलिए जहां transduction साध्य था । गोल्ड एनपीएस रेटिना जो थे या इंजेक्शन नहीं थे के क्षेत्रों की पहचान करने में विश्वास के एक उच्च स्तर की अनुमति दी । हालांकि, विशिष्ट कणों या उनके निर्माण विषाक्त होना दिखाई दिया और 24 घंटे पोस्ट इंजेक्शन (डेटा नहीं दिखाया गया है) द्वारा उपरेटिना इंजेक्शन की साइट पर एक गंभीर स्थानीयकृत रेटिना अध... इसलिए, हमने इंजेक्शन साइट को सीधे एचआर-SD-OCT इमेजिंग डेटा से मैप करने का वैकल्पिक तरीका विकसित किया है । ठीक इंजेक्शन साइट सीमाओं की पहचान के लिए एक विधि साधन (चित्रा 5) के सॉफ्टवेयर पैकेज में माप उपकरण (कैलिपर्स) का उपयोग कर विकसित किया गया था. हम bleb के किनारे ठीक व्यक्तिगत बी-स्कैन (अवर से बेहतर रेटिना) fundus छवि बनाने के लिए इस्तेमाल की जांच करके पहचान सकता है । जब बिंदु पर एक कैलिपर रखकर जहां bleb संलग्न रेटिना, कैलिपर की स्थिति स्वचालित रूप से इसी बी पर मैप किया गया है एन चेहरा fundus छवि के एक्स-अक्ष के साथ सटीक स्थिति में जहां कैलिपर था स्कैन... बी-स्कैन पर रखा गया है । इस प्रक्रिया को दोहराने एक एन चेहरा fundus छवि पर bleb के किनारे का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । संरेखण प्रक्रिया की आवश्यकता है कि रेटिना के समान क्षेत्रों हर बार, लगातार ऑप्टिक तंत्रिका सिर के सापेक्ष imaged रहे हैं, और छवियों को एकाधिक छवियों से डेटा अलगाव से पहले रेटिना रक्त वाहिकाओं संरेखित करने के लिए घुमाया जा करने के लिए की आवश्यकता हो सकती है । पोस्ट इंजेक्शन छवि और अनुवर्ती अनुवर्ती छवियों के संरेखण प्रक्रिया के बाद, इंजेक्शन क्षेत्र रेटिना टुकड़ी में शामिल क्षेत्र के भीतर माप की स्थिति की पहचान करने के लिए डेटा बिंदु ग्रिड पर आरोपित था. इस डेटा को सतह मानचित्र के रूप में प्लॉट किया जा सकता है, जो इंजेक्शन साइट के बाहर के क्षेत्रों के सापेक्ष इंजेक्शन साइट की समावेशी डेटा बिंदुओं की पहचान करने के लिए एक विज़ुअल टूल प्रदान करते हैं.

3 डी में केव मोटाई मानचित्रण
अंत में, हम केव, OSL, या रेटिना की पूरी imaged क्षेत्र भर से अन्य रेटिना परतों के माप रिकॉर्ड, और फिर एक सतह भूखंड का उपयोग कर डेटा प्लॉट (चित्रा 5). Superimposing इंजेक्शन साइट के बॉर्डर मैप इंजेक्शन की प्रक्रिया के दौरान अलग नहीं किया गया था, जो इंजेक्शन क्षेत्र और क्षेत्र सहित दो डेटा सेट के पृथक्करण की अनुमति देता है । इसके अलावा प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण तो इन दो डेटा सेट पर किया जा सकता है कि विशिष्ट चिकित्सकीय एजेंटों रेटिना अध कि बचाव कर सकते हैं या विषाक्तता प्रेरित परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए । इस दृष्टिकोण संभावित प्रयोगात्मक और नियंत्रण डेटा के लिए अनुमति देता है एक ही आंख से एकत्र की, इंजेक्शन की तुलना बनाम गैर एक ही आंख के क्षेत्रों इंजेक्शन ।

Figure 1
चित्रा 1 : UHR-SD-OCT डिवाइस । एचआर-एसडी-OCT डिवाइस का इस्तेमाल दिखाया गया है । इंस्ट्रूमेंट रैक (a) में कंप्यूटर मॉनीटर (a), कुंजीपटल और माउस (b), जांच इंटरफ़ेस बॉक्स (c), OCT इंजन (d), कंप्यूटर (e), सुपर luminescent के लिए नियंत्रण उपकरण उत्सर्जक डायोड (अवरक्त) (f), और अनटेरिप्टेबल विद्युत आपूर्ति (g). ऑप्टिकल पीठ (ख) इमेजिंग जांच ऑप्टिकल हेड (माउस रेटिना के लिए) (एच), बहु धुरी (रैखिक और रोटेशन) जोड़तोड़ (मैं), और एक माउस विषय (जंमू) शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : HR-SD-OCT द्वारा मापी के रूप में आंशिक रूप से मानवतावादी adRP मॉडल में प्रगतिशील बाहरी रेटिना अध... (क) मानव संसाधन-एसडी-अक्टूबर रेटिना के चित्र adRP मॉडल (hC1 एक्स बीएल/6 (जे)) के लिए विभिंन युगों में प्राप्त किया गया, C57BL/6 (जंमू) 14 सप्ताह में नियंत्रण, और homozygous hC1 उत्परिवर्ती लाइन पर 3 सप्ताह । बाहरी रेटिना adRP मॉडल में 3 सप्ताह में एक सामांय रूप था, लेकिन प्रगतिशील केव thinning और विऔर उंर के 10 सप्ताह से परे में विस्तर के सबूत था । ३७ सप्ताह तक, (hC1 x बीएल/6 (जे)) व्यापक बाहरी रेटिना अध... सभी अक्तूबर स्कैन ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास के क्षेत्र में थे । (ख) केव मोटाई (मिमी में) ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से क्षैतिज अक्ष के साथ नियंत्रण (C57BL/6 (जे)), hC1, और अलग उंर के adRP पशुओं के लिए साजिश रची थी । आंशिक रूप से मानव adRP मॉडल में केव मोटाई के प्रगतिशील नुकसान था । केव हानि ६०% से अधिक उंर के ३७ सप्ताह के द्वारा किया गया । त्रुटि पट्टियां = माध्य का मानक त्रुटि । लाल स्केल बार = २०० µm और सभी छवियों को एक ही पैमाने रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : बाहरी परमाणु परत और बाहरी खंड लंबाई के मात्रात्मक उपाय HR-SD-OCT का उपयोग कर । (A) माउस लाइनों केव और OSL उपायों को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया । प्रतिनिधि 2HRho1T से अक्टूबर छवियां/1T (2 खुराक HRho) पर माउस RHO नॉकआउट पृष्ठभूमि) (बाएँ पैनल) और N129R-x 129R-(एक खुराक मानव RHO पर माउस RHO नॉकआउट पृष्ठभूमि) (दाएँ पैनल). (ख) कैसे कैलिपर्स को मापने के लिए रखा गया केव (लाल) और OSL (नीला) का एक उदाहरण दिखाया गया है. (ग) केव मोटाई के लिए प्रत्येक पंक्ति के तीन पशुओं से प्राप्त डेटा 2HRho1T/1T लाइन और N129R-x 129R-(बाएं पैनल) की तुलना दिखाते हुए बार ग्राफ स्वरूप में रची गई थी । 2HRho1T/1T लाइन है ~ 8 µm मोटा केव । OSL में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए, एकाधिक माप (सात) एक बी से बनाया गया था-एल्म से प्रत्येक माउस लाइन से बी के रूप में बीएम के लिए स्कैन 9 में (नीली लाइन) सप्ताह पुराने जानवरों (सही पैनल) । इस HRho जीन की 2 प्रतियां बनाम 1 के साथ पशुओं के बीच OSL में ~ 5 µm अंतर का प्रदर्शन किया । दोनों केव और OSL उपायों सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे, केव पी मूल्य = 1.7 ई-5 और OSL पी-मूल्य = 6.4 ई-5 । त्रुटि पट्टियां = माध्य का मानक त्रुटि । लाल स्केल बार = १०० µm दोनों बी 3 ए में स्कैन एक ही पैमाने पर है, ख. ज रेटिना परतों की स्पष्टता में सुधार करने के लिए और कैसे माप का अधिग्रहण किया गया एक गुणात्मक प्रदर्शन प्रदान करने के लिए बढ़ी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : HR-SD-OCT द्वारा पहचाने गए चूहों में intraocular इंजेक्शन के प्रकार (a). a (hC1xBL/6 (J)) माउस Inferonasal transcleral transchoroidal इंजेक्शन के माध्यम से द्रव के ~ 1 µ l के साथ इंजेक्ट किया गया था । परिणामस्वरूप रेटिना टुकड़ी एन चेहरा छवि के हरे निचले अधिकार क्षेत्र के रूप में देखा जाता है, छवि के दाईं ओर bleb के अग्रणी किनारे पर एक तेज सीमा बनाने. एक इंजेक्शन साइट के OCT fundus छवि केवल तरल पदार्थ भरा गुहा की स्थिति के आधार पर सूक्ष्म मतभेदों को दर्शाती है, क्योंकि छवि सभी बी के एक संकलन है पूरे रेटिना मोटाई से स्कैन । इसके अलावा, इंजेक्शन bleb अक्टूबर बुद्धि से रेटिना की सतह की दूरी में परिवर्तन, इंजेक्शन साइट पर एक infocus क्षेत्र का निर्माण. (ख) एक गैर इंजेक्शन रेटिना के अक्टूबर बी स्कैन का प्रदर्शन किया है । ONH लेबल है । (ग) एक रेटिना इंजेक्शन का प्रदर्शन किया है. ONH लेबल है, और एन चेहरा छवि (सही पैनलों) में तीर टुकड़ी के पीछे सीमा दिखाओ । (घ) एक धमनियां इंजेक्शन (तीर) रेटिना की निचली सीमा के RPE परत (हाइपर-चिंतनशील वक्र) के एक स्पष्ट उन्नयन (ऊपर विस्थापन) के साथ प्रदर्शन किया है और RPE और रंजित परतों के नीचे हाइपर-भावना की महत्वपूर्ण हानि तरल इंजेक्शन । छवियों (सी बनाम डी) में तीर की तुलना करें । (ङ) एक रेटिना schisis तंत्रिका फाइबर परत के पास प्रदर्शन किया है । बहुत पतली हाइपर-चिंतनशील झिल्ली encapsulating द्रव का निरीक्षण, जबकि रेटिना RPE से जुड़ा रहता है. तीन विभिंन टुकड़ियों के बीच सूक्ष्म अंतर भी en चेहरा छवियों में visualized किया जा सकता है (सी, डी, और ई) । उपरेटिना टुकड़ी एक सीमा है जो ( सीमें तीर) कल्पना करने के लिए मुश्किल है, जबकि धमनियां इंजेक्शन bleb के अग्रणी किनारे पर एक धुंधला हाइपर चिंतनशील रिम बनाता है, और रेटिना schisis के तेज सीमांकन द्वारा स्पष्ट है अग्रणी धार (ङ) । दोनों लाल स्केल सलाखों = २०० µm 4B में । 4E के माध्यम से 4B सभी छवियों को समान रूप से स्केल कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : मानचित्रण और बाहरी रेटिना बढ़ाता है निंनलिखित रेटिना इंजेक्शन के बाद बदलता है । एक विधि का पालन के दौरान ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था कि चूहों की परीक्षा-रेटिना इंजेक्शन के साथ 3 डी-कई अक्टूबर बी स्कैन से केव माप की साजिश रचने. एक 2HRho1T/1T पशु एक आत्म पूरक adeno-जुड़े वायरस दोनों GFP और नेतृत्व उंमीदवार हथौड़ा ribozyme (scAAV-GFP ad6 hhRz ७२५) (ओएस आंख) एक विषाक्तता स्क्रीन में व्यक्त के साथ इंजेक्शन था । (क) इमेज्ड के तुरंत बाद, इंजेक्शन की आरईएल सीमा को उस बिंदु पर bleb के अग्रणी किनारे पर कैलिपर्स रखकर मैप किया गया था जहाँ बाहरी सेगमेंट बी-स्कैन में RPE से अलग होते हैं (बाएँ पैनल (red कैलिपर)). कैलिपर उपकरण की स्थिति स्वचालित रूप से fundus छवि के लिए मैप किया गया है, और यह दोहराया है और के रूप में कई बी के लिए संकलित-स्कैन के रूप में आवश्यक है, जो वांछित संकल्प पर निर्भर करता है (हर 5वें स्कैन (एक) (सही पैनल)) । बाद में अक्टूबर अध्ययन (हर 2 सप्ताह) रेटिना की एक ही क्षेत्र superimposition अनुमति देने के लिए imaged; ONH और रेटिना रक्त वाहिकाओं काटीज़ियनवादी या रोटेशन समायोजन की सुविधा के लिए स्थलों रहे हैं । रेटिना के पूरे क्षेत्र केव मोटाई के लिए मापा गया था प्रदान की आवश्यक सीमाएं (OPL और एल्म) दिखाई दे रहे थे. (ख) कैलिपर पदों (रंग कोडित) फिर से fundus छवि पर मैप और एक समग्र छवि में संकलित कर रहे हैं इंजेक्शन सतह पर केव लंबाई नक्शा करने के लिए । हर 5वें बी-अक्टूबर छवियों से स्कैन कैलिपर्स में निर्मित के साथ मापा गया था रेटिना भर में दस अंक । (ग) पूर्व और बाद संकलित छवियों घुमाया जाता है, इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए रेटिना vasculature, जो अलग रेटिना क्षेत्र के भीतर डेटा बिंदुओं की अनुमति देता है रेटिना छवि ओवरले और अलग से पहचाना जा करने के लिए संरेखित करें । (घ) डेटा सेट एक तालिका स्वरूप, fundus छवि सरणी के समान में मैप किया गया है, और दो समूहों में विभाजित (bleb के भीतर माप (लाल हाइलाइट्स) और उन है कि नहीं कर रहे हैं) । (ङ) डेटा एक 3d सतह साजिश रचने सुविधा का उपयोग कर प्रस्तुत किया जाता है, जो केव मोटाई के दृश्य की अनुमति देता है पूरे imaged क्षेत्र पर । यह इंजेक्शन और आंख के गैर इंजेक्शन क्षेत्रों के बीच मात्रात्मक मतभेदों के आकलन की अनुमति देता है । 3d प्लॉट (E) में दरार इस क्षेत्र से अलग रेटिना के क्षेत्र के भीतर केव माप के डेटा सेट को अलग करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है जो कि तुरंत निम्नलिखित इंजेक्शन संलग्न रह गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: कार्यक्रम के लिए गिलास सुई खींचने के लिए इस्तेमाल किया । कार्यक्रम पैरामीटर ट्रांस-scleral, transchoroidal दृष्टिकोण द्वारा उपरेटिना के लिए उपयोगी गिलास सुई प्राप्त करने के लिए ।

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Discussion

HR-SD-OCT संभावित चिकित्सीय परीक्षण में उनकी उपयोगिता निर्धारित करने के लिए मानव रोग के संभावित पशु मॉडलों के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है । क्षमता को जल्दी और मज़बूती से मानव रोग के एक संभावित पशु मॉडल की विशेषता चिकित्सकीय दवा की खोज की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे, प्रतिस्थापन जीन थेरेपी, ribozyme या shRNA पछाड़ना जीन थेरेपी, संयुक्त जीन थेरेपी) । HR-SD-OCT एक सरल, जल्दी प्रदान करता है, और गैर इनवेसिव विधि रेटिना स्वास्थ्य कि विशेषताएं और लगभग किसी भी माउस मॉडल में रेटिना अध की प्रगति की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का मूल्यांकन करने के लिए. अक्टूबर छवियों के लिए किसी भी या सभी रेटिना, जो एक बाहरी रेटिना (photoreceptor) समय या अध: पतन पर उपचारात्मक बचाव के प्रयास के प्रभाव के एक विस्तृत मूल्यांकन प्रदान कर सकते है के विभिंन परतों के सभी माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सीमा या काइनेटिक समयरेखा । HR-SD-OCT भी दिया वेक्टर या सामग्री की विषाक्तता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक photoreceptor रेटिना अध कि अनुसंधान कार्यक्रम पर सबसे महत्वपूर्ण प्रभाव रहते पशुओं में समय के साथ केव के परिष्कृत माप बनाने की क्षमता है । एक एक बार लगातार निकालने के लिए एक रेटिना अध कि समय रेखा साजिश कर सकते हैं, जो चिकित्सकीय अवसर का एक लौकिक खिड़की पर एक ही मॉडल में उंमीदवार चिकित्सीय चिकित्सा की प्रभावकारिता और विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है । इस तकनीक को भी एक अध्ययन में प्रवेश करने और पशुओं को नष्ट करने से पहले शोधकर्ता पशु पलटन में विषमताओं की पहचान करने की अनुमति देकर शास्त्रीय समापन बिंदु प्रोटोकॉल के सापेक्ष बहुमूल्य संसाधनों (जानवरों और समय) की महत्वपूर्ण बचत के लिए अनुमति देता है कि प्रयोगात्मक मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं (उदाहरणके लिए, सफल उपरेटिना वितरण).

माउस आंख की रेटिना अंतरिक्ष में कुछ चिकित्सकीय के सटीक वितरण के लिए की जरूरत है, चुनौतीपूर्ण है और मानव संसाधन-एसडी OCT में पशुओं के चल रहे शामिल किए जाने के लिए एक कसौटी के रूप में सफल उप रेटिना इंजेक्शन की एक सटीक दृश्य पुष्टि प्रदान करता है पूर्व नैदानिक अध्ययन डिजाइन । व्यापक प्रयास अक्सर समय पर जीन थेरेपी अध्ययन में इंजेक्शन जानवरों का पालन करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि इन मॉडलों अक्सर मानव रेटिना अपक्षयी रोगों अनुकरण जहां रोग समयरेखा दशकों से उभरने । कई अनुवर्ती परीक्षाओं चिकित्सकीय प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए या विषाक्तता का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं. इस महत्वपूर्ण चुनौती के लिए एक समाधान के लिए पहचान करने और अध्ययन डिजाइन, जो उपचारात्मक वेक्टर के वितरण के लिए शल्य चिकित्सा विफलताओं से पशुओं को दूर करने की क्षमता है । अनुभव के वर्षों के साथ एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित तकनीशियन के लिए एक सफल इंजेक्शन देने की क्षमता ९०% से संपर्क किया है अगर पशु प्रति एक आंख इंजेक्शन, और लगभग ८०% सफलता अगर दोनों आंखों इंजेक्शन । इस दक्षता स्तर के साथ, असफल इंजेक्शन के साथ पशुओं के अध्ययन डिजाइन से हटाने परिकल्पना परीक्षण करने के लिए लाभप्रद है । यह न केवल महत्वपूर्ण समय बचाता है, लेकिन यह भी अधिक सुसंगत और पूर्वानुमानित परिणामों के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, मानव संसाधन-एसडी OCT एक ही जानवरों को समय पर पीछा किया जा करने की अनुमति देकर किसी भी एक प्रयोग के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी करने के लिए अनुमति देता है, जो दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों में पशु करने के लिए पशु परिवर्तनशीलता कम हो जाती है, और अनुमति देता है और अधिक संभावित प्रभावकारिता और उंमीदवार चिकित्सीय चिकित्सा की विषाक्तता के बारे में परिकल्पना के मजबूत सांख्यिकीय मूल्यांकन ।

रेटिना कवरेज की हद तक एक उपरेटिना इंजेक्शन द्वारा आम तौर पर नहीं है १००%, जो खुद विषाक्त हो सकता है31,३२,३३,३४. इसलिए, transduced और गैर transduced क्षेत्रों के बीच अंतर करने की क्षमता एक दिया उंमीदवार चिकित्सीय के लिए बचाव और विषाक्तता की परिकल्पना का उचित परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है । उपलब्ध सॉफ्टवेयर उपकरणों के रचनात्मक उपयोग माउस आंख में रेटिना इंजेक्शन की सटीक मानचित्रण के लिए अनुमति देता है । इंजेक्शन आंख की तत्काल इमेजिंग के हित के क्षेत्रों के लिए अनुवर्ती इमेजिंग के लिए दिशा प्रदान करता है, और क्षेत्रों है जो एक ही दुनिया में इलाज नहीं किया गया है जो क्षेत्रों के लिए transduced किया गया है की तुलना करने की क्षमता । मानचित्रण परिशुद्धता वांछित पर निर्भर करता है, इस प्रक्रिया के प्रत्येक बी के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है-स्कैन या बी के पहनावा से समय पर नमूना-स्कैन तुरंत पोस्ट इंजेक्शन एकत्र और एक एकल छवि में सभी fundus छवियों संकलन ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग तो कि खण्डशः निरंतर सीमा सावधानीपूर्वक fundus छवि पर मैप किया गया है । इंजेक्शन के बाद छवियों का पालन करने के लिए तुरंत से छवियों की तुलना की आवश्यकता है कि छवियों गठबंधन किया जा सकता है ताकि माप की स्थिति fundus छवि पर मैप किया जा कर सकते हैं, और डेटा बिंदुओं इंजेक्शन साइट और गैर-इंजेक्शन क्षेत्रों में अलग किया जा सकता रेटिना. ऑप्टिक तंत्रिका सिर और रेटिना रक्त वाहिकाओं का मानचित्रण भी इस एक ही पद्धति है, जो आंख के उंमुखीकरण में एड्स जब बाद अनुवर्ती छवियों के साथ बाद इंजेक्शन छवियों को संरेखित करने का प्रयास का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । इस जानकारी के बाद इमेजिंग में इस्तेमाल किया जा सकता रेटिना के क्षेत्र की पहचान जहां इंजेक्शन हुआ था । बेशक, जब जानवरों euthanized रहे हैं, EGFP अभिव्यक्ति के स्थान, एक AAV वेक्टर द्वारा दिया भी एक उंमीदवार चिकित्सीय जीन युक्त (जैसे, ribozyme), भी द्वारा निर्धारित क्षेत्र के साथ transduction के स्थान की तुलना किया जा सकता है छवि मानचित्रण कि रक्त वाहिकाओं के स्थान पर निर्भर करता है । यह शारीरिक टुकड़ी के क्षेत्रों से परे बाद में बंद कर रेटिना अंतरिक्ष में वेक्टर के प्रसार की पहचान की अनुमति देगा ।

गोल्ड एनपीएस के उपयोग के साथ हमारी सफलता के लिए उपरेटिना bleb लेबल इस्तेमाल सामग्री द्वारा प्रेरित विषाक्तता के कारण सीमित था । हम इस तरह की सामग्री के आगे की जांच को प्रोत्साहित करने के लिए blebs रेटिना की हद तक लेबल, अगर वैकल्पिक तैयारी (आयाम बदलती, सतह संशोधनों) पाया जा सकता है कि विषाक्तता प्रेरित नहीं कर सकते हैं ।

HR-SD-OCT काफी कम समय और संसाधनों के साथ जानकारी का एक विशाल राशि प्रदान करता है, और प्रोटोकॉल की तरह पारंपरिक तरीकों की तुलना में संभावित चिकित्सकीय प्रभावकारिता और विषाक्तता के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए quantitated जा सकता है । इस तकनीक का उपयोग शोधकर्ता नैदानिक रेटिना दवा डिस्कवरी३५में गंभीर अड़चनों में से एक को कम करने के लिए सक्षम बनाता है । माउस RIS और HR-SD-OCT हमारे आरएनए ड्रग डिस्कवरी प्रोग्राम के एक घटक के रूप में नैदानिक रेटिना जीन थेरेपी अध्ययन सहायता करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं । इन उपकरणों को मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

व्यावसायिक संबंध: म्क्ब: कोई नहीं; JMS: कोई नहीं । रेटिना इमेजिंग सिस्टम (RIS)23 इस अध्ययन में उपयोग चूहों, कुतर, या छोटे जानवरों में जीन थेरेपी डिलीवरी अध्ययन संचालित करने की मांग किसी भी समूह के लिए पर्याप्त उपयोग की एक उपंयास डिवाइस है । जबकि लेखकों कोई संघर्ष इस समय इस उपकरण के संबंध में घोषणा की है, भैंस पर विश्वविद्यालय-SUNY और दिग्गजों प्रशासन बौद्धिक संपदा में अधिकार है और भविष्य में इस उपकरण के व्यावसायीकरण की तलाश कर सकते हैं ।

Acknowledgments

इस सामग्री का समर्थन काम पर आधारित है, भाग में, दिग्गजों मामलों के विभाग (va), दिग्गजों स्वास्थ्य प्रशासन, अनुसंधान और विकास के कार्यालय (जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास) (VA मेरिट ग्रांट 1I01BX000669) द्वारा । JMS, भाग में कार्यरत है, स्टाफ चिकित्सक के रूप में-वैज्ञानिक, नेत्र विज्ञान, VA WNY द्वारा; म्क्ब भाग में कार्यरत है, VA WNY द्वारा । अध्ययन में आयोजित किया गया था, और द्वारा भाग में समर्थित, दिग्गजों प्रशासन पश्चिमी ंयूयॉर्क हेल्थकेयर सिस्टम (भैंस, NY) । सामग्री के दिग्गजों मामलों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते । इसके अलावा, प्रमुख भाग में, NIH/नेि R01 अनुदान EY013433 (PI: JMS), NIH/नेि R24 अनुदान EY016662 (यूबी विजन इंफ्रास्ट्रक्चर सेंटर, PI: एम वध, निदेशक-Biophotonics मॉड्यूल: JMS), एक अप्रतिबंधित अनुदान पर नेत्र विज्ञान विभाग/ अनुसंधान से भैंस अंधापन को रोकने के लिए (ंयूयॉर्क, ny), और Oishei फाउंडेशन (भैंस, ny) से अनुदान । हम hC1 ट्रांसजेनिक RHOP347S लाइन और एक्सॉन 1 माउस डॉ RHO डाडा से नॉकआउट एलईएम ( गुच्छा ंयू इंग्लैंड मेडिकल सेंटर, बोस्टन, एमए) के उपहार स्वीकार करते हैं, और NHR राज्य में transgene-E heterozygous मॉडल के उपहार पर माउस एक्सॉन 2 डीआरएस से RHO नॉकआउट पृष्ठभूमि. जी. जेन Farrar और पीटर Humphries (ट्रिनिटी कॉलेज, डबलिन, गुस्सा) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL6 (J) Jackson Laboratories 664
N129R- N/A N/A
2HRho 1T/1T N/A N/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) Bioptigen 90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS) In-house N/A
Stemi 2000C Microscope Zeiss 000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument Co p-97
MMN-33 micro manipulator  Narishige USA MMN-33
PLI-100  micro injector Harvard Apparatus 64-1736
Micropipette Holder (Rotating) In-house N/A
Micropipette Storage Receptacle World Precision Instruments Inc. E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm,  Harvard Apparatus 30-0053
2,2,2-Tribromoethanol SIGMA Aldrich T48402-25G
Tert-amyl Alcohol SIGMA Aldrich 240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% Akorn Inc. NDC 17478-215-05
Goniovisc BioVision Limited NDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2% Akorn Inc. NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% Perigo NDC 45802-046-35
Systane Ultra Alcon Laboratories, Inc. 9006619-1013
Tetracaine Hydrochloride Bausch and Lomb NDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5% Bausch and Lomb NDC 24208-920-64
DPBS Gibco Life Technologies 14190-136
Virus Preparations ViGene /UNC N/A
Gold nanorods NANOPARTz D12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% Akorn Inc. NDC 17478-250-20
Coverslips Fisher Scientific 12-548-A
Forceps Milton 18-825
Needles 30 guage Beckton Dickenson   W11604
Syringes Beckton Dickenson   309659
Bioptigen software Package Bioptigen N/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% Akorn Inc. NDC 17478-263-12
Windows Excel Microsoft N/A
Adobe Illustrator Adobe 
Scale Mettler
Scissors World Precision Instruments
Ear punch Nat’l band
CL 100 Light source Welch Allyn CL100
Nitrogen Gas Jackson Welding Supply N/A
Heated Water bath Neslab RTE-140
Heating plate In House N/A
Heating mat Cincinnatti Sub Zero 273
Clay mouse holder Plast.i.clay American Art Clay Co. N/A
Betadine MedLine  NDC53329-938-06
Cotton Tip Applicators American Health Service Ctag
EtOH 70% Fisher Scientific BP2818-100
Gloves Nitrile VWR 89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrument Diagnosys Inc. D125
Contact lenses In-house N/A
Diagnosys Software Diagnosys Inc. N/A
Origin 6.1 software OriginLab Corp. N/A
Reference electrodes Ocuscience F-Thread Electrode (DTL) 24”

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References

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